製品コード
MK137
説 明 書
Mouse IgG EIA Kit
研究用
生体防御のひとつ、液性免疫の主役となる抗体：免疫グロブリン（Ig）は動物体内では 5 種類のクラ ス（IgG, IgA, IgM, IgE, IgD）が存在し、血液中で 80％を占めるのが IgG クラスです。血液中の IgG は、 免疫応答によりその含有量は大きく変動しますが、一般的に 3 ～ 10 mg/ml という高濃度で存在してい ることから、これらは、これまで高感度 ELISA が必要となるような測定対象ではありませんでした。し かし近年、モノクローナル抗体作製技術の一般化により、様々なタイプのイムノグロブリンが高純度の 分離タンパクとして得られ、それらを主成分とした薬剤や研究用試薬が市場に出現しました。また、均 一なタイプの免疫グロブリンであるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞そのものも、多 方面の研究機関で取り扱われるようになり、これらの抗体製品や細胞製品の品質評価には、高感度な免 疫グロブリンの定量系が必要となってきました。 本製品は、Mouse IgG に特異的なポリクローナル抗体を用いた定量キットで、マウス血液中の抗体測定 に使用できるほか、モノクローナル抗体を用いた薬剤や研究用試薬の品質検定、またハイブリドーマ細 胞の抗体産生能モニタリング等に応用できます。（すでに捕捉用抗体をプレート器材に固相化してあり ますので、測定したいときにすぐに使用できます。）全測定時間はわずか 60 分と非常に短時間で感度・ 再現性よくマウス免疫グロブリンを検出できるように用法用量を設定しました。
I．測定原理
Mouse IgG 標識抗体 E E 基質 発色 サンドイッチ複合体 抗体プレートII．キットの内容（96 回用× 2）
（1）Antibody Coated Microtiterplate
抗 Mouse IgG ポリクローナル抗体（96 ウェル：8 ウェル× 12 strips） 2 plates （2）Antibody-POD Conjugate ペルオキシダーゼ標識抗 Mouse IgG ポリクローナル抗体（凍結乾燥品） 11 ml 用× 2 （3）Standard（陽性コントロール） 精製 Mouse 免疫グロブリン 640 ng（凍結乾燥品） 1 ml 用× 2 （4）Sample Diluent 25％ Block Ace™ 含有 PBS 含防腐剤 60 ml （5）Substrate Solution（TMBZ） 3, 3’, 5, 5’ テトラメチルベンジジン溶液 12 ml × 2
III．キット以外に必要な試薬や器具（主なもの）
・Wash and Stop Solution for ELISA（製品コード MK020）
洗浄液成分（10 × PBS；50 ml × 5 本、Tween 20；3 ml）と反応停止液（1N H2SO4 ＊； 60 ml）を含む。 ＊： 1N 硫酸は腐食性があり、皮膚に接触するとただれ等を起こすことがあり ます。手や粘膜についた場合は、ただちに多量の水で洗い流し、医師の指 示に従ってください。 ・ピペット、マイクロピペットおよびチップ ・マイクロプレートリーダー（450 nm 設定で吸光度 3.5 まで測定可能なもの）
IV．保存
4℃V．使用目的
血清中のマウス免疫グロブリン量の測定 ハイブリドーマ培養上清中のマウスモノクローナル抗体濃度の測定VI．使用方法
1．検体 ・ 検体はマウス血清および血漿、またはマウスハイブリドーマ培養上清・腹水等を用いる。 ・ 検体は 2 ～ 10℃に保存し、12 時間を過ぎて測定する場合は凍結保存する。 ・ 希釈が必要な場合は（4）Sample Diluent を用いて希釈する。 ・ 正常マウス血清検体の場合、標準では 1,000 ～ 10,000 倍希釈して用いるとよい。 ・ マウスハイブリドーマ培養上清の場合、標準的な場合で 10 ～ 500 倍希釈して測定する とよい。（細胞株により抗体産生量に差があることから予備測定が必要） 2．試薬調製・ 抗体プレート（（1）Antibody Coated Microtiterplate） 使用前に室温に戻してから開封する。
・ Mouse IgG 標準液
