試 薬 及 び そ れ を 用 い た 新 規 環 状 ペ プ チ ド 合 成 法 の 開 発 を 目 指 し た 。 1. 新 規 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 形 成 試 薬 の 創 製 新 規 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 形 成 試 薬 を 開 発 す る た め 、申 請 者 は3-ニ ト ロ-2- ピ リ ジ ン ス ル フ ェ ン 酸 エ ス テ ル（Npys-OR）に 着 目 し た 。 即 ち 、 先 ず 化 合 物 1 を 塩 化 ス ル フ リ ル に よ り 塩 素 化 し た 後 、 塩 基 性 条 件 下 で 各 種 ア ル コ ー ル ま た は フ ェ ノ ー ル と 反 応 さ せ る こ と に よ り 、収 率 20-81%に て Npys-OR 誘 導 体 3a-f を 合 成 し た （Scheme 1）。続 い て 、Npys-OR 誘 導 体 の ジ ス ル フ ィ ド 形 成 能 を 評 価 す る た め 、CH3CN/H2O 混 合 溶 媒 中 、 還 元 型 oxytocin（ 4） と 一 部 の 誘 導 体 を 反 応 さ せ 、oxytocin （5, 9 残 基 , ジ ス ル フ ィ ド 結 合 数; 1）を 合 成 し た（ Table 1）。 そ の 結 果 、 各 Npys-OR 誘 導 体 は ジ ス ル フ ィ ド 形 成 能 を 示 し た が 、そ の 反 応 性 に は 差 が 観 察 さ れ た 。特 に 良 好 な 反 応 性 を 示 し た 誘 導 体 は メ ト キ シ 基 を 有 す る 3a で あ り 、 当 該 誘 導 体 を 用 い た 際 、ペ プ チ ド 5 の HPLC 収 率 は 90%で あ っ た（ Table 1, Entry 1）。そ の 一 方 で 、t-ブ ト キ シ 基 を 導 入 し た 誘 導 体 3d は 低 い 値 （ 29%） を 示 し た こ と か ら 、 反 応 性 の 相 違 に 関 し て は ア ル コ キ シ 基 の 立 体 障 害 に 主 に 起 因 す る と 推 察 さ れ る （Table 1, Entry 4）。 次 に 誘 導 体 3a の 利 便 性 を 向 上 さ せ る た め 、 固 相 担 持 型 試 薬 の 開 発 に 着 手 し た 。 一 般 的 に 高 い 親 水 性 を 有 す る ペ プ チ ド の 合 成 を 指 向 し た た め 、 固 相 担 体 と し て 水 系 溶 媒 と 有 機 溶 媒 双 方 に 良 好 な 膨 潤 性 を 示 す ア ミ ノ メ チ ル ChemMatrix®︎樹 脂 を 選 択 し 、 誘 導 体 3a を 担 持 さ せ る こ と で 固 相 担 持 型 試 薬 を 開 発 し た 。 こ れ を 用 い た ペ プ チ ド 5 の 合 成 で は 、溶 液 中 に 試 薬 由 来 の 副 生 成 物 が 観 察 さ れ な か っ た た め 、ろ 過 の み で 所 望 の 環 状 ペ プ チ ド が 得 ら れ る 。こ れ ら の 結 果 か ら 、 メ ト キ シ 誘 導 体 3a 及 び 固 相 担 持 型 試 薬 は 有 用 な ジ ス ル フ ィ ド 結 合 形 成 試 薬 と し て 期 待 で き る 。 Scheme 1. 3-ニ ト ロ -2-ピ リ ジ ン ス ル フ ェ ン 酸 エ ス テ ル 誘 導 体 の 合 成 Table 1. ジ ス ル フ ィ ド 形 成 能 の 比 較
Entry Compound R HPLC yield of 5 (%)
[ a] 1 h 3 h 6 h 1 3a Me 63 83 90 2 3b n-Bu 17 47 68 3 3c i-Pr 15 44 60 4 3d t-Bu 4 14 29
2. メ ト キ シ 誘 導 体 を 用 い た 生 理 活 性 ジ ス ル フ ィ ド ペ プ チ ド の 合 成 メ ト キ シ 誘 導 体 3a の 有 用 性 を 示 す た め 、 複 雑 な 環 状 ジ ス ル フ ィ ド ペ プ チ ド の モ デ ル 合 成 に 着 手 し た 。 先 ず 、 oxytocin よ り も 長 鎖 ペ プ チ ド と し て 、-hANP （28 残 基 , ジ ス ル フ ィ ド 結 合 数; 1） を 合 成 し た 。誘 導 体 3a に よ る 無 保 護 Cys 残 基 間 の ジ ス ル フ ィ ド 結 合 の 形 成 に よ り 、収 率 約 50%で -hANP の 合 成 を 達 成 し た 。こ の こ と か ら 、誘 導 体 3a は 比 較 的 高 分 子 量 の 環 状 ペ プ チ ド 合 成 に も 適 用 で き る こ と が 示 唆 さ れ た 。ま た 、本 ペ プ チ ド は 、配 列 中 に 酸 化 を 受 け や す い Met 残 基 を 有 す る が 、本 酸 化 反 応 に お い て 、Met の 酸 化 は 観 察 さ れ な か っ た 。
