物性面からみた抗体医薬品

(1)

物性面からみた抗体医薬品

The 2nd Malvern Biosciece Conference

川崎匡史

製薬技術本部物性研究所分析第４研究室（NMTF）アステラス製薬株式会社

(2)

医薬品開発の流れ

2

医薬品の研究開発は上市されるまでおおよそ10~20年

(3)

Lipinski's Rule of Five

3

● 水素結合ドナー（すなわち、OHとNH）が5個以下

● 水素結合アクセプター（すなわち、NとOなど）が10個以下

● 分配係数がLogPとして5以下

● 分子量が500 Da以下

経口バイオアベイラビリティー（経口投与された薬物が体内に吸収される程度）

の優れた薬物を予測するための経験則

(4)

開発抗体の選択

4 免疫開発抗体キメラ抗体ヒト抗体 Fc swapping （ヒト化） Antibody engineering 抗体産生ハイブリドーママウス大量発現細胞株構築

(5)

抗体の物性評価

5 結合活性エピトープマッピング糖鎖ヘテロジェネイティー FcgRs 結合能 C1q 結合能 FcRn 結合能異性体メチオニン酸化アスパラギン脱アミド N末端ピログルタミン酸 C末端リシン欠損構造構造安定性一次配列ジスルフィド結合溶解性分解凝集性等電点 ADCC、ADCP、CDCに関与 PKに関与 ITC ITC HPLC LC/MS DSC LC/MS ITC ITC ITC PAGE HPLC DLS LC/MS LC/MS LC/MS LC/MS その他 その他 LC/MS NMR HPLC LC/MS DSC Biacore Biacore 吸光度 その他 PAGE その他 その他 DLS その他 CH2 CH3 Fab VH CH1 VL CL Antigen binding site FcgRs binding site ProteinA binding site

(6)

開発抗体の選択

6

Potential of a drug candidate to become a successful commercial drug product - Efficacy

- Safty

- Manufacturability - Cost

Goals of Developability studies

- Understand the physical and chemical properties of a small number of final viable candidates obtained from a much larger number of triaged preliminary candidates that have been generated against an immunogen - Select the best molecule for clinical development and commercialization

based on the propertied of the leading viable candidates - Identify development risk early

(7)

開発抗体の選択

7

Stability（安定性）

Important for manufacturability and shelf life

Solubility（溶解性）

Important for product formulation and product quality

Viscosity（粘度）

(8)

検討に用いた市販抗体医薬品

8

mAb 12 Fab chimera liquid IV 7.2 2

mAb 15 IgG1 humanized lyophilized IV 6.0 21 mAb 17 IgG1 chimera lyophilized IV 7.2 10 mAb 10 IgG1 chimera lyophilized IV 5.9 4 mAb 11 IgG1 humanized lyophilized IM 6.0 100 mAb 06 IgG1 humanized liquid IV 6.8-7.4 30 mAb 05 IgG1 chimera liquid IV 7.2-7.4 5

mAb 09 IgG1 human liquid SC 5.2 50

mAb 13 IgG1 humanized liquid SC 5.9 125 mAb 01 IgG1 humanized liquid IV 6.2 25 mAb 03 IgG4 humanized liquid IV 6.1 20

mAb 04 IgG2 human liquid IV 5.7 20

mAb 16 IgG1 human liquid SC 5.7-6.3 90

mAb 08 IgG2 human liquid SC 5.2 60

mAb 02 IgG1 human lyophilized IV 6.5 80

Administration

route pH

Conc. (mg/mL) Antibody

(9)

検討に用いた市販抗体医薬品

9

サブクラス

IgG1 : 13, IgG2 : 2, IgG4 : 1, Fab : 1

タイプ

キメラ : 4, ヒト化 : 6, ヒト : 7

剤形

液剤 : 12, 凍結乾燥 : 5

投与経路

静注 : 11, 皮下注 : 4, 筋注 : 1

抗体濃度

2 ~ 125 mg/mL

(10)

構造安定性

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 Tm : 変性中点温度半分のタンパク質がアンフォールディングする温度 ΔH : エンタルピー変化吸熱量を示す

熱の吸収

ΔCp : 熱容量変化疎水面の露出に由来温度（℃）熱容量変化（ m cal / ℃ ）

DSCの測定原理

Tmとは

温度を上昇させ、タンパク質のアンフォー

ルディングに伴うの熱の吸収を検出。

Tmが高いほど安定な構造。

Fab、C

_H

2、C

_H

3のドメインごとに測定が

可能。

From Wikipedia

(11)