（3）Standard は、蒸留水を 1 ml 加えて溶解し、Mouse IgG 標準液（640 ng/ml）とする。 定量目的で検量線を作成する場合は、これを（4）Sample Diluent で用時段階希釈して、 640、320、160、80、40、20、10 ng/ml の各濃度の標準液として使用する。0 濃度は （4）Sample Diluent を用いる。 Mouse IgG 標準液は 4℃保存では一週間安定で、－ 20℃保存では 1 ヵ月安定である。＊ ＊： IgG サブクラスにより検出力が異なりますので、正確な定量には独自で設定した IgG 標準品を用いた測定を行ってください。 ・ 標識抗体液 （2）Antibody-POD Conjugate を蒸留水 11 ml で溶解する。 溶解後一週間は 4℃で安定である。それ以上保存する場合には－ 20℃で凍結する。そ の場合、1 ヵ月は安定である。ただし、凍結は一度までにとどめる。 ・ 基質液（（5）Substrate Solution（TMBZ）） 反応に用いる前に室温にもどし、そのまま使用する。使用前に基質液が濃い青に変色 していないか確認する。金属イオンと反応すると呈色するおそれがあるので、特に水 道水が混入しないよう注意する。 数回に分けて使用する場合はあらかじめ必要量を取り分けるようにする。 ・ 洗浄液 (0.1％ Tween 20 含有 PBS）＊
Wash and Stop Solution for ELISA の 10 × PBS 1 本（50 ml）を蒸留水で 500 ml に希 釈する。
Tween 20 を 500 μl 添加する。充分に混合後、洗浄液として使用する。（用時調製） ・ 反応停止液＊
Wash and Stop Solution for ELISA の Stop Solution（1 N H2SO4）をそのまま使用する。
強酸性のため取扱いには注意する。
＊： 洗浄液および反応停止液は、本キットには含まれていません。
3．操作法
＜標準プロトコール：Total 1 hour Assay protocol ＞ 測定は二重測定で行う。 キット中の各試薬ならびにサンプルは使用前に室温にもどし、泡立てないように 混和し、液を均一にしてから用いる。 （1） 各濃度の標準液およびサンプルを 100 μl ずつマイクロピペットで各ウェルに 2 連ずつ加え、室温（20 ～ 30℃）で 25 分反応させる。標準液およびサンプ ルはあらかじめ別の 96 穴プレートを利用して用意し、8 連ピペット等ですみ やかに（5 分以内）投入する。プレート内の測定値の信頼を高めるためにも、 1 列目と 12 列目とに標準液の希釈系列をおくとよい。 （第一反応） （2） 反応液を捨て、0.1％ Tween 20 含有 PBS で 3 回洗浄後、標識抗体液を 100 μl ずつ 8 連ピペットで各ウェルに加え、室温（20 ～ 30℃）で 25 分反応させる。 （第二反応） （3） 反 応 液 を 捨 て、0.1 ％ Tween 20 含 有 PBS で 4 回 洗 浄 後、（5）Substrate Solution（TMBZ）を 100 μl ずつ 8 連ピペットで各ウェルに加え、室温（20 ～ 30℃）で 10 分反応させる。（第三反応） （4） 反 応 停 止 液（1N H2SO4） を 100 μl ず つ、（5）Substrate Solution（TMBZ） を入れた順番に各ウェルに加え、反応を停止させた後よく混和する。 （5） 蒸留水を対照としてゼロ調整し、波長 450 nm で吸光度を測定する。 発色は反応停止後一時間までは安定である。 （6） グラフ用紙の横軸に各標準液の濃度を、縦軸に対応する吸光度をプロットして 標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応する Mouse IgG 濃度を読み取る。 ＜高感度プロトコール＞ 検出感度を高くしたい場合は、標準プロトコールを以下のように変更して反応時 間を延長してください。 検量線の測定領域が向上し、検出限界が 5 ng/ml になります。 （VI. 性能 7. 反応時間延長による検出感度の向上 参照） ＜標準プロトコール＞ ＜高感度プロトコール＞ 標準液の作製 640 ng ～ 10 ng 320 ng ～ 5 ng 第一反応 25 分 2 時間 第二反応 25 分 1 時間 第三反応 10 分 15 分
