クロマチン免疫沈降法クロマチン免疫沈降 ChIP 法は細胞のクロマチン中のタンパク質 DNA相互作用を調べる強力かつ汎用性の高い手法です 1,2 この手法は特定のゲノム領域と関係している複数のタンパク質の同定やまた逆にある特定のタンパク質に関係している多くのゲノム領域の同定に使用され

(1)

2 クロマチン免疫沈降法

3 New SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit

4 CST

社キットを用いたマウス組織の

ChIP

アッセイ

5 ヒト大腸がん細胞株

HCT116

を用いた

p53

の

ChIP

解析

6 酵素によるクロマチン断片化の最適化

7 よくあるお問い合わせ

クロマチン免疫沈降

（

ChIP

）

SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit

(2)

一般的に、ChIPで得られたDNAはスタンダードまたは定量的PCRで分析します。その他、ChIPアッセイを、シークエンシング（ChIP-seq）、ゲノムタイリングマイクロアレイ（ChIP-on-chip）法、クローニング法などと組み合わせ、タンパク質–DNA相互作用やヒストン修飾をゲノムレベルで解析することもできます（5–8）_。可溶化後、クロマチンを酵素/ ソニケーションで断片化します。ヒストンや非ヒストンタンパク質特異的抗体と

Protein G Agarose/Magnetic Beadsを

用いて免疫沈降します。ヒストンや非ヒストンタンパク質とDNAをクロスリンクするために、細胞や分離組織をホルムアルデヒドで固定します。脱クロスリンク後、DNAを分析用に精製します。

PCR primers are speciﬁc for the transcriptionally active GAPDH and c-Myc genes and the inactive Myt1 gene. Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4)(C42D8) Rabbit mAb #9751 Acetyl-Histone H3 (Lys9/Lys14) Antibody #9677 Rpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629 Normal Rabbit IgG #2729

signal relative to input

30 25 20 15 10 5 0

signal relative to input

0.8 0 1 0.9 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 TCF4 (C48H11)

Rabbit mAb #2569 β-Catenin Antibody#9562

Normal Rabbit IgG #2729

PCR primers are speciﬁc for known TCF4 binding sites in the CAMK2D and c-Myc genes, and a region of the Myt1 gene that does not contain a TCF4 binding site. GAPDH SimpleChIP® GAPDH Competitor c-Myc SimpleChIP® c-Myc Competitor Myt1 SimpleChIP® Myt1 Competitor CAMK2D SimpleChIP® CAMK2D Competitor 1500 1000 700 500 400 300 200 100 1 2 base pairs

クロマチン免疫沈降法

酵素消化

vs.

ソニケーション処理

クロマチン免疫沈降（

ChIP

）法は、細胞のクロマチン中のタンパク質

–DNA

相互作用を調べる、強力かつ汎用性の高い手法で

す

（1,2）

_{。この手法は、特定のゲノム領域と関係している複数のタンパク質の同定や、また逆に、ある特定のタンパク質に関係}

している多くのゲノム領域の同定に使用されます

（3-6）

_。また、

_ChIP

_{アッセイは、特定のタンパク質}

_–DNA

_{相互作用の空間的、}

経時的関係を明確にするのにも使用されます。例えば、様々なタンパク質因子を遺伝子プロモーターに動員する順序の確定

や遺伝子の活性化における遺伝子座全体の特定のヒストン修飾の相対量を「測定」するのに使用できます

（3,4）

_{。ヒストンタン}

パク質の他、転写因子および転写補因子、

DNA

複製因子、

DNA

修復タンパク質の結合の解析にも使用可能です。

Background References

1. Orlando V (2000) Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25(3), 99–104. 2. Kuo MH. et al. (1999) In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods 19(3), 425–33. 3. Agalioti T. et al. (2000) Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription factors to the IFN-beta promoter. Cell 103(4), 667–78.

4. Soutoglou E. et al. (2002) Coordination of PIC assembly and chromatin remodeling during differentiation-induced gene activation. Science 295(5561), 1901–4. 5. Mikkelsen TS. et al. (2007) Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature 448(7153), 553–60.

6. Lee TI. et al. (2006) Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell 125(2), 301–13.

7. Weinmann AS. et al. (2002) Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods 26(1), 37–47. 8. Wells J. et al. (2002) Characterizing transcription factor binding sites using formaldehyde crosslinking and immunoprecipitation. Methods 26(1), 48–56.

