原 田 七 寛

C o r y n e b a c t e r i u m  k u t s c h e r i

の抗腫蕩性に関する研究

奈良県立医科大学細菌学教室

原 田 七 寛

STUDIES O N   ANTITUMOR ACTIVITY OF  CORYNEBACTERIUM KUTSCHERI 

KAZUHIRO HARADA 

De ρ a r t

間

e n t0 1  B a c t e r i o l o g y

， 

Nara M e d i c a l  U n i v e γ . s i t y  

R e c e i v e d  March 3 1 ，  1 9 9 3  

Summary  The a n t i t u m o r  e f f e c t  o f  C o η n e b αc t e r i u m  ku

お

c h e r i was e v a l u a t e d  i n  mice  by t h e  a d m i n i s t r a t i o n  o f  f o r m a l i n

^目

k i l l e dwhole c e l l   (FK‑CK) o r  s u b c e l l u l a r  f r a c t i o n  named  CK ・ m ( m i t o g e n  d e r i v e d  from  C .   k u t s c h e r i ) .   I n  t h e s e  s t u d i e s ，  two s y s t e m s  o f  mouse v s   tumor c e l l   ( o u t b r e d  ddY v s  E h r l i c h  a s c i t e s  c a r c i n o m a  c e l l ，  i n b r e d  CDF 1  v s  P  3 8 8 1 e u k e m i a   c e l l )   were u s e d .   T r e a t r r i e n t  o f  mice i n  t h e  d o s e  r a n g e  o f  g r e a t e r  t h a n  1 0 ⁶  b a c t e r i a l  c e l l s  o r   20μg o f  CK.m p e r  mouse c o n f e r r e d  s u b s t a n t i a l  p r o t e c t i o n  on b o t h  m i c e .   The e n h a n c e d   c y t o t o x i c i t y   o f   p e r i t o n e a l   e x u d a t e  c e l l s   p l a y e d  a l e a d i n g   r o l e   i n   t h e   i n i t i a l   p h a s e   o f   a n t i t u m o r  a c t i v i t y .   The Winn a s s a y  d i s c l o s e d  t h a t  a n t i t u m o r  a c t i v i t y  was a t t r i b u t a b l e  t o   n o n a d h e r e n t  s p l e n o c y t e s  whose a c t i v i t y  was i m p a i r e d  by t r e a t m e n t  w i t h  a n t i ‑ T  c e l l  a n t i ‑ body and c o m p l e m e n t .   The f a c t  t h a t  t h e  g e n e r a t i o n  o f  e f f e c t o r  c e l l s  p a r a l l e l e d  t h a t  o f  t h e   d e l a y e d ‑ t y p e  h y p e r s e n s i t i v i t y  t o  t h i s  b a c t e r i u m  may s u g g e s t  t h a t  t h e  a n t i t u m o r  a c t i v i t y  o f   C .   k u t s c h e r i  i s   mediated i n  p a r t  by T c e l l .  

The i s o l a t i o n  and c h a r a c t e r i z a t i o n  o f  b i o l o g i c a l  a c t i v i t i e s  o f  t h e  a c t i v e  component o f   C .   k u t s c h e r i  were a t t e m p t e d .   The a n t i t u m o r  a c t i v i t y  was c o n f i n e d  t o  t h e  s u b c e l l u l a r  p a r t i c l e   f r a c t i o n  o f  t h i s  organism and a s s o c i a t e d  w i t h  a  m o l e c u l e  o f  g l y c o p r o t e i n  n a t u r e  ( 3 8 ， 0 0 0   D a l t o n )   i s o l a t e d  from t h i s   f r a c t i o n  by a f f i n i t y   chromatography w i t h  C o n c a n a v a l i n  A‑

S e p h a r o s e  4  B .   T h i s  s u b s t a n c e  e x e r t e d  m i t o g e n i c  e f f e c t  on C  3  H/HeJ s p l e n o c y t e s  and T  c e l l s  and f u r t h e r  e x h i b i t e d  a n t i t u m o r  a c t i v i t y  on P  3 8 8  l e u k e m i a  c e l l  i n  CDF 1  m i c e .   The  Winn a s s a y  d i s c l o s e d  t h a t  t h e  a n t i t u m o r  a c t i v i t y  i n d u c e d  by t h i s  m a t e r i a l  was d e p e n d e n t  on  L  3  T 4  T c e l l s .   Furthermore ，  b o t h  t h e  m i t o g e n i c  and a n t i t u m o r  a c t i v i t y  o f  t h i s  m o i e t y  were  r e s i s t a n t  t o  h e a t i n g  a t  1 0 0

⁰

C f o r  3 0  min o r  RNase d i g e s t i o n ，  b u t  s e n s i t i v e  t o  t r y p s i n  d i g e s ‑ t i o n ，  low o r  h i g h  pH.  These r e s u l t s  i n d i c a t e  t h a t  t h e  a n t i t u m o r  a c t i v i t y  o f   C .   k u t s c h e r i  i s   a t t r i b u t a b l e  t o  t h e  h e a t ‑ s t a b l e  g l y c o p r o t e i n  m o i e t y  which can d i r e c t l y  s t i m u l a t e  T c e l l s  and  m a c r o p h a g e s .  

Index Terms 

a n t i t u m o r  e f f e c t

^， 

C o ηn e b a c t e r i u m  k u t s c h e r i

， 

g l y c o p r o t e i n

^， 

mitogen

^， 

Winn a s s a y  

緒 言

^{るいわゆる}

i m m u n o m o d u l a t o r

としての作用を有して い る こ と が 明 ら か に さ れ て い る . 特 に 細 菌 と し て は 近時多くの微生物が，生体の感染防御力を増減せしめ

Pro

戸

i o n i b a c t e r i u ma c n e s  (Co

り

n e b a c t e r i u m

仰

rvum)

が

( 1 0 0 )  

原 田 七 寛

マウスの網内系を賦活し1)，アジュバンド活性を有し2

に

さらに或る種のマウスに抗癌性を賦与することが明らか にされている3‑7).

著者は当教室においてマウスの肺肉芽腫症の病巣より 分離した

C o η n e b a c t e r i u mk u t s c h e r i

のホルマリン死菌 が，マウスに抗腫湯性を賦与することを明らかにし，さ らにこの作用が菌体内の糖蛋白成分によるものであり，

マウス牌細胞に対し

mitogen

作用を有することを明ら 泊吋こし

T

こ.

材 料 と 方 法

l 菌 株

使用菌株は当教室で飼育中の

C5 7  BL/6

に偶発した 肺肉芽腫より分離し，

P i e r c e ‑ C h a s e

ら8)の方法

i

こ従い

C k u t s c h e r i   NCTT 1 1 9 3 8

を基準として同定したC.

k u t s

^司

c h e r i   SK‑1

株である.本菌株はゲラチンディスク法9)

で

‑80'C

に保存した.