間 反 応 が 著 し く 抑 制 さ れ 、oligomer の 生 成 は 2-3% に 低 下 し た （Table 2, Entry 2-3）。 本 結 果 か ら 、LiCl の 添 加 で 分 子 間 反 応 が 抑 制 さ れ 、 立 体 的 に 有 利 と 思 わ れ る 分 子 内 反 応 が 優 先 し た と 考 え ら れ る 。 続 い て 、 申 請 者 は 前 述 し た 方 法 が 多 様 な 環 状 ジ ス ル フ ィ ド ペ プ チ ド 合 成 に 適 用 で き る こ と を 示 す た め 、melanin-concentrating hormone（ MCH, 19 残 基 , ジ ス ル フ ィ ド 結 合 数 ; 1）及 び -ImI（ 6）の 固 相 合 成 に 着 手 し た 。MCH 合 成 に お い て も 、LiCl/DMF 混 合 溶 媒 中 で 化 合 物 9 に よ る 酸 化 反 応 を 実 施 し た 。 ペ プ チ ド -樹 脂 を 脱 樹 脂 後 、 逆 相 HPLC で の 解 析 か ら 、固 相 担 体 上 に お け る 所 望 の 環 状 ジ ス ル フ ィ ド ペ プ チ ド の 構 築 を 確 認 し た 。 そ の 後 、逆 相 HPLC 精 製 に よ り 、単 離 収 率 22%に て MCH の 合 成 を 達 成 し た 。本 結 果 か ら 、中 程 度 の 鎖 長 を も つ 環 状 ジ ス ル フ ィ ド ペ プ チ ド に お い て も 、本 固 相 合 成 法 が 有 用 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。さ ら に 、2 組 の 分 子 内 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 有 す る ペ プ チ ド 6 の 合 成 で は 、化 合 物 9 に よ る 酸 化 と ヨ ウ 素 酸 化 を 組 み 合 わ せ る こ と で 、 合 成 中 間 体 の 逆 相 HPLC 精 製 を 行 わ ず に 、 固 相 上 で の 位 置 選 択 的 分 子 内 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 形 成 を 達 成 し た 。 更 な る 合 成 の 効 率 化 を 図 る た め 、 本 固 相 合 成 法 を 自 動 固 相 ペ プ チ ド 合 成 機 へ 適 用 し た 。 そ の 結 果 、 前 述 し た oxytocin, MCH, -ImI の 完 全 自 動 合 成 を 達 成 で き た 。 こ れ ら の 単 離 収 率 は 、 半 自 動 合 成 で 酸 化 反 応 に 付 し た 場 合 と 同 等 の 値 を 示 し た こ と か ら 、 本 自 動 合 成 法 は 様 々 な 環 状 ジ ス ル フ ィ ド ペ プ チ ド 合 成 に 応 用 可 能 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 本 研 究 で は 、3-ニ ト ロ -2-ピ リ ジ ン ス ル フ ェ ン 酸 エ ス テ ル （ Npys-OR） 構 造 を 有 す る 新 た な ジ ス ル フ ィ ド 結 合 形 成 試 薬 の 開 発 を 実 施 し た 。 そ の 結 果 、 メ ト キ シ 基 を 有 す る 誘 導 体 3a が 良 好 な 分 子 内 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 形 成 能 を 示 す こ と を 見 出 し 、 本 構 造 を 足 掛 か り に 固 相 担 持 型 試 薬 の 開 発 に も 成 功 し た 。 ま た 、4 種 の 環 状 ジ ス ル フ ィ ド ペ プ チ ド の 合 成 を 達 成 し た 。 即 ち 、 新 規 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 形 成 試 薬 が 複 雑 な 環 状 ジ ス ル フ ィ ド ペ プ チ ド の 合 成 に 適 用 可 能 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 Table 2. 固 相 上 分 子 内 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 形 成 Entry Solvent Conc. of 9 (mM) Time (h) Purity of 5 (%)[ a] Oligomers (%)[ a] 1 DMF 20 1 69 27 2 0.4 M LiCl/DMF 20 1 88 3 3 0.4 M LiCl/DMF 5 3 91 2
さ ら に 、 化 合 物 9 を 用 い た 固 相 環 状 ジ ス ル フ ィ ド ペ プ チ ド 合 成 法 を 開 発 し 、 当 該 合 成 法 を 自 動 固 相 ペ プ チ ド 合 成 機 に 適 用 さ せ る こ と に も 成 功 し た 。 こ れ ら の 結 果 よ り 、 申 請 者 が 開 発 し た ジ ス ル フ ィ ド 結 合 形 成 試 薬 及 び そ れ を 用 い た ペ プ チ ド 固 相 合 成 法 は 、 ペ プ チ ド 化 学 の み な ら ず 、 薬 学 研 究 、 創 薬 研 究 、 ケ ミ カ ル バ イ オ ロ ジ ー 研 究 へ の 貢 献 が 期 待 さ れ る 。 【 研 究 結 果 の 掲 載 誌 】
1) A. Taguchi, K. Kobayashi, A. Kotani, K. Muguruma, M. Kobayashi, K. Fukumotom K. Takayama, H. Hakamata, Y. Hayashi, Chem. Eur. J., 23, 8262-8267 (2017).
