平成 17 年度研究報告
研究テーマ
内分泌撹乱物質感受性と精子形成障害および男
児外陰部異常症：エストロゲン受容体α型遺伝
子のハプロタイプ解析
－ 内分泌撹乱物質感受性ハプロタイプの同定 －
国立成育医療センター研究所
部長 緒方 勤
現所属：国立成育医療センター研究所 小児思春期発育研究部
✻ サマリー ✻
近年、男児外陰部異常症を含む男性性機能低下の発症頻度が増加し、その原因として、 内分泌撹乱物質の影響が推測されている。特に大多数の内分泌撹乱物質がエストロゲン 様作用を発揮すること、エストロゲン様作用が男児外陰部異常症を含む男性性機能低下 症を発症させうることから、内分泌撹乱物質のエストロゲン様効果が重要な役割を果た していると推測される。 このエストロゲン様効果は、内分泌撹乱物質の暴露量や暴露時期のみならず個体の感受 性にも支配されると考えられる。そして、ほとんどの内分泌撹乱物質のエストロゲン様 効果がエストロゲン受容体を介すること、エストロゲン受容体αとβのうち、エストロゲ ン受容体αの異常が内分泌異常を呈することから、エストロゲン受容体α遺伝子（ESR1） の変動が個体感受性に密接に関与すると推測される。 われわれは、男児外陰部異常症の代表である停留精巣をモデルとして、内分泌撹乱物質 にたいして高感受性を有する男児が停留精巣を呈しやすいという作業仮説のもとに ESR1 のハプロタイプ解析を行い、既にエストロゲン受容体α遺伝子（ESR1）の特定ハプロタ イプのホモ接合性が停留精巣に相関することを報告した。これは、内分泌撹乱物質のエ ストロゲン様効果がエストロゲン受容体を介して発揮されることから、内分泌撹乱物質 に対する個体感受性が男児外陰部異常症発症に関与することを示唆する。 今回、種々の男児外陰部異常症および精子形成障害患者において、同様の解析を行った ので、停留精巣における成績とあわせて報告する。 １．方 法 対象は、ミクロペニス患者 70 例、停留精巣患者 63 例、尿道下裂患者 43 例、精子形成障害 患者 80 例、外陰部正常男児 82 例、妊孕性陽性成人男性 53 例である。われわれが既に解析 した ESR1 の SNP8 個（SNP8-SNP15）の遺伝子型を決定し、その後、遺伝統計学的手法を 用いて患者―対照間のハプロタイプ解析を行った。 ２．結 果 ハプロタイプブロックは、各患者群と対照群において、3’側の SNP10-14 を包含する約 50kb 領域で同定された（図 1）。このブロック内の AGATA ハプロタイプのホモ接合体の頻度は、 外陰部正常男児に比し、ミクロペニス患者で境界水準の増加（P＝0.049、オッズ比 4.4）、 停留精巣患者で有意の増加（P＝0.0040、オッズ比 7.6）、尿道下裂患者で顕著な増加 (P＝ 0.000057、オッズ比 13.6) を示した。一方、精子形成障害患者と妊孕性陽性成人男性の間で は、有意の結果は得られなかった。 ３．考 察 以上の成績は、ESR1 特定ハプロタイプのホモ接合性が停留精巣と尿道下裂症に強く関与す ることを示すもので、内分泌撹乱物質にたいする個体感受性の存在を示唆する。この表現 型は、エストロゲン様効果がアンドロゲンおよび Insulin-like 3 の産生低下を招くことから、 性決定臨界期を含む内分泌撹乱物質への暴露の結果として説明される。また、精子形成障 害では、エストロゲン受容体β遺伝子 (ESR2) 多型が関与する可能性が推測され、現在、 精子形成障害患者を含む全ての患者において、ESR2 ハプロタイプ解析を開始している。✻ 研究報告 ✻
１．目 的 近年、男児外陰部異常症を含む男性性機能低下の発症頻度が増加し、その原因として、 内分泌撹乱物質の影響が推測されている。特に大多数の内分泌撹乱物質がエストロゲ ン様作用を発揮すること、エストロゲン様作用が男児外陰部異常症を含む男性性機能 低下症を発症させうることから、内分泌撹乱物質のエストロゲン様効果が重要な役割 を果たしていると推測される。 このエストロゲン様効果は、内分泌撹乱物質の暴露量や暴露時期のみならず個体の感 受性にも支配されると考えられる。そして、ほとんどの内分泌撹乱物質のエストロゲ ン様効果がエストロゲン受容体を介すること、エストロゲン受容体αとβのうち、エス トロゲン受容体αの異常が内分泌異常を呈することから、エストロゲン受容体α遺伝 子（ESR1）の変動が個体感受性に密接に関与すると推測される。 われわれは、男児外陰部異常症の代表である停留精巣と尿道下裂をモデルとして、内 分泌撹乱物質にたいして高感受性を有する男児が停留精巣を呈しやすいという作業仮 説のもとに ESR1 のハプロタイプ解析を行った。 ２．方 法 対象は、ミクロペニス患者 70 例、片側、両側、鼠径部、腹腔内と様々なパタ−ンの停 留精巣を有する患者 63 例、会陰部、陰嚢部、陰茎部と様々なパタ−ンの尿道下裂を有 する患者 43 例、年齢適合コントロール男児 82 例、精子形成障害患者 80 例、年齢適合 コントロール男児 53 例である。