Title ニューロン新生に着目した化学物質の発達期神経毒性評価法の確立に関する研究( 内容と審査の要旨(Summary) ) Author(s) 大石, 巧 Report No.(Doctoral Degree) 博士(獣医学) 乙第122号 Issue Date 2013-09-24 Type 博士論文 Version ETD URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/47368 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
学位論文の内容の要旨 本研究では, 短期スクリーニングに適う発達神経毒性評価系の確立を目的として, 神経 病理学的解析に特化した評価法を検討した。発達神経毒性ガイドラインでは, 多数の動物 を使用し, 評価に長期間を要することから, 小規模で短期のスクリーニング評価系を確立 する必要がある。ガイドラインでは, 各群 20 匹の母動物に曝露し, 神経病理学的解析につ いては各群 10 匹/性の子動物を解析するよう規定されているが, 本研究では各群 8～12 匹 の母動物を使用し, 各群 10 匹の子動物について神経病理学的解析を実施した。さらに, 性 周期中のステロイドホルモンの変動でニューロン新生が影響を受けることが報告されてい る雌を神経病理学的解析から除外した。これにより, 使用動物数の削減と解析の効率性の 向上を実現可能とした。 第 1 章では, 化学物質による母体毒性を介した非特異的な低栄養性脳発達遅延のニュー ロン新生への影響を検証するため,低たん白食を母動物に与えて低栄養性脳発達遅延の子 動物を作出し,ニューロン新生への影響を検討した。その結果, 離乳時（生後 21 日目）お よび成熟後（生後 77 日目）のいずれも海馬歯状回門の Reelin 関連分子に影響はなく, NeuN 陽性ニューロンおよび顆粒細胞層下帯（subgranular zone: SGZ）における顆粒細胞系譜の 増殖性やアポトーシスにも変動はみられなかった。低栄養性脳発達遅延では海馬歯状回の ニューロン新生に影響はみられなかったことから, 海馬歯状回のニューロン新生の評価は 母動物および子動物の全身毒性に起因した成長遅延に影響を受けないことが示唆され, 発 達神経毒を検出のための有用な手段なると判断された。 第 2 章では, ドーパミン作動性ニューロン傷害性のマンガンの神経発達毒性の有無を明 らかにし, その病理発生を基盤とした評価系を確立することを目的に, マンガンの発達期 曝露を行った。その結果, SGZ にある顆粒細胞系譜の type-3 細胞または未熟顆粒細胞の増 加を示す Dcx 陽性細胞の増加が離乳時に確認された。歯状回門では GABA 性介在ニューロン 氏名（本（国）籍） 大 石 巧（静岡県） 主 指 導 教 員 名 東京農工大学 教授 渋 谷 淳 学 位 の 種 類 博士（獣医） 学 位 記 番 号 獣医博乙第１２２号 学 位 授 与 年 月 日 平成２５年９月２４日 学 位 授 与 の 要 件 学位規則第３条第２項該当 研 究 科 及 び 専 攻 連合獣医学研究科 獣医学専攻 研究指導を受けた大学 東京農工大学 学 位 論 文 題 目 ニューロン新生に着目した化学物質の発達期神経毒性 評価法の確立に関する研究 審 査 委 員 主査 東京農工大学 教 授 渋 谷 淳 副査 帯広畜産大学 教 授 古 林 与志安 副査 岩 手 大 学 教 授 御 領 政 信 副査 東京農工大学 教 授 下 田 実 副査 岐 阜 大 学 教 授 柳 井 徳 磨 （１）
における Reelin 陽性細胞の増加が離乳時に確認され, これが顆粒細胞の分化異常を示す Dcx 陽性細胞の増加を引き起こしているものと推測された。いずれも成熟後には認められ なかった。マンガンの発達期曝露は子動物の海馬歯状回の後期分化を標的としたニューロ ン新生への可逆的の影響を示すことが明らかとなった。 第 3 章では, コリンエステラーゼ阻害作用のあるクロルピリフォスの神経発達毒性の有 無を明らかにし, その病理発生を基盤とした評価系の確立を目的に, クロルピリフォスの 発達期曝露を行った。その結果, 離乳時に SGZ において増殖性の Type-2 前駆細胞の減少を 示す PCNA および Tbr2 陽性細胞の減少を引き起こした。いずれも成熟後にはみられなかっ た。クロルピリフォスの発達期曝露は子動物の海馬歯状回の中期分化を標的としたニュー ロン新生への可逆的の影響を示すことが明らかとなった。 第 4 章では, コリン作動性神経毒であるニコチンの神経発達毒性の有無を明らかにし, その病理発生を基盤とした評価系の確立を目的に, ニコチンの発達期曝露を行った。