ChIP

アッセイでは、細胞内のタンパク質

–DNA

相互作

用を固定、あるいは「保持」する可逆的なタンパク質

–

DNA

架橋剤であるホルムアルデヒドで細胞をまず固定

します（左図参照）

（1,2）

_{。次に、細胞をすすぎ、ソニケ}

ーションか酵素消化によりクロマチンを断片化して、

特定のタンパク質あるいはヒストン修飾に特異的な抗

体を用いてクロマチンを免疫沈降します。目的のタン

パク質やヒストン修飾に関連する

DNA

配列は、クロス

リンクしたクロマチン複合体の一部として共沈降し、

この過程で

DNA

配列の相対量が増加します。免疫沈降

後にタンパク質

–DNA

を脱クロスリンクし、

DNA

を精

製します。この

DNA

配列の濃縮物をさまざまな手法で

解析することができます。

酵素消化は、ソニケーションより穏やかにクロマチンを断片化しますので、クロマチンとエピトープを傷つけず、免疫沈降の効

率を向上させます。

免疫沈降効率の向上により、

DNA

に結合したタンパク質の検出能が高くなります。

標的

DNA

の検出効率の向上により、試料、時間、試薬の無駄を省けます。

酵素消化は、転写因子や補因子と結合した

DNA

を検出するのに不可欠な、低いバックグラウンドで高い感度を実現します。

酵素消化（

SimpleChIP®

）したクロマチンを用いると、 ソニケーション処理（

Competitor

）だけのクロマチンよりも良好な結果が得られます。 酵素消化（

Lane 1

）とソニケーション法 （

Lane 2

）を採用している

ChIP

キットを 用いて、クロマチンを断片化しました。

(3)

種交差性希望納入価格

#9004S SimpleChIP

®_{Plus Enzymatic}

Chromatin IP Kit (Agarose Beads) H, M,

R, Mk 101,000円 #9005S SimpleChIP

®_{Plus Enzymatic}

Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) H, M,

R, Mk 114,000円

SimpleChIP®_{Plus Enzymatic Chromatin} IP Kit (Agarose Beads) #9004: Mouse

brain and mouse liver tissue were prepared and disaggregated into a single-cell suspension using a Dounce homogenizer and tissue disaggregator, respectively. The cells were then formaldehyde-crosslinked and chromatin was prepared and digested. DNA was puriﬁed and separated by electrophoresis on a 1% agarose gel and stained with ethidium bromide. The majority of chromatin from both brain (lane 1) and liver (lane 2) was digested to 1 to 5 nucleosomes in length (150 to 900 bp). 200 100 300 400 500 600 700 800 900 1000 1200 1500 1 2

組織サンプルでの競合比較

免疫沈降して得られた

DNA

のインプットクロマチンに対する値をグラフにしました。

#9005 SimpleChIP® Plus Enzymatic

Chromatin IP Kit (Magnetic Beads)

が、競合製品に比べてシグナルの増幅が顕著かつ高感度であることが実証されました。

CST

の新しい

SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP

キットは、培

養細胞や組織サンプルの内在性レベルのタンパク質

–DNA

相互作用を検

出するのに最適です。

CST

はクロマチンの断片化に酵素消化を採用して

おり、キットには酵素消化

–

クロマチン免疫沈降

（

ChIP

）実験を、細胞や

組織サンプルで迅速かつ簡便に行うために必要な全ての試薬が含まれて

います（

ChIP

アッセイ

30 回分）

。また、ポジティブとネガティブコント

ロールも含まれ、プロテイン

G

アガロースビーズ（

#9004

）およびプロテ

イン

G

磁気ビーズ（

#9005

）のキットをご用意しています。

0.1 0.05 0.15 0.2 0.25

Signal relative to input

Histone H3 (D2B12) XP®_{Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620} Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb #9733 Acetyl-Histone H3 (Lys9) (C5B11) Rabbit mAb #9649 Rpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629 Normal Rabbit IgG #2729

GAPDH RPL30 HoxA1 HoxD10

0 0.004 0.002 0.006 0.008 0.01 0.12

Ezh2 (D2C9) XP® Rabbit mAb #5246 SUZ12 (D39F6) XP®

Rabbit mAb #3737 RING1B (D22F2) XP®_{Rabbit mAb #5694} Normal Rabbit IgG #2729

GAPDH RPL30 HoxA1 HoxD10

0

SimpleChIP®_{Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004: Mouse}

brain was prepared and disaggregated into a single-cell suspension using a Dounce homogenizer. The cells were then cross-linked with formaldehyde, and chromatin was prepared and digested. Chromatin immunoprecipitations were performed using the indicated ChIP-validated antibodies. Puriﬁed DNA was analyzed by quantitative real-time PCR using SimpleChIP®_{Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986, SimpleChIP}®_Mouse

RPL30 Intron 2 Primers #7015, SimpleChIP®_{Mouse HoxA1 Promoter Primers #7341, and}

SimpleChIP®_{Mouse HoxD10 Intron 1 Primers #7429. The amount of immunoprecipitated}

DNA in each sample is represented as signal relative to the total amount of input chromatin (equivalent to 1).