用にのぞみこのディスク

l

枚を

b r a i nh e a r t   i n f u s i o n   (BH

I) 

b r o t h   ( D i f c o   L a b o r a t o r i s e s

， 

D e t r o i t

， 

M i c h .

， 

USA)l ml

中に融解後，

1

夜

3

7'

C

で 培 養 し て 後

d e c a r

^目

b o x y l a s e  (Sigma c h e m i c a l  C o . ，  S t .   L o u i s ，  Mo.)

を

0 . 0 1

%  ( w / v )

添加した

BHIb r o t h  11

に接種し ，

3TC18

時間 回転培養した.この培養液を

6

，

0 0 0rpm 3 0

分の遠沈によ り集菌し，滅菌

Hanks'b a l a n c e d  s a l t  s o l u t i o n ( H B S S )  

にて同様の遠心により

3

回洗糠した.洗糠菌体をホノレマ

リン

0 . 3

%を加えたリ

γ

酸緩衝液

( 0 . 0 1M

， 

pH  7 . 2 )

に浮 遊し

4 ' C

で

3

日間保存して殺菌した. このホノレマリン死 菌体はマウスの牌細胞に毒性を示さなくなるまで滅菌

HBSS

で数回の洗滋を行った.チオグリコーノレ酸培地に よる無菌試験により生残菌の存在を否定したものを

C . k u

お

c h e r i

のホノレマリン死菌体

(FK ・ CK)

として使用し た.

2  マウス

抗腫療性を実証するため

a l l o g e n e i c

(同種)の

ddY

お よび

s y n g e n e i c

([司系〉の

CDF

，を使用した.これらは

8‑10

週齢の雌で何れも日本クレア株式会社より購入し，

本研究室内で

2

週間飼育した後実験に供した.

さらに標品の

mitogen

効果を検索するための

C3H/

HeJ

の

3

週齢雌マウスは同社より購入後

2

週間研究室 内で飼育したものを使用した.

3 .

腫蕩細胞

腫湯細胞としては大阪大学微生物病研究所上回重晴教 授より分与されたエーノレリッヒ腹水癌細胞

(EAC)

を

ddY

マウスに継代して使用した.この細胞

5X10'

個を接 種した

ddY

マウスの平均生残日数

(MST)

は

1 5 . 4

日で

あった.マウスリンパ性白血病細胞

( P3 8 8 )

は愛知厚生年 金病院星野博士により分与されたもので，

1 0 '

個の接種に

よる

CDF

，マウスの

MST

は

1

l.

1

日であった.

4 .   FK ・ CK

による防御有効量の測定

HBSS 0 . 1  ml

中に変量した

FK ・ CK

を加えたものを

ddY

マウス腹腔内に注射し，その直後に

5X10'EAC

を 同 ー マ ウ ス に 注 射 し

9 0

日 間 観 察 し て 生 残 率 お よ び

MST

を測定した.

P  3 8 8

に関してはその

1 0 '

個を

CDF

， マウスに接種し

6 0

日後の生残率および

MST

を測定し た.

5 菌体内成分の調製

Sodium d o d e c y l  s u l f a t e ( S D S )

， 

0 . 2 5  

%， 

DNase ( t y p e   1 :  Sigma) 2 μg/ml

お よ び

10mMMgC1

2を 含 有 し た

1 0 0  ml

の

10mM

トリス塩酸緩衝液

(pH7 . 4 )  ( T r i s ‑B . )  

に洗糠菌体を浮遊させたものを細胞破壊器

( V i b r o g e n

，

Z e l l m

吐

h l e

，

FRG)

に て ガ ラ ス 粒 子

(0.3‑0.5mm; 

mixed t y p e )

とともに

1 5

分間菌体破壊を行った.このも のを分別遠沈

( 3 3 0g  3 0

分，

4

，

2 0 0g  6 0

分，

1 2

，

0 0 0g  6 0

分〕 した後，その上清をさらに

9 0

，

0 0 0g  2

時間の超遠沈を行 った.超遠沈によって得られた沈澄を前述の

T r i s ‑B .  

(l

OmM MgC1

2含有〉に均等に再浮遊して後蒸溜水で透 析した.その内液を

2 ' C 3 6

，

0 0 0  g

， 

1

時閣の冷却遠沈に より

SDS

を除去し凍結乾燥した標品を

P

画分として使 用した.前述の

9 0

，

0 0 0g  2

時間の超遠沈の上清は充分透 析の後凍結乾燥したものを

S

画分とし，

3 3 0  g  3 0

分の遠 沈上清を

4

，

2 0 0g  6 0

分遠沈した沈

i

宣を所定の方法川で処 理し凍結乾燥したものを細胞壁

(CW)

画分として使用し た.

P

お よ び

S

画 分 は

i

慮 過 膜

(0.20μm

，

Advantec  Toyo

，東洋

i

慮紙株式会社〉により除菌し

CW

画分は

0 . 5

%ホノレマリンで

4 ' C 4

日間処理して後，滅菌生食水で充分 に洗淋し，チオグリコーノレ酸培地

( D i f c o )

にて無菌性を 確認して使用した.

6 .   P‑

画分のゲルj慮過

P ‑

函分溶液に硫酸アンモニウム(硫安〉を

4 0

%飽和と なるように加え

4 ' C6 0

分後に

2 5

，

0 0 0g  3 0

分の遠沈によ り得た沈澱を

T r i s ‑ B .

に溶解し同液で充分に透析した.

この透析内液l.

5ml

を

MgC1

2

10mM

を含む同じ緩衝 液で平衡化した

S e p h a c r y l S ‑ 3 0 0   ( P h a r m a c i a   F i n e   Ch

巴

m i c a l s

，

U p p s a l a

， 

Sweeden)

のカラム

(2X55cm)

に 重層し同一緩衝液によって溶出した

.5ml

づっの画分を 組織培養液で透析し鴻過滅菌した後

C3H/HeJ

の牌細 胞に対する

mitogen

作用を検索した.

7 腹腔細胞の動態

ddy

マウスの腹腔内に

5X1 0 '

個の

EAC

を

FK ・ CK

の

有効量を同時に注射して後，適当な時間毎に

5ml

の

HBSS

で腹腔を洗糠し，腹腔細胞数を血球計算盤で計測 して後，軽く遠沈しその沈澄をギムザ染色して腹腔細胞 の組成を観察した

.EAC

はその形および大きさで正常腹 腔細胞と容易に鑑別できた.

1 0 '

個の

P3 8 8

を注射した

CDF1

の腹腔細胞の動態につ いても同様の方法で行った.

CDF1

の腹腔内に接種した

P3 8 8

細胞数の推移は，経時 的に採取したマウス腹腔細胞を組織培養液

00%

牛胎児 血清，

5  x  1 0 ‑5 M 2  m e r c a p t o e t h a n o l

， 

2  m M

グルタミン および所定量の抗生物質を添加した

RPMI1640)

で

5X 1 0 ' / m l

となるように調製した.この細胞浮遊液

200μJ

を

9 6

穴マイクロタイタープレートに分注し

5%CO

， チャンパー内で培養した.