患者は、生殖器および生殖器外の合併奇形なし、正常 男性核型、アンドロゲン受容体遺伝子、5∝還元酵素遺伝子、Insulin-like 3 遺伝子の変異 なし、Y 長腕の微小欠失なし、アンドロゲン受容体遺伝子 CAG リピート多型の伸展な し、ホルモン基礎値正常、特別な環境要因なし、という条件を満足した。ESR1 のゲノ ム DNA 全長 (＞300kb) にわたり 6-38kb 間隔で存在し、マイナーアレル頻度 15%以上 の SNP15 個（SNP1-SNP15）（図 1）を TaqMan 法で解析し、遺伝統計学的解析によりハ プロタイプブロックを決定した。その後、患者―健常者間において連鎖不平衡領域の ハプロタイプ頻度を比較した。 ３．結 果 ハプロタイプブロック（連鎖不平衡係数 0.85 以上）は、患者と健常者共に 3’側の SNP10-14 を包含する約 50kb 領域で同定された（図 2）。 この領域の主要ハプロタイプは 4 個存在し、そのうち、AGATA ハプロタイプの推定頻 度が、停留精巣と尿道下裂患者で有意に多く、この有意差はハプロタイプが劣性効果 を有すると仮定すると顕著になった（表１）。これに一致して、このハプロタイプのホ モ接合体頻度は、停留精巣と尿道下裂患者と健常者で顕著に異なった。しかし、ミク ロペニスにおける有意長は境界程度であり、精子形成障害患者と正常男性の間に有意 差は認められなかった。４．考 察 以上の成績は、劣性効果を有する ESR1 の特定ハプロタイプが停留精巣の発症に関与す ることを世界で初めて示すものである。この特定ハプロタイプは、リガンド依存性転 写活性化ドメインをコードするエクソンを含む領域に存在することから、内分泌撹乱 物質の会合と共に ESR1 の転写活性を上昇させることで比較的強いエストロゲン作用 をもたらし、男性ホルモン作用の低下および精巣導帯発育不全介して停留精巣や尿道 下裂の発症の感受性を亢進されると推測される。さらに、SNP 12 の A アリルはこの特 定ハプロタイプに特有であった（表 1）。したがって、この A アリルはハプロタイプ解 析の代表として解析に用いうると期待される。 なお、内分泌撹乱物質効果の観点からは、尿道下裂が中核症状と考えられる。これは、 内分泌撹乱物質は妊娠全経過を通じて存在すること、感受性は大量の男性ホルモンを 要する性分化臨界期においてが最も高いこと、性分化臨界期における男性ホルモン効 果の低下は外陰部構造異常である尿道下裂を招くことに基づく。事実、最も顕著な有 意差は尿道下裂において検出された。一方、ミクロペニスや停留精巣は妊娠後期の男 性ホルモン効果の低下を反映する症状であるため、有意差は低くなる。しかし、停留 精巣の発症には、男性ホルモン効果低下のほかに、精巣導帯形成に必須である insulin like 3 が関与し、このホルモンはエストロゲン効果が強いときに産生障害となる。この ような、男性ホルモン効果以外の関与が、停留精巣において顕著な有意差が検出され たかを説明する。 なお、精子成形成障害とエストロゲン受容体 AGATA ハプロタイプには、有意の関連は 見出されなかった。これは、精子成形成障害が数十年という年月を経て形成される表 現型であるため、多くの遺伝および環境因子の影響を受けること、および、生殖細胞 ではエストロゲン受容体βが強く発現することから、エストロゲン受容体βをコード する ESR2 遺伝子多型が大きく関与する可能性がある。現在、われわれは、ESR2 のハ プロタイプ解析を実施中である。
図 1．解析された 15 個の SNP の位置 図２．今回同定されたハプロタイプブロック Genomic DNA A/B C D E Transactivation Functional domain SNP1 SNP8 SNP14 SNP13 SNP7 SNP12 SNP15 SNP3 SNP6 Dimerization DNA binding Ligand binding SNP4 SNP5 SNP9SNP10SNP11 SNP2 Nuclear localization 5’ 3’ (6,455 bp) (595 amino acids) (>300 kb)
AF-2 (Ligand dependent) AF-1 (Ligand independent)
cDNA
Protein F
表１．ハプロタイプ解析結果
業 績
Watanabe M, Yoshida R, Ueoka K, Aoki K, Sasagawa I, Hasegawa T, Sueoka K, Kamitsuji S, Kamatani N, Yoshimura Y, Ogata T. Haplotype analysis of the estrogen receptor α gene in male genital and reproductive abnormalities. Human Reproduction 22(5):1279–1284, 2007.
