学 位 論 文 題 名
博 士 （ 農 学 ） 尹 惠 娟
Prokaryotic ubiquitin ‐ like protein (Pup)7proteasome‑
dependent proteolytic pathway in Rho 匸あ C 〇CCuSefy めf ． Cp 〇広 （ロド コッ カス・ エリス ロポリ スに おける ユビキ チン様 分子 Pup ・ プ ロ テ ア ソ ー ム 依 存 的 な タ ン パ ク 質 分 解 系 ）
学位論文内容の要旨
Regulation of the accumulation of specific proteins in the cells depends on the rate of both synthesis and degradation of the proteins. Bacterial intracellular proteases have a variety of functions, including processing of precursor forms (such as removal of signal peptides in exported proteins) degradation of aberrant or damaged proteins (resulting from mutations or environmental stress), and inactivation of proteins that play key roles in regulatory processes.
The proteolysis is an essential element of many regulatory processes. It must be subject to spatial and temporal control in order to prevent damage to the cell. If damaged proteins are accumulated in the cell, it may be resulting in death of the cell. Therefore, damaged proteins have to be degraded by proteases. The proteases can pe:rform selective degradation of proteins with signaling functions in order to protect cellular proteins from unwanted degradation.
Intracellular proteins are initially degraded by ATP‑dependent proteases followed by ATP‑independent proteases (endopeptidases and/or exopeptidases). One of the Al'P‑dependent proteases, the 20S proteasome exists in eukaryote, archaea and bacteria. In bacteria, the proteasome has been found in some actinomycetes, and is known to interact with the proteasomal ATPase complex.
In mycobacterial proteasome system, the prokaryotic ubiquitin‑like protein (Pup) has been found in 2008. Pup is now known as a degradation signal, which is post‑translationally modified to target proteins.
Post‑translationally modified pupylated‑proteins are selectively degraded by a proteasome‑dependent proteolytic system. Before the substrates are translocated into the proteasome chamber, Pup is removed from pupylated‑proteins by Dop (depuplase of Pup), suggesting that de‑pupylated Pup is recycled like ubiquitin.
However, in Pup‑proteasome system of Rhodococcus erythropolis, we could confrrm that Pup is removed from pupylated‑proteins by Dop, and then it is further hydrolyzed by Dop. Theses results suggested that Rhdococcus Pup is not recycled after deconjugation. The depupylase function of Dop is still unclear whether Dop involves in the removal of Pup from substrates to facilitate delivery into the proteasome or to rescue substrates from degradation
Here, we studied the Pup‑dependent protein degradation system by proteasome in Rhodococcus
―202―
erythropolis.
1. Pup is deconjugated from pupylated‑protein, and tben free Pup is further hydrolyzed by
Dop
Pupylated proteins were isolated and analyzed by LC‑MS/MS. More than 100 proteins were detected and the pupylation sites of 31 proteins were successfully identified. We selected 6 proteins as model
substrates and prepared pupylated‑substrates: inorganic pyrophospbatase (PPase), aldehyde dehydrogenase
(Aldh), 2‑is opropylmalate synthase (leuA), adenosylhomocystenas e (ahcY),
N'‑dimethyl‑4‑nitrosoaniline‑dependent alcohol oxidoreductase (Mno), and myco‑inositol‑l‑phosphate synthase (inol). Pups are deconjugated from all model substrates by Dop but free Pup is not accumulated.
Dop functions removing Pup from pupylated substrates by cleaving the isopeptide bond between Pup and
target proteins (isopepetidase activity). By LC‑MS/MS analysis of degradation products of Pup, N‑ and C‑terminal region of Pup were detected, indicated that Dop cleaved at multiple sites of de‑conjugated Pup.
2. Dop has endopeptidase activity
To confirm the endopeptidase activity of Dop, fluorogenic (AMC) substrates were incubated with Dop, and the released AMC was measured. Dop alone did not release free AMC from amino acid and peptide substrates. However, the peptidase activity of Dop was detected in conjunction with F2 aminopeptidase.