1 2

時間後に

lμCi

の

[ 3 H J t h y m i d i n e

を加え，さらに

6

時間培養した後に

DNA

へ の取り込みを液体シンチレイションカウ

γ

ターにより計 測した.

8 

腹腔浸出細胞

(PEC)

による細胞障害作用

有効量の

FK ・ CK

を注射した

CDF1

^{マウスより経時的} に腹腔細胞を採取し，前述の組織培養液で

6XI0'

個

/ m l

となるように調製した

5 1 C r

ラベノレ

P3 8 8

は以下の方法 により作製した.すなわち，

50μCi

の

Na

，

5 1CrO

，を加え た培養液に

1 0

⁷個の

P3 8 8

を接種し

3TCl

時間恒温水槽 中で振湯した.その後

4 0ml

の培養液で洗機後

2

時間氷 中で保存し，用にのぞみ

1 0 '

個のラベルした細胞を種々 の濃度の

PEC

と混和しその

200μJ

づつをマイクロタイ タープレートに分注した.

5%CO

，チャンパー内で

4

時 間

3TC

に保温して後，

5 0 0  g  1 0

分の遠沈を行い，その上 清

100μJ

の

y

線活性をガンマーカウンターで計測した.

細胞溶解率は

実験群

cpm

一最小〔非溶解

)cpm

最大〔完全溶解

)cpm

一最ノト

cpm

で表示した.

最大〔完全〕溶解は

T r i t o n X  ‑100

を

1%

に加え，最小 溶解は培養液のみで

4

時間保温したものの遠沈上清を使 用した.

牌細胞の

NK

活性は，ナイロンウール法で得た未吸着 細胞を

YAC‑l

細胞を標的に

5 1 C r

の溶出を指標として測 定した

.PEC

の

NK

活性に関しても同様の方法を用いて 検索した.

9 .   Winn

試験

1 0

⁸個の

FK.CK

を腹腔内注射後

1 0

日目に牌臓を摘出 し，牌細胞浮遊液をプラスティツクシャーレに注入静置 することにより付着細胞

(AC)

と非付着細胞

(NAC)

に分

画し，この操作を

2

度繰り返して後

AC

はゴム製へラで かきとり

NAC

との抗腫療活性の差を

Winn

試験

1

川こよ

り比較した

1 0

7{固

/ m l

の

P3 8 8

細胞浮遊液

100μf

に，

1 0 ⁸ 1

固

/ m l

に調製した

AC

あるいは

NAC

の細胞浮遊液

100μJ

づつをそれぞれ加え

CDF1

マウスの腹腔内に注射 し，

3 0

日後の平均生残率と平均生残日数

(MST)

を計測 した.

CK'm

による実験も同様の操作で行なった.

1 0  

足蹴反応

FK ・ CK

による遅延型過敏症

( d e l a y e d ‑ t y p e h y p e r .  

S

巴

n s i t i v i t y:  DTH)

の導入能の有無を検索するため

1 0

⁸ 個の

FK.CK

を注射後，

2

日目毎に

1 05

個

/25μJ

の

FK.

CK

をマウス後

l a

上の足腕皮内に注射し

2 4

時間後の足源 の厚さを計測した.

1 1 .

リンパ球画分の調製

マウス牌細胞浮遊液を形の如く調製し，培養液に浮遊 した非付着細胞

(NAC)

を

Mage1 ) '

らの方法に従って分 離した.すなわち

1 0

倍希釈した抗マウス

IgG

家兎血清 で

c o a t

した直径

60mm

のベトリシャーレに注入し，大 部分の

B

細胞を付着させた後，非付着細胞浮遊液をナイ ロンウーノレカラムを通過せしめて

T

細胞画分を得た13)，

抗体を

c o a t

したシャーレに付着した細胞は，

HBSS

を 用いてピペッティングを繰り返すことによりシャーレよ り剥離し，得らわした細胞浮遊液を

HBSS

で

2

回洗樵の 後，抗マウス

T

細胞抗体

(Ceda r 1 ane L a b .   L t d .

， 

On

 ，.t

Canada)

と補体

CLow‑Tox‑M

， 

C e d a r l a n e )

の処理によ

り僅かに残存している

T

細胞を完全に除去した.このよ うにして得た細胞を

B

細胞として使用した.この細胞画 分の純度はLi

p o p o l y s a c c h a r i d e (LPS

， 

Sigma)

や

Con c a n a v a l i n  A(Con A

， 

Sigma)

に対する応答性の有無によ

って確認した.

1 2 .

マイトジェン効果の測定

C3H/

日巴

J

の牌細胞より得た

T

あるいは

B

細胞画分

1 0 0 μl  0  O ' c e l l s /  m 

l)の培養液

( 1 0% FCS

， 

1 0  m M   HEP  ES

， 

5  X 

1Q‑

5 . M   2‑mercapto

巴

t h a n o l

，

1 0 0  U/ml

ベニシリ ンおよび

5 0 μ g / m l

ストレプトマイシンを

RPMI1640

に加えたもの〉で

9 6

穴マイグロタイタープレート中で培 養し，

5 4

時間後に

0.5μC i / w e l l

の

[ 3 H J t h y m i d i n e

を加 え，さらに

1 8

時間培養後のそれぞれの細胞の

DNA

への とり込みを液体シンチレーションカウンターで測定した.

実 験 結 果

l 

マウスの抗腫蕩性

マウスに種々の量の

FK.CK

を投与することによって 発現される抗腫蕩作用を

Table1

に示した.

EAC

対同

( 1 0 2 )   原 田 七 寛

種の

ddY

マウスは，

1 0

⁴個の

FK ・ CK

により

4 5

%の生残 ノレに達した.これに対し

1 0 '

個

EAC

のみを単独投与した 率が得られ，

1 0 '

個の

FK ・ CK

では腫蕩接種

9 0日後にお

群においては，接種

3日後より細胞数の増加が著名とな

いて

9 0

%のマウスが生残し，その

MST

は

7 3 . 6日であ

り5日後には約

6 0

倍に達し，その殆どが

EAC

であるこ った.

P  3 8 8

対

CDF

，"<ウスの場合は

FK ・ CK1 0 '

個投与 とが腹腔細胞の塗抹標本により確かめられた.