構造安定性

11

抗体の測定例

各ドメインのアンフォールディングに伴い、

吸熱ピークが検出される。より高温である

ほど安定と判定。

✔ Fab、C_H2、C_H3ドメインに分けて評価が可能

Biochemical and Biophysical Research Communications 355 (2007) 751–757

CH2

CH3

Fab

VH CH1 VL CL

(12)

構造安定性（Fab domain）

12 50 60 70 80 90 pH5 pH6 pH7 Herceptin Synagis Campath Xolair Avastin Tysabri Humanized T m ( ℃ ) 50 60 70 80 90 pH5 pH6 pH7 Herceptin Synagis Campath Xolair Avastin Tysabri Humanized T m ( ℃ ) 50 60 70 80 90 pH5 pH6 pH7 Humira Vectivix Benlysta Yervoy Arzerra Prolia Stelara Human T m ( ℃ ) 50 60 70 80 90 pH5 pH6 pH7 Humira Vectivix Benlysta Yervoy Arzerra Prolia Stelara Human T m ( ℃ ) 50 60 70 80 90 pH5 pH6 pH7 Reopro Remicade Simulect Erbitux Chimera T m ( ℃ ) 50 60 70 80 90 pH5 pH6 pH7 Reopro Remicade Simulect Erbitux Chimera T m ( ℃ )

Chimera Humanized Human

★ 破線は凍乾注（FS ab.ではVマウス由来でないAb.）を示す。 FS Ab. 50 60 70 80 90 pH5 pH6 pH7 CUE-1 NBA-2 CSF-8 ILR-1 MCY-1 ASK8007 FS Ab. T m ( ℃ ) 50 60 70 80 90 pH5 pH6 pH7 CUE-1 NBA-2 CSF-8 ILR-1 MCY-1 ASK8007 FS Ab. T m ( ℃ ) ☆ Tm < 70℃となるものは3/17品目（うち2品目は凍乾注） ☆ FS抗体のTmは市販抗体（緩衝液）と同程度

Non-human V region Non-human CDR

mAb 12 mAb 17 mAb 10 mAb 05 mAb 15 mAb 11 mAb 06 mAb 13 mAb 01 mAb 03 mAb 09 mAb 04 mAb 02 mAb 14 mAb 07 mAb 08 mAb 16 mAb A mAb B mAb C mAb D mAb E mAb F

(13)

構造安定性（Fab domain）

13

☆ 製剤化で期待出来るTmの上

昇は2℃程度

☆ 緩衝液中で構造安定性の良

好な抗体を選択することは有用

60.0 70.0 80.0 90.0 Buffer F1 FF Synagis Xolair Vectivix Herceptin Tysabri Campath Yervoy Simulect Prolia Stelara Avastin Erbitux Reopro Humira Arzerra Remicade Benlysta

Fab

Tm

(

℃

)

Ly Ly Ly Ly Ly Buffer = 製剤処方に近い緩衝液pH Ly = 凍乾注 mAb 11 mAb 13 mAb 04 mAb 15 mAb 03 mAb 06 mAb 14 mAb 10 mAb 08 mAb 16 mAb 01 mAb 05 mAb 12 mAb 09 mAb 07 mAb 17 mAb 02

(14)

14

50℃/2W 安定性試験における分解（％）

①dimer of HC、 ②degradated HC、 ③aggregation、 ④degradated whole antibody

mAb 01

mAb 02

mAb 17

Most antibodies

showed similar

degradation /

aggregation pattern.

Remicade FF Reduced Non-reduced Ab. conc. (ug/mL) 200 40 8 1.6 0.32 0.06 100 20 4 0.8 0.16 0.03 MW (kDa) 200 97 14.4 21.5 31 45 66 116 6.5 Ab H L Avastin pH5 Reduced Non-reduced Ab. conc. (ug/mL) 200 40 8 1.6 0.32 0.06 100 20 4 0.8 0.16 0.03 MW (kDa) 200 97 14.4 21.5 31 45 66 116 6.5 Ab H L Yervoy pH6 Reduced Non-reduced Ab. conc. (ug/mL) 200 40 8 1.6 0.32 0.06 100 20 4 0.8 0.16 0.03 MW (kDa) 200 97 14.4 21.5 31 45 66 116 6.5 Ab H L Reduced Non-reduced Ab. conc. (ug/mL) 200 40 8 1.6 0.32 0.06 100 20 4 0.8 0.16 0.03 MW (kDa) 200 97 14.4 21.5 31 45 66 116 6.5 Ab H L Benlysta pH7.4

・Ordinary inpurities

①dimer of HC

②degradated HC

③aggregation

④degradated whole antibody

※HC: heavy chain

Most antibodies

showed similar

degradation /

aggregation pattern.