Analysis of H‑AR‑AMC revealed that Dop cleaved after an alanine residue, and the resultant H‑R‑AMC was further hydrolyzed by the F2 aminopeptidase. This reaction sequence was also observed when H‑AAF‑AMC was used as a substrate. These results suggested that Dop cleaves the isopeptide bond between Pup and substrate and subsequently degrades de‑conjugated Pup.
3. Pup is not only function as a degradation signal, but also may regulate the function of target proteins
We identified several proteins which were degraded by a Pup‑proteasome‑dependent proteolytic system. In the in vitro reconstitutioj:t experiment, however, the half‑lives of most pupylated proteins were much longer than the doubling time of the host cell. This finding suggests that, in addition to being a degradation signal, Pup may have other unknown functions. Pupylated PPase is a stable protein and is not degraded by proteasome‑dqpendent proteolytic system. Interestingly, the enzymatic activity of pupylated‑PPase 407 pmol Pi‑ mg‑'‑ min‑') was dramatically enhanced by Dop treatment (715 pmol Pi‑ mg‑' min"); the accessibility of the substrate to the catalytic site may be increased by the removal of Pup. Tbis suggests that Pup Iigation to or removal from cellular proteins may regulate their functions. Further investigation is required to determine the roles of the pupylation and intracellular protein degradation systems in Rhodococcus.
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨
主 査 客員 教 授 田村 具博 副 査 教 授 横 田 篤 副 査 客員 教 授 鎌形 洋一 副査 客員准教授 湯本 勳
学 位 論 文 題 名
Prokaryotic ubiquitin‑like protein (Pup)7proteasome‑
dependent proteolytic pathway in Rho 匸め C 〇CCuSefy 施 rpp 〇．Z 函 （ ロド コ ッカ ス・ エ リス ロポリスにおけ るユビキチン様分 子 Pup − プ ロ テ ア ソ ー ム 依 存 的 な タ ン パ ク 質 分 解 系 ）
本 論文 は英 文 92 項 、図 33 、 表4 、4 章 から なり 、参 考論 文（ 原著 論文 2 編、 日本語総 説1 編、 学会要旨4 編）が付されてい る。