により

6 0日後における生残率は 6 0

%， 

MSTは 4 8 . 2日 F i g .   1

に示す如く

FK ・ CK

のみの投与では，最初の

2

であり，

1 0 ' {

固の投与によりそれぞれ

8 0

%， 

5 5 . 5日であ

日間の腹腔細胞の主成分は多核白血球

(PMN)

であり，

6 

った.1

0

⁴個の投与では対照群の

1 1 . 1日に比し 3 0 . 2日と

時間目から次第に増加して

1 2

時間後に最高値を示し，以 なる程度で

6 0日後には全てのマウスは死亡した.これら

後次第に減少して数日間は尚かなりの割合を占めている の結果から以下の実験は

EAC‑ddY

系では

1 0 '

個を，

P 

マクロアァージに関しては

2 4

時間後より次第に増加し

388‑CDF

，では

1 0 '

個の

FK'CK

を使用するのが適当と

4日目で最高値を示し以後 2

週以上その値を持続したが，

思われた

EAC5x10'

個の単独接種では食細胞の反応は殆どみら

2 .

マウス腹腔内での抗腫蕩効果の発現 れなかった.なお

CDF

，対

P3 8 8

系においても同様の傾

1)マウス腹腔内細胞の動態 向であった.

Table 2

に示す如く

1 0 '

個の

FK ・ CKのみを投与した の CDF

，対

P3 8 8

系の抗腫湯性

マウスにおいては約

6

倍の細胞数の増加がみられたがそ この点に関しては

FK ・ CK

処 置 マ ウ ス の 腹 腔 細 胞 の増加は

7 2

時間後に最高値を示した.一方

5x1 0 '

個の

(PEC)

を採取して培養し

[3HJthymidine

の

DNA

への

EAC

を同時に投与した場合は

2 4

時間後に最高値を示し 取り込みを指標に

P3 8 8

細胞の増殖の有無を検索した.

たが以後次第に減少して

3日後には FK.CK

のみのレベ

Table 3

に示す如く

P3 8 8

を

FK ・ CKと共に CDF

，マウ

Table 

1. 

Antitumor e f f e c t  o f  FK ・ CKa g a i n s t  EAC and P388 c e l l s   Numbers  Antitumor e f f e c t *  

。 f

FK.CK  EAC v s .  ddY m i c e   P 3 8 8  v s .  CDF

， 

mice  s u r v i v a l   MST  s u r v i v a l   MST  r a t e

， 

%  d a y s   r a t e

， 

%  d a y s   1 0

⁴ 

4 5   5 0

^目

6 。 3 0 . 2   1 0 '   8 5   6 8 . 4   6 0   4 8 . 2   1 0

⁸ 

9 0   7 3

^目

6 8 0   5 5 . 5   C o n t r o l   1 5 . 4   。 1 1 . 1  

Each group c o n s i s t e d   o f   2 0  mice  (ddY)  o r   1 0  mice (CDF

 ，)，

and mice w

巴

r e c h a l l e n g e d  w i t h  5  x 1 0 '  EAC c e l l s   (ddY m i c e )  o r  w i t h  1 0 '   P 3 8 8  (CDF

， 

m i c e )

， 

immediat

巴

l ya f t e r  t r e a t r e n t .   Mice w

巴

r ek e p t  f o r  9 0  d a y s  (ddY m i c e )  o r  6 0  d a y s   (CDF

， 

m i c e ) .   Data were o b t a i n e d  from two s e p a r a t e  e x p e r i m e n t s  and e x p r e s s e d   a s  t h e  mean v a l u e s  o f  two e x p e r i m e n t s  

Table 2 .   C e l l u l a r  respons

巴

si n  t h e  p

巴

r i t o n

巴

a lc a v i t y   Time  T o t a l  c

巴

1 1numbers ，  X  1 0 '  / p e r i t o n e a l  c a v i t y   a f t e r   1 0 '  FK ・ CK 1 0 '  FK.CK

十

HBSS  + 

i n j e c t i o n ， 

h  5X10' EAC  5X10' EAC  B e f o r e  

_1.

8

士

0 . 6

In

J

巴

c t i o n

6  6 . 3

土

0 . 7 1 0 . 2

士1.

2 1 0 . 6

士

2 . 4

1 2   1 0 . 7

士

0 . 6 1 6 . 2

土

2 . 4 1 2 . 5

土

3 . 2

2 4   1 1 . 8

土

O

^目

4 1 6 . 4

士

3 . 6 1 6 . 7

士

2 . 3

4 8   1 2 . 2

土

2 . 2 1 2 . 9

土1.

4 3

1.

5

土

4 . 2

7 2   1 3 . 0

士

2

^目

1 1 3 . 5 : t 2 . 4   3 7 . 3

士

5 . 1

9 6   1 2 . 7

士

2 . 3 1 2 . 9

土1.

1 4 6 . 8

土

6 . 3

1 2 0   1 1 . 5

土

0 . 9 1 1 . 6

士1.

3 5 9 . 6

士

8 . 4

Mice were i n j e c t

^巴

di n t r a p

^巴

r i t o n e a l l yw i t h  1 0 '  FK ・ CK ， 1 0 '  FK.CK p l u s  

5  X  1 0 '  EAC o r  HBSS p l u s  5  X  1 0 '  EAC

， 

s a c r i f i c e d  a t  i n d i c a t

巴

dt i m e s

， 

and 

p e r i t o n e a l   c e l l s   were o b a i n e d  by l a v a g e .   P e r i t o n e a l   c e l l s   y i e l d s   a r e  

p r

巴

s e n t e da s  means

土

SDf o r  5  m i c e  p e r  t i m e  p o i n t  

スの腹腔内注射を行って後採取した

PEC

の

RI

活 性 は 経時的に減少し

1 2 0

時間後には

FK.CK

のみの投与群の それとほぼ等しくなり，

P  3 8 8

細胞は殆ど死滅したもの と考えられる.一方

P3 8 8のみの接種群の PEC

の

RI

活 性は経時的に増加し

1 2 0

時間後には

1 0 ' / m l

の

P3 8 8

の みをウエノレ中で 培養した結果と同程度の値を示し，未処 理マウスの腹腔内に接種した

P3 8 8

はマウス腹腔内で、全

く抑制されずに増殖していることを示された.

3 )

マウス牌細胞の細胞毒性

CDF1 " " "ウ ス の 牌 細 胞 あ る い は PEC

の

N K

活 性 は

YAC‑1

細胞を標的として測定した.

F i g .   2

に示す如く，

PEC

中の

N K

活性は

5日目でピークに達し，その後次第

に減少するが

1 0日以降にもかなりの活性上昇が認めら

。

由 9

o  8 

M 

a i   7 

i  : 

E  2 4  

E  3 

< :   2 

d  。

1~哲 O

^{: : : : : t : . : ‑ / /} ん'・. ^{: : : Q . . . . . . . . . . . . . O . . . . . . . . . . . . . O}  

6 1 2   2 4   48.  3  4  5  H o u r s   D

頃

y s

F i g .   1 .   D i f f e r e n t i a l   c e l l   c o u n t s  o f   h o s t   c e l l s   i n   t h e   p e r i t o n e a l   c a v i t y   a f t e r   i n j e c t i o n   o f   5  X  1 0 '   EAC c e l l s   f o l l o w i n g   1 0 '  FK.CK t r e a t m e n t .   The d a t a   a r e  p r e s e n t e d   a s   PMN  (・‑・)/

mous

巴

X1 0 ' ，  mean

土

SD f o r   5  mice/tim

巴

p o i n t ，  and a s  macrophages (O‑O)/mouse x  1 0 ' ，  mean

士

SDf o r  5  mice/time p o i n t .   PMN  (・…・) and macrophages 

(0

…

0) 

i n  c o n t r o l   mice r e c e i v i n g  HBSS and 5  X 1 0 '  EAC c e l l s .  