その 結果, 離乳時に SGZ にある Dcx 陽性細胞の増加と TUC4 陽性細胞の減少,二重染色では, TUC4 陽性/ Dcx 陽性または陰性細胞の減少と TUC4 陰性/Dcx 陽性細胞の増加ならびに Tbr2 陰性/ Dcx 陽性細胞の増加がみられたが, Tbr2 陽性細胞に変動はみられなかった。これらは顆粒 細胞系譜の type-3 前駆細胞の増加と未成熟ニューロンの減少を示唆する変化であった。ま た,SGZ における TUNEL 陽性アポトーシス細胞および PCNA 陽性増殖細胞に変動はなく, 顆 粒細胞層の NeuN 陽性細胞数にも変動はなかったことから, type-3 前駆細胞の増加および 未成熟ニューロンの減少は, type-3 前駆細胞から未成熟ニューロンへの分化遅延による変 化と考えられた。歯状回門のニューロンでは成熟型の GABA 性介在ニューロンの増加を示唆 する GAD67 陽性 GABA 性介在ニューロンと NeuN 陽性ニューロンの増加が離乳時にみられた。 いずれも成熟後にはみられなかった。したがって, ニコチンの発達期曝露は, type-3 前駆 細胞から未成熟ニューロンへの分化の遅延と成熟型の GABA 性介在ニューロンの増加を引 き起こし, いずれも可逆的であることが明らかとなった。 以上, SGZ における顆粒細胞系譜, 増殖およびアポトーシスならびに海馬歯状回門にお ける GABA 性介在ニューロンの検索により, 発達神経毒性物質の標的細胞および分化時期 を明らかにすることが可能となった。また, これらは非特異的な全身性の低栄養性脳発達 遅延の影響は受けなかった。さらに, 行動学的な解析ではマンガンおよびクロルピリフォ ス曝露の影響をみられなかったが, 海馬歯状回の観察ではニューロン新生への影響が検出 され, 感度の高い有用な解析手段であると考えられた。したがって, ニューロン新生評価 法は短期スクリーニングに適う発達神経毒の新たなスクリーニング法になると期待される。 審 査 結 果 の 要 旨 本研究では,短期スクリーニングに適うラットの発達神経毒性評価系の確立のため,ニュ ーロン新生に着目した評価法を検討した。 第 1 章では,母体毒性を介した非特異的低栄養性脳発達遅延のニューロン新生に与える 影響を確認した。低たん白食を母動物に与え低栄養性脳発達遅延の子動物を作出した。そ の結果,離乳時（生後 21 日目）および成熟後（生後 77 日目）のいずれも海馬歯状回門の Reelin 関連分子,NeuN 陽性ニューロンと顆粒細胞層下帯（subgranular zone: SGZ）に存在 する顆粒細胞系譜の細胞増殖およびアポトーシスに影響はなく,海馬歯状回のニューロン 新生は母動物および子動物の全身毒性による脳発達遅延に影響を受けないことが示唆され, 有用な指標となると判断された。
第 2 章では,マンガンの発達期曝露により,SGZ の顆粒細胞系譜のうちの type-3 細胞また は未熟顆粒細胞の増加を示す Dcx 陽性細胞の増加と共に,歯状回門の Reelin 陽性 GABA 性介
在ニューロンの増加が離乳時に確認されたが, 成熟後に消失した。マンガンの発達期曝露 は子動物の海馬歯状回の後期分化を標的としたニューロン新生への可逆的な影響を示した。 第 3 章では,クロルピリフォスの発達期曝露により,SGZ の増殖性 Type-2 前駆細胞の減少 を示す PCNA および Tbr2 陽性細胞の減少が離乳時にみられたが, 成熟後には消失した。ク ロルピリフォスの発達期曝露は子動物の海馬歯状回の中期分化を標的としたニューロン新 生への可逆的な影響を示した。 第 4 章では,ニコチンの発達期曝露により, SGZ の顆粒細胞系譜のうちの type-3 前駆細 胞から未成熟ニューロンへの分化遅延を示す Dcx 陽性細胞の増加,TUC4 陽性細胞の減 少,TUC4 陽性/Dcx 陽性または陰性細胞の減少,TUC4 陰性/Dcx 陽性細胞の増加,Tbr2 陰性 /Dcx 陽性細胞の増加と共に,成熟型 GABA 性介在ニューロンの増加を示す歯状回門の GAD67 陽性 GABA 性介在ニューロンと NeuN 陽性ニューロンの増加が離乳時にみられたが, 成熟後 に消失した。即ち,ニコチンの発達期曝露は可逆的な type-3 前駆細胞から未成熟ニューロ ンへの分化遅延と成熟型 GABA 性介在ニューロンの増加を引き起こした。 以上,SGZ の顆粒細胞系譜,増殖およびアポトーシスならびに海馬歯状回門の GABA 性介在 ニューロンの検索は,発達神経毒の標的細胞と時期を明らかにし,非特異的な低栄養性脳発 達遅延の影響は受けなかった。したがって,ニューロン新生評価法は短期スクリーニングに 適う発達神経毒の新たなスクリーニング法になると期待される。 以上について,審査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位論 文として十分価値があると認めた。 基礎となる学術論文