微生物の細胞内夕ンパク質の安定性（半減期）は、夕ンパク質の構造安定性に依存する 一方、細胞が置かれる環境や状況に よって変化することが知られている。細胞内夕ンパ ク質 は、 その 殆 どが 安定な高次構 造をもっため、必ずATP 依存 性夕ンパク質分解系によ る分 解を 最初 に 受け る。この分解 系に寄与するタンパク質分解酵素として、複数のATP 依存性プロテアーゼが知られている が、標的蛋白質がどの様に選別・分解を受けるのか その機構には不明な点が多い。この 細胞内夕ンバク質の分解系を理解し目的夕ンパク質 の細胞内量を制御する技術が開発さ れれば、微生物を宿主とした高効率物質生産系の構 築 が 容 易 に な る と 考 え ら れ 、 現 在 も 精 力 的 に 研 究 が 続 け ら れ て い る 。 本 研究 では 、 放線 菌Rhodococcus erythropo ノ おのATP 依存 性プ口テアーゼのーつで あるプロテアソームに焦点を当て、 同酵素依存的なタンパク質分解系において、分解シ グナ ルと して 機 能す るPup 分子の翻訳後修飾系にについて解明 を試み、結果をまとめた ものである。
1 ） Pup 分子の翻訳後修飾とDop によ る脱Pup 化反応との関係
Mycobacterium 属 放線 菌の 研究 より 、Pup 標識 を受けたタン パク質は、プロテアソー ム依 存性 分解 シ ステ ムによって分 解を受けることが知られている。この時Pup 分子は、
分解 シグ ナル と して 認識され、標 的夕ンバク質が分解を受ける際にDop により切り離さ れる 。そ して 切 り離 されたフリー のPup は、他のタンパク質の 標識へと再利用されると 考えられている。そこで尹氏は、ま ず同様の現象を確認するため、解析ッールが発達し てい る放 線菌 Rhodococcus erythropolis を 宿主 として、Pup 化夕ンパク質を調整しDop 処理 を施 すと 、 脱Pup 化 は確 認で きる が、 切 り離 されたフリーのPup が消失することを
一204−
見 出 し た 。 そ こ で 、
Rhodococcus
あ る い はMycobacterium
由 来Pup
を 標 識 し たPup
化 夕 ン パ ク 質 を 調 整 し 、 両 微 生 物 由 来 のDop
で そ れ ぞ れ 反 応 さ せ る と 、Mycobacyetium
由 来Pup
は 両 微 生 物 由 来Dop
と も フ リ ー のPup
分 子 の 蓄 積 を 確 認 す る こ と が で き た が 、Rhodococcus
由 来Pup
はDop
の 種 類 に か か わ ら ず フ リ ー のPup
分 子 を 検 出 す る こ と が で き な か っ た 。 こ の こ と よ り 、Rhodococcus
由 来Pup
は 〃 』 ぱ ロ ぬ ビterium
由 来 のPup
に 比 べ て 構 造 安 定 性 が 異 な る 可 能 性 を 見 出 し た 。 次 に 、 上 記 調 整 し た 勵odococcus
由 来Pup
化 夕 ン バ ク 質 をLC
―MS/MS
で 解 析 し 、100
種 以 上 のPup
化 さ れ た タ ン パ ク 質 を 同 定 す る と 共 に 、31
種 類 の タ ン パ ク 質 に つ い てPup
化 部 位 を 同 定 す る こ と に 成 功 し た 。 そ し て 、 こ の31
種 の タ ン パ ク 質 か ら6
種 の タ ン パ ク 質(inor
．ganic pyrophosphatase (PPase)
，aldehyde dehydrogenase
（Aldh
冫 ，2
‐isopropylmalatesynthase
（1
即A冫，adenosylhomocystenase
（
ahc
め ，N
‐dimethy14
‐mtrosoaniline
‐d
叩endemalcoholoXidoreductase
（Mno
） ，and n
ッco
‐inositol
‐1
‐phospbatesynthase（mol
） ） を 選 抜し 、 そ れ ぞ れPup化 夕 ンパ ク 質 を 調 整しDop
に よ る 脱Pup
反 応 を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 い ず れ の モ デ ル 基 質 に お い て も フ リ ー のPup
を 確 認 す る こ と が で き な か っ た 。 こ れ ら の こ と よ り 、 励 口 カ 勿 ピ ピ 恥 由 来Pup
は 脱Pup
反 応 と と も に 分 解 を 受 け て い る 可 能 性 を 見 出 し 、 こ れ ま で の 概 念 を 変 え る デ ー タ を 取 得 し た。2
）Dop分 子 はェ ン ド ベ プ チダ ー ゼ 活 性 をも つPup