れるのに対し，

P  3 8 8

に対する

PEC

の溶解能は

1 8

時間 以内で最高値

( 3 6 . 5

%)を示し数日聞は中等度の上昇が 認められた.Table 4に示す如く抗

a s i a l oG M1

抗体およ び補体により

N K

活性は完全に阻害された叫.

3 .   C .   k u t s c h e r i

菌体内の活性画分

菌体画分の有効性に関しては

Table5

に示す如く，

ddYマウス 1 0

匹づっの腹腔内に

5X10'

個の

EAC

を接 種し，接種直後にそれぞれの画分の表示量を静脈内に注 射し

6 0日間マウスの生死を観察した

その結果

P

画分

100μg/

マウスの投与により半数以上のマウスが生残し

MSTも 2

倍以上に増加した.cw^画分は

250μg/

マウス の投与により

MST

が倍増したにとどまり，

S画分には

殆ど抗種湯性の賦与は認められなかった.

50 

国

40

回〉、

o 

30 

芯 =

i 2 0  

8 

E 

^{1 0}   0

包

. .  

2  3  4  5  Days a f t e r  t r e a l m e n l  

6 

んム一一{

1 0  

F i g .   2 .   C y t o t o x i c  a c t i v i t y  o f  PEC o b t a i n e d  from 1 0 '   FK.CK‑treated mic

巴

t oP388 (0) o r  YAC‑1 

(e) c

e l l s   a s  determined by t h e  4 ‑ h o u r  5 1 C r   r e l e a s

巴

a s s a y(E:  T r a t i o

二

5 0: 

1). 

Data were  o b t a i n e d   from  t h r e e   d i f f e r e n t   e x p e r i m e n t s   and

巴

x p r e s s e d a s   mean

土

SD f o r   t r i p l i c a t e   c u l t u r

巴

s . C y t o t o x i c i t y  o f  HBSS‑induced PEC  i n  c o n t r o l  mic

巴・

4 . 8

土

0.2%t o  Y  AC‑1 c e l l s ，  5 . 4   : t   1 . 1% t o  P388 c e l l s .  

Table 3 .   Measurement o f  P388 growth i n  PEC o b t a i n e d  from mic

巴

i n o c u l a t

巴

dwith FK'CK and P388 c

巴

l l s PEC o b t a i n e d "  

from m i c e   I n c o r p o r a t i o n  o f  [3HJTdR

， 

mean cpm

土

S D / c u l t u r e i n j e c t e d  w i t h   2 4  h  4 8  h  7 2  h 

FK  'CK and P 3 8 8  0 0 ' )   1 4

，

5 0 0

土

3

，

7 2 0

^b

9

，

2 4 0

土

l

，

7 8 0

^b

HBSS and P 3 8 8  0 0 ' )   2 2

，

2 5 0

土

6

，

7 3 0 2 8

，

6 0 0

士

7

，

4 0 0 FK'CK  9 2 0

士

3 4 0 2

，

0 4 0 土 8 7 0 HBSS  7 5 6

土

2 1 4 8 4 0

土

1 8 0

P 3 8 8  00' / w e l l )   4 6

，

5 0 0

士

1 2

，

3 0 0

6

，

2 4 0 土 1

，

0 8 0 ' 3 2

，

5 0 0

士

9

，

4 8 0

3

，

1 8 0

土

1

，

2 6 0 7 1 5

士

2 2 0

1 2 0  h  4

，

2 0 0

土

1

，

1 2 0 ' 4 1

，

5 0 0

土

1 2

，

4 0 0 4

，

0 2 0

士

1

，

8 5 0 7 8 0

土

1 9 0

a .   Mice were c h a l l e

泊

g

巴

dw i t h  1 0 '  P 3 8 8  tumor c e l l s  i n t r a p e r i t o n

巴

a l l yand p e r i t o n e a l  c e l l s  w

巴

r

巴

o b t a i n e dby l a v a g e  a t   i n d i c a t e d  t i m e s .   P

巴

r i t o n e a lc e l l s  OO'/we

ll) 

w

巴

r ec u l t u r

巴

da t  3TC i n  5% CO ，  f o r  1 8  h  and p u l s

巴

dw i t h  1 μ C i  [3HJTdR  d u r i n g  t h

巴

l a s t6  h ，  C u l t u r e  o f  P 3 8 8  tumor c e l l s  ( 1 0 ' / w e

ll) 

s e r v e d  a s  p o s i t i v e  c o n t r o

1. 

D a t a  were o b t a i n e d  from t h r e e   d i f f

巴

r e n texp

巴

r i m e n t sand

巴

x p r e s s e da s  mean 土 SDf o r  t r i p l i c a t e  c u l t u r e s  

b .  

Di

f f e r e n t  from c o n t r o l  (HBSS and P 3 8 8 ‑ i n j e c t e d )  ;  P  <  0 . 0 5  

c .   D i f f

巴

r e n tfrom c o n t r o l  (HBSS and P 3 8 8 ‑ i n j e c t e d )  ;  P く O 。 目 1

寛

七 田

( 1 0 4 )  

原

Table 5 .   Antitumor e f f

巴

c to f

巴

achf r a c t i o n  a f t e r   i n o c u l a t i o n  o f  5  x  1 0 '  EAC c e l l s   Table 4 .   N K   a c t i v i t y  o f  s p l e n i c  nonadherent 

(NA) c e l l s  o f  1 0 '  FK.CK‑treat

巴

dmicea 

S  0

(1

7 . 3 )  

0(1

6 . 8 )   0

(1

6 . 6 )  

0(1

6 . 4 )   0 ( 1 6 . 6 )   S u r v i v a l  r a t e s

， 

%a 

P 

8 5  ( 5 2

^目

3 ) 8 0  ( 4 6 . 7 )   6 5  ( 3 4 . 8 )   3 0  ( 2 8 . 6 )   0 ( 2 0 . 4 )  

Data were o b t a i n e d  from two s e p a r a t

^巴

e x p e r i m e n t sand  e x p r e s s e d  a s  t h e  mean v a l u e  o f  two e x p e r i m e n t s .  S t a t i s t i .   c a l l y  n o t  s i g n i f i c a n t  when s u r v i v a l  r a t e  was 15% o r  l e s s   by F i s h

巴

r ' st e s t  f o r  2  x  2  t a b l e s .   Numbers i n  p a r e n t h e s e s   i n d i c a t e  MST. S u r v i v a l  r a t e  o f  u n t r