SimpleChIP®_{Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic beads) #9005 (A) compared to a competitor’s sonication-based Tissue Chromatin IP kit (B). Mouse liver was prepared and disaggregated}

into a single-cell suspension using a tissue disaggregator. The cells were then cross-linked with formaldehyde, and chromatin was prepared and digested according to manufacturer’s recommendations. Chromatin immunoprecipitations were performed using the indicated ChIP-validated antibodies. Puriﬁed DNA was analyzed by quantitative real-time PCR using SimpleChIP®_{Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986, SimpleChIP}®_Mouse

AFM Intron 2 Primers #7269, SimpleChIP®_{Mouse HoxA1 Promoter Primers #7341, and SimpleChIP}®_{Mouse HoxD10 Exon 1 Primers #7429. The amount of immunoprecipitated DNA in each sample is represented as}

signal relative to the total amount of input chromatin (equivalent to 1).

0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

GAPDH AFM HoxA1 HoxD10

0

Histone H3 (D2B12) XP®

Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb #9733 Acetyl-Histone H3 (Lys9) (C5B11) Rabbit mAb #9649 Rpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629 Normal Rabbit IgG #2729

0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03

Ezh2 (D2C9) XP®_{Rabbit mAb #5246} SUZ12 (D39F6) XP®_{Rabbit mAb #3737} RING1B (D22F2) XP®_{Rabbit mAb #5694} PCAF (C14G9) Rabbit mAb #3378 Normal Rabbit IgG #2729

GAPDH AFM HoxA1 HoxD10

0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

GAPDH AFM HoxA1 HoxD10

Histone H3 (D2B12) XP®

Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb #9733 Acetyl-Histone H3 (Lys9) (C5B11) Rabbit mAb #9649 Rpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629 Normal Rabbit IgG #2729

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03

GAPDH AFM HoxA1 HoxD10

Ezh2 (D2C9) XP® Rabbit mAb #5246 SUZ12 (D39F6) XP® Rabbit mAb #3737 RING1B (D22F2) XP® Rabbit mAb #5694 PCAF (C14G9) Rabbit mAb #3378 Normal Rabbit IgG #2729

A

SimpleChIP

®

_{Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic beads) #9005}

_B

_{Competitor’s Sonication-based Tissue ChIP Kit}

New

SimpleChIP

®

Plus

Enzymatic Chromatin IP Kits

細胞と組織サンプルに最適化した、詳細かつサンプル量に応じて試薬量を簡

単に調整できるプロトコールをご提供しますので、貴重な時間と試薬を無駄

にしません。

全ての試薬と適切な実験コントロールが含まれ、経済的です。

キットは

CST

の

ChIP

用抗体の規格試験で使用しており、最適化する手間を省け

ます。

キット（

#9005

）に含まれる

ChIP

グレードの磁気ビーズ（

#9006

）は、高感度

かつ低バックグラウンドなので、

ChIP-on-chip

や

ChIP-seq

に最適です。

キットを開発・製造している研究者による、的確かつ迅速な技術サポートを

ご提供いたします。

(4)

図

1. DNA

断片化の解析

K:

腎臓

, L1 & L2:

肝臓

図

2. 抗体による標的領域の特異的な濃縮

使用製品

試験研究用

#9005

：

SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit

（

Magnetic Beads

）

CST

社キットを用いたマウス組織の

_ChIP

アッセイ

結論

CST

社

SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) (#9005)