がDop
に よ り 分 解 を 受 け て い る 可 能 性 を 見 出 し た 尹 氏 は 、Pup
の 単 独 発 現 と 精 製 を 試 み た が 、Pup
自 身 の 細 胞 内 不 安 定 性 の た め 成 功 し な か っ た 。 そ こ で 、Pup
とECFP
を 連 結 し た 融 合 夕 ン パ ク 質 を 調 整 しDop
処 理 に よ る 分 子 量 の 変 化 を 見 る と 、Pup
の 内 部 が 切 断 さ れ たPup
ーECFP
断 片 が 複 数 確 認 さ れ た 。 ま た 、Pup
化 夕 ン パ ク 質 の モ デ ル 基 質 と し て 調 整 し たPup
一PPase
をDop
処 理 し 、 分 解 産 物 を 回 収 し てLC
―MS
川S
で 解 析 を 行 う と 、Pup
の 分 解 物 を 多 数 確 認 す る こ と が で き た 。 更 に 、 合 成 基 質 を 用 い てDop
の べ プ チ ダ ー ゼ 活 性 を 測 定 す る と 、 勵Dカ ピ ロ ピ ピ 船 由 来Dopの み な ら ず め で ロ み ロ ピ ′Pr/
脚 由 来Dop
にお い て も ェ ン ド ベ プ チ ダ ー ゼ 活 性 を 確 認 す る こ と が で き た 。 こ の こ と は 、Dop
分 子 に は 、Pup
に 対 す る 脱 ア ミ ド 活 性 や イ ソ ベ プ チ ダ ー ゼ 活 性 に 加 え 、 エ ン ド ベ プ チ ダ ー ゼ 活 性 を 持 つ こ と を 初 め て 示 し た 。 本 研 究 で は 、 異 な る 基 質 を 調 整 し 多 角 的 に 解 析 し て 得 ら れ た 成 果 で あり 高 く 評 価 さ れる 。3
）Pupに は 分解 シ グ ナ ル 以外 の 機 能 が あるPup
は 、 分 解 シ グ ナ ル と し て 機 能 す る と 考 え ら れ て き た が 、 プ 口 テ ア ソ ー ム 分 解 系 に よ るPup
化 夕 ン バ ク 質 の 分 解 は 、 細 胞 の 増 殖 速 度 以 上 に 遅 い 場 合 が あ る こ と 、 ま た 全 て のPup
化 夕 ン バ ク 質 は プ 口 テ ア ソ ー ム に よ っ て 分 解 を 受 け な い こ と を 見 出 し た （ モ デ ル 基 質 と し て 使 用 し たPup
−PPase
も 分 解 を 受 け な い 酵 素 で あ る ） 。 こ の こ と か ら 、Pup
に は 分 解 シ グ ナ ル 以 外 の 機 能 が あ る と 考 え 、Pup
−PPase
のD0p
処 理 の 有 無 に よ るPPase
活 性 を 測 定 す る と 、 脱Pup
に よ りPPase
の 活 性 が 著 し く 上 昇 す る こ と を 見 出 し た （407pmol Pi
．mg
‥ ．Ini．l
→715pmolPi
．mg
‥ ．Inin
・l
） 。 こ の こ と は 、Pup分 子 の 翻 訳後 修 飾 が 、 夕ン バ ク 質 の 機 能 に 影 響 を 及 ぼ しPPase
の 酵 素 活 性 を 制 御 す る 可 能 性 を 示 し た 。 こ の 内 容 は 同 時 に 、 な ぜPup
分 子 が 真 核 生 物 の ユ ピ キ チ ン 修 飾 同 様 、 標 的 夕 ン バ ク 質 に 複 数 のPup
分 子 か ら 成 る 鎖 状 の 修 飾 を せ ず 、Pup1
分 子 だ け の 修 飾 系 と し て 存 在 し て い る の か を 説 明 出来 る か も し れ ない 。上 記 研 究 に よ り 、
Pup
修 飾 系 に 必 須 なDop
分 子 に エ ン ド ベ プ チ ダ ー ゼ 活 性 が あ る こ と を 初 め て 示 す と と も に 、Pup
分 子 自 身 に お い て も 、 分 解 シ グ ナ ル と し て 機 能 す る 以 外 に 、 夕 ン パ ク 質 の 機 能 を 制 御 す る と い っ た 新 し い 概 念 を 提 唱 す る 成 果 が 得 ら れ 非 常 に 高 く 評 価さ れ る 。よ っ て 、 審 査 員 一 同 は 、
H
閉lYeonYun
氏 が 博 士 （ 農 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格を 有 す る も の と認 め た 。―