巴

a t

巴

dc o n t r o l  g r o u p s   was 0    ， % and MST  was 1 6 . 2  d a y s .  

a .   Groups o f  1 0  m i c e  (ddY) were c h a l l e n g e d  i n t r a p e r .   i t o n e a l l y   w i t h   5  x 1 0 '   EAC c e l l s   and i m m e d i a t e l y   i n j e c t e d  i n t r a v e n o u s l y  w i t h  g r a d e d  d o s

巴

so f  e a c h  f r a c ‑ t i o n .   Mice were k e p t  f o r  6 0  d a y s  

C W   1 0  ( 3 3 . 8 )   0 ( 2 8 . 6 )   0 ( 2 2 . 4 )   0 ( 2 0 . 3 )  

0(1

7 . 4 )   D o s e s  

μg/mouse  2 5 0   2 0 0   1 0 0   5 0   1 0  

C  a l o n e  

a n t i ‑ a s i a l o ‑ G M

1 

+C

^b 

a .   S p l e n i c  n o n a d h e r e n t  c e l l s   e n r i c h e d  by n y l o n  wool  c o l u m n s  ( w e r e  mixed w i t h  

5l

C r ‑ l a b e l e d  P 3 8 8  tumor  c e l l s  ( E :  T r a t i o  

= 

5 0  : 

1). 

Cyt

コ

t o x i c i t ywas measured  by t h e  4  h o u r  Cr r e l e a s

巴

a s s a y . Data was o b t a i n e d   from t h r e e   d i f f e r e n t   e x p e r i m e n t s  and e x p r e s s e d  a s   mean

士

SDf o r  t h r e

^巴

c u l t u r e s

b .   The number o f  e f f e c t o r s  was a d j u s t e d  t o  a c h i

巴

vet h e   E  :  T r a  t i o   o f  5 0  :  1  a f t e r  c

巴lI

sw

巴

r

巴

t r e at e d  wi t h  a n t i  

‑ a s i a l o ‑ G M

1 

and complemen

t. 

c .   S t a t i s t i c a l l y  s i g n i f i c a n t  ( P   <  0 . 0

1) 

by S t u d e n t ' s  t  t e s t

， 

a s  compared w i t h  c o n t r o l s  

P e r c e n t  o f   c y t o t o x i c i t y  

t o  YAC‑l  4 . 8

士

0 . 2 6

^目

2

土1.

3 1 4 . 5 : : ! : 2 . 3 '   1 8 . 4

士

3 . 4 3 6 . 5

土

2 . 9 4 4 . 6

士

2 . 7 4 3 . 2 土 3 . 1 2 . 7

士

0 . 8 Treatment 

Days a f t e r   i n j e c t i o n  

1  ( c o n t r o

J)  1 

3  5  7  9 

C 

MWx  10 3 

66

・

45

醐

3 1 ・ s ‑ A m y l a s e  

b 

2 0 0  

1 0 0   8 0   6 0  

1 0  

1.

0 

Ve/Vo  4 0  

nu  

内'h

回DFVA﹀﹀三

2 0  

E E

そω

音色 コ

E P [

工伺]

n u  4 E E u n u  

1 5   2 . 0  

1 . 0  

a 

EE SN H咽

8 s e o

Z

︿

24 ・

F i g .   3 .   c .   10% SDS‑PAGE o f   CK ・ m i n  t h e  pr

巴

sence o f  2ME. The molecu  l a r   weight  was

巴

s t i . mated u s i n g  t h e  s t a n ‑ dard  molecular  markers 

2 . 0  

F i g .   3 .   b .   The  molecular  w

巴

i g h to f   t h

巴

second peak  was  estimated  using  the  k i t   f o r   molecular‑weight  mark

巴

r(Sigma) 

;β 

amylase  ( 2 0 0 ， 0 0 0 ) ，  bovine serum albumin 

(BSA ;  6 6

，

0 0 0 )   cyto  chrome  C  (Cyt  C; 

1 2

，

4 0 0 ) .   V

巴ニ

E l u t i o n volume ( 7 5  ml

)  ; 

V  0 ニ

void volum

巴

( 4 8ml

) 

1 . 5  

F i g .   3 .   a

^目

Chromatographic separa‑

t i o n  o f  t h e  ammonium‑sulfate‑

p r e c i p i t a t e d   P f r a c t i o n   on a  column ( 2  x 5 5  cm) o f  Sepha‑

c r y l   S‑300  p r e e q u i l i b r a t e d  

with  T r i s ‑ b u f f e r   c o n t a i n i n g  

1 0  m M   MgCl   . ， A 5‑ml f r a c  

t i o n   was c o l l e c t

巴

d ， and  t h e  

o p t i c a l  d e n s i t y  a t  2 8 0  nm 

(0)

， 

and mitogenic a c t i v ‑ i t y  on C3 

H/HeJ s p l e n o c y t e s  

(e) 

were 

m

巴

a s u r e d .

4 .   P

【画分の分離と精製

P

画分中の活性物質は硫安分画と

S e p h a c r y lS ‑ 3 0 0  

のゲノレ繍過によって行った.すなわち硫安

4 0

%飽和の画 分を

T r i s ‑ B

に溶解し

T r i s ‑ B .

で、透析した内液を

Sepha c r y l  S ‑ 3 0 0

のカラム

(2X55cm)

を通過させた.

F i g .   3  a

に示す如く

2 8 0nm

の吸光度により

3

つのピ

6 0 1  

J. 

Con A

^司

a c t i v a t e d

f r

  ^{50f s p}

^刷

^{o c y 蜘}

そ 4ιConA ‑ a c t i v a t e d   宮 4 0 . J ' T c e l l s  

穏

昆 3 0 ' "   2 0  

o  T  c e l l s  

(10

⁶

/ml) 

• s p l e n o c 戸 e s

(10

⁶

/ml) 

庄司 ト

n u 

[工恥

九_、

0 . 9

、

1 1 0   5 0   1 0 0   0 . 5   1 2  5  n g / m l  

f1 g/ml 

C o n c e n t r a t i o n s  0 1  CK. m 

F i g .   4 .   B l a s t o g e n i c   r e s p o n s e s   o f   s p l e n o c y t e s   and  s p l e n i c  T c e 1 1 s   (C 3  H/He

J) 

t o  g r a d e d  d o s e s   o f  CK'm.  C e 1 1 s   ( 2   x  ^{1 05 )  i n   1 0 0 μ} 1  o f   com‑

p l e t e  medium were s t i m u l a t e d  w i t h  an e q u a l   volume o f  CK'm s o l u t i o n  a t   3TC  i n  a  5% CO

， 

i n c u b a t o r  f o r  7 2  h .   Each p o i n t  r e p r e s e n t s  t h

巴

mean v a l u e  o f  f i v e  c u l t u r e s .  