を用いて、組織サンプルから安定

したクロマチン断片化を行うことができた。また、

Histone H3

抗体によるゲノム

DNA

濃縮を確認した。キットに添付

の抗体とプライマーによって実験の成否を確認できるため、適切に実験系を構築できたか評価することができた。次回

以降も本キットを使用する予定である。

結論

結

資料提供：東京大学大学院医学系研究科疾患生命工学センター健康環境医工学部門相田圭子先生、吉岡亘先生

プロトコール

マウス腎臓ならびに肝臓を用いて、

CST

社キット（

#9005

）に付属の抗

Histone H3

抗体とプライマーを用いて

ChIP

アッ

セイを行った。

1. サンプル

C57BL/6

系統マウス腎臓ならびに肝臓（それぞれ

35 mg

）

2. ChIP

アッセイ

CST

社プロトコールに準じた。

Mince

した組織サンプルを入れる容器に関しては、プロトコール推奨の

15 mL

のコニカルチューブではサンプルの

ロスが大きいという問題が生じたため、

2 mL

チューブを用いた。核膜の破砕は、

Bioruptor

を用いて行い、破砕の

程度を光学顕微鏡で確認した。

結果

クロマチンの断片化と濃度の分析を行ったところ、

100-500 bp

に断片化され（図

1 ）、精製した

DNA

濃度は腎臓が

150 μg/mL

、肝臓は

250 μg/mL

であった。クロマチン断片化の程度はアッセイ間でばらつきが少なかった。

添付の抗体（ポジティブコントロール

Histone H3

とネガティブコントロール

Rabbit IgG

）で免疫沈降し、添付のプライ

マー

RLP30

で

qPCR

を行ったところ、ポジティブコントロール特異的な増幅がみとめられた（図

2 ）。

プロ

ロ

プ

結果

結

(5)

Micrococcal Nuclease

量

ChIP Result;

定量的

PCR

（

n=1

）

p53-binding p21 promoter

RPL30

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

relative amount of DNA

(target/Input) p53WT p53KO α-p53 α-Histone lgG 20 24 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

relative amount of DNA

(target/Input) p53WT p53KO α-p53 α-Histone lgG HCT116細胞のp53WT細胞とp53KO細胞におけるp21 promoterへのp53のリクルートメントを検討した実験。 p53WT細胞では、p21 promoterへのp53の結合が認められる。p53KO細胞では、p53の結合が引き起こされていない。一方、 p53の結合がないRPL30遺伝子に対しては、どちらの細胞においてもp53の結合は観察されていない。なお、どちらの細胞

（p53WTとp53KO）および標的遺伝子（p21とRPL30）においても、 Histone H3抗体によるHistoneタンパク質の集積が認め

られ（Positive Control）、Normal Mouse IgGによっては、バンドが検出されていない（Negative Control）ことから、実

験はうまくいっていると思われる。この検討により、DNAの断片化が成功していることを確認した。（p53KO-HCT116細胞） M: Size marker 0.5 μL：加えたMicrococcal Nucleaseの量 1000 (bp) M 0.5 μL 500 300 200 100

使用製品

試験研究用

#9005

：

SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit

（

Magnetic Beads

）

ヒト大腸がん細胞株

_HCT116

を用いた

_p53

の

_ChIP

解析

結論

今回、内因性

p53

の標的遺伝子に対する結合活性を

SimpleChIP® Plus Kit

を用いて行った。

p53

を欠損した

p53KO-HCT116

細胞と対比させて検討することで、検出している

PCR

増幅に間違いがないことを確認できた。私たちは、本

Kit

が、

in vivo

サンプルにおいても使用可能であることを確認しており、

in vitro

、

in vivo

の用途を問わない点が優れてい

ると感じた。また、

ChIP

反応は、

Magnetic Beads

を用いて行うため、簡便で操作性もよく、非特異的産物を減少させ

ることができるためよかった。

結論

結

資料提供：熊本大学大学院薬学教育部遺伝子機能応用学分野福田亮介様、首藤剛先生

プロトコール

CST

社

#9005 SimpleChIP® Plus Kit

に添付の推奨プロトコールに従って行った。

※定量的

PCR

の方法、反応組成は異なる

1. それぞれ

p53

遺伝子を有するまたは欠損するヒト大腸がん細胞株

p53WT-HCT116

または

p53KO-HCT116

から、

8 ×

10

6

個の細胞を準備し、

Micrococcal Nuclease

溶液

0.5 μL

を加え、

37 ℃で

20 分間クロマチンを消化した。

2. DNA

を精製後、アガロースゲル電気泳動によりクロマチン

DNA

のサイズを確認した。

3. クロマチン調製液（

2.6 μg/ChIP

）と

p53

に対するマウスモノクローナル抗体（

#2524S

）、

Histone H3

に対する抗体

（

Kit

に添付）

（

Positive Control

）および

Normal Mouse IgG

をそれぞれ

2 μg

を用いて

ChIP

を行った（

4 ℃、

Rotation

下で、

14 hr

）。

4. p53

の標的遺伝子

p21

のプロモーター領域、

p53

の標的でない

RPL

遺伝子領域（

Negative Control

）に対するプライ

マーを用いて定量的

PCR

解析を行い、得られた結果をもとに、

Relative amount of DNA (Target/Input)