Remicade FF Reduced Non-reduced Ab. conc. (ug/mL) 200 40 8 1.6 0.32 0.06 100 20 4 0.8 0.16 0.03 MW (kDa) 200 97 14.4 21.5 31 45 66 116 6.5 Ab H L Avastin pH5 Reduced Non-reduced Ab. conc. (ug/mL) 200 40 8 1.6 0.32 0.06 100 20 4 0.8 0.16 0.03 MW (kDa) 200 97 14.4 21.5 31 45 66 116 6.5 Ab H L Yervoy pH6 Reduced Non-reduced Ab. conc. (ug/mL) 200 40 8 1.6 0.32 0.06 100 20 4 0.8 0.16 0.03 MW (kDa) 200 97 14.4 21.5 31 45 66 116 6.5 Ab H L Reduced Non-reduced Ab. conc. (ug/mL) 200 40 8 1.6 0.32 0.06 100 20 4 0.8 0.16 0.03 MW (kDa) 200 97 14.4 21.5 31 45 66 116 6.5 Ab H L Benlysta pH7.4

・Ordinary inpurities

①dimer of HC

②degradated HC

③aggregation

④degradated whole antibody

※HC: heavy chain

(15)

15 凍乾注 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Initial pH5 pH6 pH7 FF Im pur ity (%) SDS-PAGE Non-Reduced 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Initial pH5 pH6 pH7 FF Im pu rity (%) SDS-PAGE Reduced 分解物量の平均は、 Initial 約2% 最適pH 約4% FF 約2% であった。増加量はわずかで、製剤化で改善の傾向がみられた。

50℃/2W 安定性試験における分解（％）

mAb 02 17 12 01 07 09 08 06 14 15 16 05 13 11 10 04 03 IgG4 IgG2 IgG2

(16)

50℃/2W 安定性試験におけるDimer量（％）

16 0 1 2 3 4 5 Initial pH5 pH6 pH7 F1 FF D im er ( %) IgG2 IgG2 IgG4 沈殿 (pH5, F1, FF) ca.18% 0 1 2 3 4 5 Initial pH5 pH6 pH7 F1 FF Di m er (% ) 凍結乾燥製剤 ☆ 最安定pH（1mg/mL）においては、16/17品目でDimer < 1%。 ☆ IgG2、IgG4は、IgG1と比較して、酸性条件下で凝集性が高い傾向がみられた。

(17)

50℃/2W 安定性試験における Polymer量（％）

17 0 1 2 3 4 5 Initial pH5 pH6 pH7 F1 FF Polym er (% ) IgG2 IgG2 IgG4 沈殿 (pH5, F1, FF) 0 1 2 3 4 5 Initial pH5 pH6 pH7 F1 FF Di m er (% ) 凍結乾燥製剤 ☆ 最安定pH（1mg/mL）においては、17/17品目でPolymer < 1%。 ☆ IgG2、IgG4は、IgG1と比較して、酸性条件下で凝集性が高い傾向がみられた。

(18)

50℃/2W 安定性試験における凝集性（濃度依存性）

18

製剤濃度（mg/mL）: mAb 02（80）> mAb 09（50）> mAb 06（30）> mAb 07（20）

mAb 06

mAb 09

mAb 07

mAb 02

☆ 高濃度でも凝集体の増加は数%

であり、市販抗体医薬品の凝集性は

低い。

☆ mAb 02では製剤化により凝集

性が改善されている。

(19)

19

Test item Result

SEC [Dimer] ・average : 0.51% ・min : 0.20% ・max : 1.76% [Polymer] ・average : 0.04% ・min : 0.00% ・max : 0.32% DLS 11品目とも変化なし Visual inspection No precipitation

★ 市販品の凝集性（液剤11品目、最適pH）

0 1 2 3 4 5 avr. 0.51% criteria D im er ( %) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 avr. 0.04% criteria P o ly m er ( % )

図．市販品（液剤、11品目）の凝集体増加量

50℃/2W 安定性試験における凝集性

(20)

安定性予測

20

安定性評価スキーム

タンパク質は構造変化、凝集、分解、アミノ酸側鎖の異性化等の変化を伴うため、

安定性評価は複雑なものとなる。

抗体の安定性においては凝集性評価が量、抗原性の点から重要なファクターのひと

つである。

加速試験

保存条件での安定性

_{（5℃ / 3年等）}

安定性予測 凝集性、分解等を評価し安定性プロファイルを把握凝集性データを用い安定性予測

(21)