1 0 0  

I 

0 EAC 

VS. 

d d Y  

・ ^{P 3 8 8 v s}

^町

^{C D F 1}

5 0  

ポ

溜

g 

有

a 

^量

^E 

。

1 μ g   1 0 μ g   D o s e s / m o u s e  

0  20  40  6 0  

D a y s  a f t e r   inocul~tion

2 0 μ 9   ト「 1 0 0 μ g  

F i g .   5 .   Antitumor e f f

巴

c to f  CK' m. Groups o f  1 0  mice  were  i n j e c t e d   i n t r a v

巴

n o u s l y w i t h   i n d i c a t e d   d o s e s   o f   CK ・ m immediat

巴

l ya f t e r   i n t r a p e r ‑ i t o n e a l   i n o c u l a t i o n   o f   5  x  ^{1 0 '   EAC c 巴 l 1 st o}  

ddY mouse o r  1 0 '  P388 c e 1 1 s  t o  CDF1  m o u s e .   S u r v i v a l  r a t e  was d

巴

t e r m i n e da t  6 0  days a f t

巴

r i n o c u l a t i o n .   The s u r v i v a l   c u r v e s   o f   CDF1  mice i n o c u l a t

巴

di n t r a v e n o u s l y  w i t h  1 0 '   P388  f o r  10μg and 20μg a r

巴

showni n  t h e  m i d d l e .   The c u r v

巴

f o r 10μg was compared t o   t h e   c o n t r o l  c u r v e  ( P < 0 . 0 5 ) .   Each g r ou p  c o n s i s t ‑

巴

do f  1 0  mic

巴

1 0  

‑'7が認められ，

C3 H/HeJ

マウスの牌細胞に対する

mitogen

活性は第

2

のピークに認められた.この物質の 分子量は，ゲノレ

i

慮過の結果を標準タンパク質のそれと比 較して

3 8

，

0 0 0   ~40 ， 0 0 0

と推定された

( 3b ) .

さらに数回 のゲノレ鴻過によってこのピ‑'7を集め濃縮して

ConA  S e p h a r o s

巴

( P h a r m a c i a )

カラムに吸着させ，

0.3M  a  m e t h y l ‑D‑mannoside

および

0 . 1 5M g a l a c t o s e

で溶出

した. この溶出液を蒸留水に透析し凍結乾燥したものを

CK  • m 

(c. 

k u t s c h e r i

由来の

m i t o g e n )

と命名した. この

CK'm

をさらに

SDS ・ PAGE15)

により分子量を測定した ところ

F i g .3  c

に示す如く約

3 8

，

0 0 0Da

であることが 明かとなった.

5 .   CK'm の mitogenj

舌

1 1

CK'm

の

mitogen

活 性 は

F i g .4

に示す如く

C3H/ 

HeJ

の牌細胞および

T

細胞について検討した結呆，前者 に対しては

1 0ng/ml

から効果が現れ

9 0 0ng/ml

で最高 値を示し，後者に対してはそれぞれ

50ng

および

2μg

で あった なお両者の最高値はそれぞれ

ConA2μg/ml 

に匹敵することが明らかになった.一方

B

細胞に対して は全く作用を現わさなかった.

6 .   CK'm

の抗臆療活性

1) 

CK. m

の同時投与による抗腫蕩活性

CK'm

の量を変量してマウスの静脈内注射を行し、，同 時に

ddY

マウスには

EAC5X10'

個を，

CDF1

マウスには

P  3 8 8  1 0 '

個をそれぞれのマウスの腹腔内に投与し，

6 0  

日間観察してその生残率を算定した.

F i g . 5

に示すよう に 同 種 マ ウ ス

(ddY

対

EAC)

， 同 系 マ ウ ス

(CDF1

対

P 3 8 8 )

ともに

20μg/

マウスの

CK'm

により最大の防御能

Table 6 .   G e n e r a t i o n   o f   t h e   a n t i t u m o r   e f f

巴

c t i n   s p l e n o c y t e s  from CDF1  mic

巴

t r e a t

巴

dw i t h   CK'm 

D a y s  a f t

巴

r A n t i t u m o r  e f f

巴

c t ^a t r e a t m e n t   s u r v i v a l  r a t e ，  %  MST 

‑1  ( c o n t r o

l) 

。 1 0 . 7   2  1 0   1 4 . 6   4  5 5

^b 

2 0 . 8   6  8 0 '   2 5 . 6   1 2   8 5   2 7

^目

4 a .   CDF ，  m i c e  w e r e  i n t r a v e n o u s l y  i n j e c t

巴

dw i t h  20μg o f  

CK  'm ，  a n d  s p l e n o c y t e s  w e r e  o b t a i n e d  a t  i n d i c a t e d  d a y s   G r o u p s  o f  1 0  m i c e  r e c e i v e d  i n t r a p e r i t o n e a l l y  t h

巴

a d m i x

t u r e  o f  1 0

⁷ 

s p l e n o c y t e s  a n d  1 0 '   P 3 8 8  c e l l s .   D a t a  a r e   p r e s e n t e d  a s  t h e  mean s u r v i v a l  r a t e  o f  m i c e  a t  6 0  d a y s   a f t e r   i n o c u l a t i o n   a n d  a l s o   a s   MST o f   m i c e  d y i n g  o f   t u m o r  g r o w t h .   R e s u l t s  a r e  e x p r e s s e d  a s  a v e r a g e  v a l u e   o f  t w o  s e p a r a  t e  e x p e r i m e n t s .  

b .  

Di

f f e r e n t  f r o m  c o n t r o l  ;  P  <  0 . 0 5 .   c

.   D i f f e r e n t  f r o m  c o n t r o l  ;  P  <  0  . 0 1  

( 1 0 6 )  

原 田 七 寛

が認められた.

2 )   CK' 

m投与による抗腫蕩作用発現に要する日数

CDF

1マウスの静脈内に

20μg/

マウスの

CK ・ m

を投 与し，

Table 6

に示す日数の後，牌細胞を採取しその

1

0' 個と

P3 8 8  1 0

⁶個を混合して

CDF

1" ウスの腹腔内に接 種し

6 0日間観察して生残率および MSTを算定した.表

示する好く，

CK ・

mの投与

6

日後にその牌細胞における 有意の抗腫虜能の発現が，処置マウスにおける生存率の 上昇および

MSTの延長によって確認された.

3 )抗腫湯性に関与する細胞

CK' m20μg

を投与後

1 0日目の CDF

1" ウスの牌細 胞を採取し，

Table 7

に示す各種の抗体および補体処理 を行って後

Winn

試験により牌細胞中の抗腫濠能に関 与する細胞を同定した.すなわち抗体補体処理後の牌細 胞

1 0

⁷個と

P3 8 8  1 0

⁶個を混合し直ちに

CDF

1" ウスに腹 腔内注射を行い

6 0日後のマウスの生残数から抗 L3T4

と補体処理に感受性のある細胞が

e f f

巴

c t o rc e l l

であっ

T こ.