を算出し、

グラフを作成した。

結果

プロ

ロ

プ

結果

結

(6)

酵素によるクロマチン断片化の最適化

クロスリンクされたクロマチン

DNA

を

150-900 bp

の長さに断片化するための最適条件は、使用する細胞数や組織量に

対する

Micrococcal Nuclease

の量に大きく依存します。下記は、特定の組織や細胞タイプでクロマチン断片化の最適

条件を決定するためのプロトコールです。

1. CST

推奨プロトコール（

#9005

または

#9004

）の

Section I

、

II

、

III

に従い、組織

125 mg

あるいは

2 ×

10

7

_{個の細胞を用いてク}

ロスリンクされた細胞核を調製してください。

Section III

のステップ

2. を行った後、下記に進んでください。

2. 細胞核調製液

100 μL

を

1.5 mL

遠心用チューブ

5 本に分注し、氷上に置いてください。

3. Micrococcal Nuclease 3 μL

を

1 ×

Buffer B + DTT

混合液

27 μL

に加えてください（酵素を

10 倍に希釈します）。

4. ステップ

2. の各チューブに、希釈した

Micrococcal Nuclease 0 μL

、

2.5 μL

、

5 μL

、

7.5 μL

、

10 μL

を加え、チューブを数

回転倒混合し、

37 ℃でよく混ぜ合わせながら、

20 分間インキュベートしてください。

5. 0.5 M EDTA 10 μL

を加えることで断片化を停止し、チューブを氷上に置いてください。

6. 13,000

rpm

、

4 ℃で

1 分間遠心して細胞核を沈澱させ、上清を除去してください。

7. 細胞核を

1 ×

ChIP Buffer + Protease Inhibitor Cocktail

混合液

200 μL

に再懸濁し、氷上で

10 分間インキュベートしてくだ

さい。

8. 溶解物を数回超音波処理し、核膜を破砕してください。超音波処理の合間は、サンプルを氷上で

30 秒間インキュベートして

ください。細胞核を完全に溶解するための最適条件は、超音波処理の前後に光学顕微鏡でサンプルを観察することで決定で

きます。

VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator

を

6 に設定し（

1/8-inch probe

）、

20 秒間の超音波処理

を

3 回行うことで、

HeLa

細胞核は完全に溶解されます。

Dounce homogenizer

で

20 回処理を行っても細胞核は溶解されま

すが、完全な溶解でない可能性があります。

9. 10,000

rpm

、

4 ℃で

10 分間遠心し、溶解物を浄化してください。

10. 超音波処理した各溶解物

50 μL

を新しい遠心用チューブに移してください。

11. 各サンプル

50 μL

に、

nuclease-free water 100 μL

、

5 M NaCl 6 μL

、

RNAse A 2 μL

を加えてください。ボルテックスして、

37 ℃で

30 分間インキュベートしてください。

12. RNAse

A

で処理した各サンプルに、

Proteinase K 2 μL

を加えてください。ボルテックスして、

65 ℃で

2 時間インキュベート

してください。

13. 100 bp DNA

マーカーとともに、各サンプル

20 μL

を

1%

アガロースゲルで電気泳動し、

DNA

フラグメントサイズを測定し

てください。

14. DNA

サイズ

150-900 bp

（ヌクレオソーム

1-5

個）が得られた断片化の条件を確認してください。本プロトコールで目的サイ

ズの

DNA

フラグメントを産出した希釈した

Micrococcal Nuclease

の量は、目的サイズの

DNA

フラグメントを得るために

1 回分の免疫沈降調製液（分離組織

25 mg

あるいは

4 ×

10

6

_{個の細胞）に加える}

_{Micrococcal Nuclease}

_{ストック量の}

₁₀

_倍とな

っています。例えば、本プロトコールで希釈した

Micrococcal Nuclease 5 μL

が

150-900 bp

の

DNA

フラグメントを産出し

たとすると、

CST

推奨

ChIP

プロトコールの

Section III

において、

0.5 μL

の

Micrococcal Nuclease

ストックを免疫沈降

1 回分

の調製液に加えてクロマチンを断片化することになります。

15. 目的サイズの

DNA

フラグメントが得られなかった場合は、

Micrococcal Nuclease

の量を調整しながら本プロトコールを繰

り返してください。または、クロマチン断片化の時間を調整することで

DNA

フラグメントサイズを最適化することができま

す。

(7)

SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP

キットを

ChIP-seq

に使えますか？

はい、

#9005 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic

Beads)

は、

ChIP-seq

にご使用いただけます。

#9005

に含まれるプロテイン

G

磁気ビーズ（

#9006

）には

salmon sperm DNA

のような

DNA

ブロッキング試薬を添加していないので、シークエンシングにおけるコンタミネーションの心配はありません。

なぜ酵素消化はソニケーションによるクロマチン断片化より優れ

ているのですか？

ソニケーションはよく使われているクロマチン断片化の方法ですが、出力のばらつきやソニケーション中のクロマチンサンプルの乳化など、多くの問題が確認されています。ソニケーションが不足するとクロマチンの断片化が不十分ですし、やり過ぎやサンプルの乳化はタンパク質の変性と分解を引き起こし抗体エピトープが失われてしまいます。

CST

では培養細胞を用いて酵素消化とソニケーションの比較実験を行い、酵素消化がソニケーションより穏やかにクロマチンを断片化し、

ChIP

アッセイにおける免疫沈降効率を劇的に向上させることを確認しました。組織サンプルを用いた検討でも、同様の結果が得られています。

細胞数や組織量によってクロマチン消化に使用する

Micrococcal

Nuclease

の量を調整する必要がありますか？

クロマチン調製に使用する細胞数あるいは組織量を測定することは大変重要です。

CST

では、各クロマチン免疫沈降反応

1

回ごとに

4

×

10

6_{個の細胞あるい} は

25 mg

の組織を使用することをお薦めしています。組織サンプルは、酵素消化前にクロスリンクして単細胞懸濁液にします。クロマチン消化に用いる

Micrococcal Nuclease

量と細胞数の比率は、クロマチンを適正サイズ（

150-900 bp

）に断片化するのに重要です。この比率は細胞や組織の種類によって若干異なりますが、

4

×

10

6_{個の細胞（あるいは}

_{25 mg}

_{の組織）に対し、}

Micrococcal Nuclease 0.5 μL

の割合がクロマチン消化に最適で、かつ再現性の高いことが社内試験から分かっています。

なぜ

Micrococcal Nuclease

によるクロマチン消化に加えソニケ

ーションが必要なのですか？

各

IP

ChIP

反応

1

回につき、

2-5 μg

の抗体で始めることをお薦めします。

磁気ビーズとアガロースビーズではどちらが良いですか？

SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP

キットにはプロテイン

G

アガロースビーズ（

#9004

）およびプロテイン

G

磁気ビーズ（

#9005

）のキットをご用意しています。両ビーズの比較実験では、どちらも低バックグラウンドで特異的結合を示しています。アガロースビーズは従来より

IP

で用いられるビーズですが、磁気ビーズはより利便性の高いビーズです。磁気ビーズは磁石側のチューブ側面に付着するので、洗浄バッファーの吸引除去時にロスがなく、遠心分離も必要ありません。ただし、

#7017 6-Tube Magnetic Separation

Rack

などが必要です。

磁気ビーズは

DNA

でブロッキングしていないため、

ChIP-seq

にご使用いただけます。アガロースビーズは、バックグラウンドを軽減するためにソニケーションした

salmon sperm DNA

でブロッキングしているため、ハイスループットシークエンシングにおいてブロッキング

DNA

が配列読取りに影響を与えます。 1500bp 1 2 1000bp 700bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp

よくあるお問い合わせ

SimpleChIP

®

(8)

組織サンプルでも培養細胞でも！

酵素消化を採用した新

ChIP

キット

Over 140 ChIP Validated Antibodies

CST

は、他のアプリケーションと同様に

ChIP

用抗体にも厳格な品

質基準を定め、厳しい規格試験を実施しています。最新の

ChIP

用

抗体リストは、ウェブでご確認ください。

www.cstj.co.jp/technologies/chip.php

SimpleChIP® Control PCR Primers

#9005S SimpleChIP®_{Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads)} _114,000

希望納入価格 (円)

#8980S SimpleChIP®_{Stem Cell Master Regulator Assay Kit} _126,000

#8982S SimpleChIP®_{Human Bivalent Promoter Assay Kit} _105,000

#8981S SimpleChIP®_{Mouse Bivalent Promoter Assay Kit} _105,000

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Enzymatic Chromatin IP Kits

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