凝集体評価

21 ● Visible Particles ・ガイドラインあり（注射剤の不溶性微粒子試験法） ICHQ4B（日本薬局方6.07）、EP2.9.19、USP<788> ● Invisible Particles ・ガイドラインあり・定量性の高い測定法がある 100nm 10nm 1nm 1mm 10mm 100mm 1mm 1cm ● Subvisible Particles ・抗原性に懸念も、意見分かれる・ FDAがP-2、3で、モニタリングを推奨・ガイドラインなし・定量性の高い測定法がない粒径

図. 各種測定法の測定範囲

DLS 目視 SEC 抗体

(22)

Size Exclusion Chromatographyによる凝集体評価

22 D ime r Mo n o m e r P o ly m e r Di m e r M o n o m e r P o ly m e r Initial 50℃ Initial 50℃

①

②

① 複雑な凝集過程で、Polymer以上の変

化を予測できない。

② 下のようなシンプルな凝集過程も考えられ、

定量性の高いSECでのモニタリングから

Polymer以上の増加の予測、コントロール

もしやすい。

Mono

Di

Poly

・・・

一部分一部分一部分

図. SECのクロマトグラム

②のような抗体を選択することで、抗原性を含

めた凝集性リスクを下げる。

②のような抗体を選択することで、抗原性を含めた凝集性リスクを下げる

(23)

二量体生成予測

23

dM/dt= -M

2

_k

1

+(M

0

-M)k

2

monomer

dimer k1 k2 安定性予測のパラメータとしては凝集体増加量を用い、反応速度式は実測値から上式を設定した。 M : 単量体濃度 M₀ : 初期単量体濃度

各温度での安定性試験における二量体生成量からk を算出

Fig. Simulated % aggregate at 5 ºC. 反応モデル 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 0 1 2 3 4 % D im er Time (year) 5℃での増加量を予測

(24)

安定性予測

24 T1 T2 T3 T4 活性化エネルギー: E エネルギー存在確率 T1 < T2< T3 < T4 温度（K）気体定数活性化エネルギー（kcal/mol）速度定数頻度因子 アレニウスの式 ボルツマン分布化学反応速度が温度に依存する場合の速度定数kと絶対温度Tとの関係式 “E”以上のエネルギーを持つ分子が“A”の頻度で反応。各温度で、5℃/3年と同等の反応が進行するためにかかる時間は“E”と相関。 40℃ 30℃ 5℃ 50℃ Eを左記plotより算出各温度での安定性試験から算出されたk を用いて、A、Eを求める。A、Eを元にアレニウスの式から5℃での kを求め、5℃での安定性を予測する。

(25)

25

50℃

40℃

30℃

● 各温度で凝集体生成量を経時観察

50℃、40℃、30℃

SECで定量

カーブフィッティングでk1、k2を算出

ex1) mAb R 100mg/mL@pH5

(26)

26

ex1) mAb R 100mg/mL@pH5

アレニウスプロット

5℃実測値と予測値の比較

5℃予測 k

k1 = 1.0 x 10-6 k2 = 2.8 x 10-3

● 各温度で凝集体生成量を経時観察

50℃、40℃、30℃

SECで定量

カーブフィッティングでk1、k2を算出

(27)

27

アレニウスプロット

k2が収束しないケース

不可逆的な二量体生成がメインであることを示唆

5℃実測値と予測値の比較

5℃予測 k

k1 = 3.7 x 10-7 (k2 = 1.0 x 10-8₎

ex2) mAb S 20mg/mL@pH6

(28)

28

アレニウスプロット

30，40，50℃の結果からの予測が実測と一致しないケース

5℃実測値と予測値の比較

5℃予測 k

k1 = 2.8 x 10-6 k2 = 1.3 x 10-3

ex3) mAb T 50mg/mL@pH6

(29)

29

アレニウスプロット

50℃の結果を除いて予測

5℃実測値と予測値の比較

5℃予測 k

k1 = 9.3 x 10-6 k2 = 6.6 x 10-3

ex3) mAb T 50mg/mL@pH6

(30)

予測と実測の比較

30

Antibody Buffer conc(mg/mL) storage ΔDimer(%) 実測-予測 R pH5 100 5℃1年 -0.2 S pH6 20 5℃1年 0.2 T pH6 50 5℃1年 0.2 U ー 50 5℃1年 0.0 V pH6 100 5℃1年 -0.2 W pH6 50 5℃半年 0.0 X pH6 100 5℃半年 0.0

(31)

まとめ

31