7

^目

CK'm

の化学組成

Table 8  ~こ示す如く， CK'm

の活性はトリプシン処 理，酸処理(

p

日のあるいはアルカリ処理(pH1

2 )

により 完 全 に 失 活 し ， 一 方

RNase

処 理 あ る い は 熱 処 理

( 1 0 0 " C 3 0

分〉には耐性であった.

考 察

P .   a c n e s  

(c. 

paruvum)

が強力な

immunomodulator

であることはよく知られていることであり，種々の動物 の腫蕩系に対する抗腫疹効果，さらには臨床応用に関し でも研究が行われている16)

C .   k u t c h e r i

は 元 来 あ る 条 件 下 で の マ ウ ス に

ps

巴

udotub

巴

r c u l o s i sを惹起する原因菌として知られて

いる菌である.本教室で本菌が分離同定された際にも，

この菌の生菌

5x10

⁸個を腹腔内注射した際にみられる 病理組織像，特に

RES

臓器のそれは免疫担当細胞を強

く刺激していることを示すものであった.

著者の実験においても，

FK ・ CK

の投与により

ddY

対

EAC

あるいは

CDF

1対

P3 8 8

の組合せにおいて著明な 抗腫蕩性が賦与されることを明らかにしている.ddYマ ウスに

FK'CKと EAC

を同時に腹腔内注射した場合の

PEC

の組成は，

6

時間後では

PMNが大部分であり 4日

後にはその関係が逆転しているが

EAC

の増加は認めら れなかったのに対して

EAC

のみの注射

4日目に認めら

れる

PEC

の 増 加 は す べ て

EAC

によるものであり，

PNM

もマイクロブァージもともに全く増加していなか った事から，その強い抗腫男性は食細胞によるものと思

Tabl

巴

7

^目

E f f e c t o r c e l l s   i n   t h e   antitumor  e f f e c t   i n

^同

duced by CK ・ m a s  d

^巴

terminedby t h e  Winn  t e s t  

Treatment  Winn a s s a y '   o f  

s p l e n o c y t e s  

^巴

x p .1  e x p .  2  A n t i ‑ L y t  2  Ab+C  7 / 1 0

^b 

9 / 1 0   A n t i ‑ L  3  T  4  Ab+C  1 / 1 0   。 ^{/ 1 0}

A n t i ‑ a s i a l o  GM

1 

Ab

十

C 7 / 1 0   7 / 1 0   A n t i ‑ m a c r o p h a g e s  Ab

十

C 7 / 1 0   7 / 1 0   9 / 1 0   8 / 1 0   C o n t r o l  g r o u p   0 / 1 0   。 ^{/ 1 0}

a .   Winn a s s a y  e x p r e s s e d  a s  number o f  s u r v i v o r s / n u m b e r   o f   mice t e s t e d .   S p l e e n   c e l l s   o b t a i n e d   1 0  d a y s   a f t e r   t r e a t m e n t  w i t h  20μg o f   CK'm were t r e a t e d  w i t h  i n ‑ d i c a t e d   a n t i b o d i e s   and  complement; 1 0

⁶ 

P 3 8 8   tumor  c e l l s  were admixed w i t h  1 0 '  t r e a t e d  e f f e c t o r s  and imme‑

d i a t e l y  i n j e c t e d  i n t r a p e r i t o n e a l l y  i n t o  n a i v e  CDF 

1 

m i c e   ( 1 0  m i c e / g r o u p ) .   The number o f  s u r v i v o r s  was d e t e r   mined a t  6 0  d a y s  a f t e r  i n o c u l a t i o n .  

b .   P

く

0 . 0 1

，a

s   d e t e r m i n e d   by  F i s

、

h

町

t e s t f o r   2  x  2  t a b l e s .  

Table 8 .   Biochemical  p r o p e r t i e s   o f   t h e   mitogenic  and antitumor a c t i v i t i e s  o f  CK'm  Treatment  B i o l o g i c a l  a c t i v i t i e ; :  

m i t o g e n i c i t y '   a n t i t u m o r  e f f e c t

^b 

None  5 2 . 1 2 6

士

3

，

4 5 2 9 0  ( 5 6 . 4 )   RNas

巴

5 3

，

0 1 7 土 2

，

1 3 8 8 5  ( 5 0 . 6 )   T r y p s i n   1

，

1 3 4

士

2 1 4

日

06.8) 1 0 0 " C

， 

3 0  min  4 7

，

3 7 8 土 2

，

6 4 9 8 0  ( 4 8 . 8 )   pH 2  6

，

5 3 6

士

1

，

2 0 8 。 ^06.4)

pH 1 2   1

，

1 1 8 土 8 6 3 。 ^05.5)

a .   As d e t

巴

rmined by  i n c o r p o r a t e d   [3HJTdR  a f t e r   a  7 2 ‑ h o u r ‑ c u l t u r e   o f   C  3  H/HeJ  s p e n o c y t e s   (2 x 1 0

5/ 

w e l l )   w i t h   5 0 0  ng/ml o f   t r e a t e d   CK  ' m .   Data were  o b t a i n e d  from two s e p a r a t e  e x p e r i m e n t s .   R e s u l s t  a r e   e x p r e s s e d   a s   mean

土

SEf o r   6  c u l t u r e s .   C u l  t u r e s   o f   s p l

巴

n o c y t e sw i t h  Con A (2μg/ml :  5 3

，

4 2 6 土 4

，

6 3 5 ;c u l ‑ t u r e s  o f  s p l e n o c y t e s  w i t h o u t  s t i m u l a t

巴

d :8 5 6

士

2 3 2 ) b .   As d e t e r m i n e d  by t h

巴

s u r v i v a lr a t e s  o f  ddY m i c e  i n j e c t ‑

巴

dw i t h  20μg o f  t r

巴

a t e dCK"m a f t e r  an i n t r a p e r i t o n e a l   i n o c u l a t i o n  o f  5  x  1 0

⁶ 

EAC.  Each g r o u p  c o n s i s t e d  o f  1 0   m i c e .   Data were o b t a i n e d  from two s

巴

p a r a t ee x p e r i .   m e n t s .   R e s u l t s  a r

巴

e x p r e s s e da s  t h e  mean o f  two e x p e r i   m e n t s .   Numbers i n  p a r

^巴

n t h e s e si n d i c a t e  MST ( d a y s )  

われる.この

i nv i v o

の所見と平行して ，

i n   v i t r o

でも

FK'CK

処理をした

CDF

1マウスの

PEC

は

P3 8 8

の増殖 を強力に抑制していることが示された.さらに

FK.CK

処理マウス

(CDF

1)の

PEC

の細胞毒性は

P3 8 8

に対して は

1 8

時間以内でピーク に達し，以後次第に減少するが数 日聞はかなりの活性を持続していた.一方

N K

活性は

3

日目より上昇し

5

日目にピークに達し，以後次第に減少 しているパターンから考えて，

FK ・ CK

処理によっても