１）題 目 ： No effect of sustained systemic growth retardation on the distribution of Reelin-expressing interneurons in the neuron-producing hippocampal dentate gyrus in rats
著 者 名 ： Ohishi, T., Wang, L., Ogawa, B., Fujisawa, K., Taniai, E., Hayashi, H., Mitsumori, K. and Shibutani, M.
学術雑誌名 ： Reproductive Toxicology 巻・号・頁・発行年：30（4）：591-599, 2010
２）題 目 ： Adolescent hyperactivity of offspring after maternal protein restriction during the second half of gestation and lactation periods in rats
著 者 名 ： Ohishi, T., Wang, L., Akane, H., Shiraki, A., Sato, A., Uematsu, M., Suzuki, K., Mitsumori, K. and Shibutani, M.
学術雑誌名 ： The Journal of Toxicological Sciences 巻・号・頁・発行年：37（2）：345-352, 2012
３）題 目 ： Reversible aberration of neurogenesis affecting late-stage differentiation in the hippocampal dentate gyrus of rat offspring after maternal exposure to manganese chloride
著 者 名 ： Ohishi, T., Wang, L., Akane, H., Shiraki, A., Goto, K., Ikarashi, Y., Suzuki, K., Mitsumori, K. and Shibutani, M.
学術雑誌名 ： Reproductive Toxicology 巻・号・頁・発行年：34（3）：408-419, 2012
４）題 目 ： Reversible effect of maternal exposure to chlorpyrifos on the intermediate granule cell progenitors in the hippocampal dentate gyrus of rat offspring
Yafune, A., Mitsumori, K. and Shibutani, M. 学術雑誌名 ： Reproductive Toxicology
巻・号・頁・発行年：35：125-136, 2013 既発表学術論文
１）題 目 ： Unexpected sudden deaths of F344 rats in long-term toxicity studies: relationship between sudden deaths and stomach tube material or feed type
著 者 名 ： Ohishi, T., Mochizuki, M., Enami, T., Okazaki, K. and Okazaki, S.
学術雑誌名 ： The Journal of Toxicological Sciences 巻・号・頁・発行年：33(4):509-513, 2008
２）題 目 ： Carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in pregnant and lactating rats
著 者 名 ： Mochizuki, M., Shimizu, S., Urasoko, Y., Umeshita, K., Kamata, T., Kitazawa, T., Nakamura, D., Nishihata, Y., Ohishi, T. and Edamoto, H.
学術雑誌名 ： The Journal of Toxicological Sciences 巻・号・頁・発行年：34(2):175-181, 2009
３）題 目 ： Phenobarbital (PB)-induced changes in blood coagulation-related parameters in pregnant rats, lactating rats and pups
著 者 名 ： Mochizuki, M., Shimizu, S., Kidokoro, Y., Kamata, T., Kitazawa, T., Kishi, D., Okazaki, E., Nishihata, Y. and Ohishi, T. 学術雑誌名 ： The Journal of Toxicological Sciences
巻・号・頁・発行年：34(6):603-610, 2009
４）題 目 ： Effects of pregnancy and lactation on warfarin-induced changes in blood coagulation-related parameters in rats
著 者 名 ： Ohishi, T., Kitazawa, T., Suzuki, S., Nakamura, D., Nishihara, Y. and Mochizuki, M.
学術雑誌名 ： The Journal of Toxicological Sciences 巻・号・頁・発行年：35(2):189-196, 2010
５）題 目 ： Induction of GST-P-positive proliferative lesions facilitating lipid peroxidation with possible involvement of transferrin receptor up-regulation and ceruloplasmin down-regulation from the early stage of liver tumor promotion in rats
著 者 名 ： Mizukami, S., Ichimura, R., Kemmochi, S., Taniai, E., Shimamoto, K., Ohishi, T., Takahashi, M., Mitsumori, K. and Shibutani, M. 学術雑誌名 ： Archives of Toxicology
巻・号・頁・発行年：84(4):319-331, 2010
６）題 目 ： Disruptive neuronal development by acrylamide in the hippocampal dentate hilus after developmental exposure in rats
著 者 名 ： Ogawa, B., Ohishi, T., Wang, L., Takahashi, M., Taniai, E., Hayashi, H., Mitsumori, K. and Shibutani, M.
学術雑誌名 ： Archives of Toxicology 巻・号・頁・発行年：85(8):987-994, 2011
proliferation in a dog
著 者 名 ： Shiraki, A., Hojo, Y., Tsuchiya, T., Wang, L., Ohishi, T., Suzuki, K., Mitsumori, K. and Shibutani, M.
学術雑誌名 ： The Journal of Veterinary Medical Science 巻・号・頁・発行年：74(6):801-804, 2012
８）題 目 ： Reversible aberration of neurogenesis targeting late-stage progenitor cells in the hippocampal dentate gyrus of rat offspring after maternal exposure to acrylamide
著 者 名 ： Ogawa, B., Wang, L., Ohishi, T., Taniai, E., Akane, H., Suzuki, K., Mitsumori, K. and Shibutani, M.
学術雑誌名 ： Archives of Toxicology 巻・号・頁・発行年：86(5):779-790, 2012
９）題 目 ： Developmental exposure to manganese chloride induces sustained aberration of neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus of mice
著 者 名 ： Wang, L., Ohishi, T., Shiraki, A., Morita, R., Akane, H., Ikarashi, Y., Mitsumori, K. and Shibutani, M.
学術雑誌名 ： Toxicological Sciences 巻・号・頁・発行年：127(2):508-521, 2012
10）題 目 ： Transient aberration of neuronal development in the hippocampal dentate gyrus after developmental exposure to brominated flame retardants in rats
著 者 名 ： Saegusa, Y., Fujimoto, H., Woo, GH., Ohishi, T., Wang, L., Mitsumori, K., Nishikawa, A. and Shibutani, M.
学術雑誌名 ： Archives of Toxicology 巻・号・頁・発行年：86(9):1431-1442, 2012
11）題 目 ： Disruptive cell cycle regulation involving epigenetic downregulation of Cdkn2a (p16Ink4a) in early-stage liver tumor-promotion facilitating liver cell regeneration in rats 著 者 名 ： Tsuchiya, T., Wang, L., Yafune, A., Kimura, M., Ohishi, T., Suzuki,
K., Mitsumori, K. and Shibutani, M. 学術雑誌名 ： Toxicology
巻・号・頁・発行年：299(2-3):146-154, 2012
12）題 目 ： Similar distribution changes of GABAergic interneuron subpopulations in contrast to the different impact on neurogenesis between developmental and adult-stage hypothyroidism in the hippocampal dentate gyrus in rats
著 者 名 ： Shiraki, A., Akane, H., Ohishi, T., Wang, L., Morita, R., Suzuki, K., Mitsumori, K. and Shibutani, M.
学術雑誌名 ： Archives of Toxicology