Mouse IgG 濃度 （ng/ml） 640 320 160 80 40 20 10 0 A450 2.679 1.304 0.532 0.230 0.122 0.080 0.064 0.045 2．再現性 ＜同時再現性試験（n ＝ 16）＞ マウスハイブリドーマ培養上清を希釈して作製した 3 種類の濃度コントロールを用いて 再現性試験を実施した。 検体（n ＝ 16） 平均値（ng/ml） 標準偏差（ng/ml） CV（％） コントロール A コントロール B コントロール C 402.61 110.31 57.20 16.421 8.785 3.708 4.1 8.0 6.5 ＜日差再現性試験（n ＝ 3）＞ 三日間にわたり 3 種類の濃度コントロールの定量を行い、再現性試験を実施した。 検体 平均値（ng/ml） 標準偏差（ng/ml） CV（％） コントロール A コントロール B コントロール C 379.67 102.69 57.00 18.466 5.565 4.008 4.9 5.4 7.0
VII．性能
1．標準曲線（Mouse IgG EIA Kit）
下記の標準曲線は代表的な一例である。各ロットの標準曲線については、添付の Certificate of Analysis に記載している。正確な結果を得るためには、測定ごとに標準曲線 を作成することが望ましい。 Conc 10 100 1000 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Standard Curve 4-P Fit: y = (A - D)/( 1 + (x/C)^B ) + D: A B C D R^2 Std (Standards: Conc vs MeanValue) 0.056 1.58 736 5.95 1 Curve Fit Option - Fixed Weight Value
0 100 200 300 400 500 600 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Mouse IgG (ng/ml ) 希釈倍率 No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6
Mouse IgG EIA (Precoated) 血清における希釈直線 （回帰式は 4-parameter） No.1 y ＝ 105.03x ＋ 0.2304 R2＝ 0.9878 No.2 y ＝ 119.96x ＋ 2.0272 R2＝ 0.9947 No.3 y ＝ 128.64x ＋ 4.8745 R2＝ 0.9956 No.4 y ＝ 276.17x ＋ 14.58 R2＝ 0.9997 No.5 y ＝ 289.59x ＋ 21.644 R2＝ 0.9991 No.6 y ＝ 485.74x ＋ 30.363 R2＝ 0.9996 3．添加回収試験 さまざまな濃度の検体サンプルを等量ずつ混合し、予想される理論値と実測値とから回収 率を調べた。 サンプル A サンプル B A ＋ B/2（実測値）A ＋ B/2（理論値） 回収率（％） 328.99 174.66 264.1 251.8 104.9 328.99 325.38 307.4 327.2 94.0 328.99 186.14 238.0 257.6 92.4 328.99 95.00 196.5 212.0 92.7 174.66 325.38 236.7 250.0 94.7 174.66 186.14 164.1 180.4 91.0 174.66 95.00 133.9 134.8 99.3 325.38 186.14 271.7 255.8 106.3 325.38 95.00 222.7 210.2 105.9 単位：ng/ml 4．希釈直線性 マウス血清サンプル 6 種を 104より倍々希釈して定量値をプロットした希釈直線の例を 示す。
5．Mouse IgG 各サブクラスに対する検出力について
各サブクラスを示すモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養上清を、適宜希釈 して、各マウス IgG サブクラスおよび IgM の反応性を調べた。（表中の値は A450）
Monoclonal Polyclonal Monoclonal
Mouse Ig IgM IgG’s IgG1 IgG2a IgG2b IgG3
原液 3.485 3.988 3.439 4.017 4.000 3.289 × 5 3.232 3.851 3.116 4.015 4.145 3.129 × 25 2.492 3.664 1.562 3.847 4.097 1.722 × 125 0.571 1.660 0.295 1.643 3.458 0.343 ＜結果＞ いずれのサブクラスに対してもシグナル確認ができた。 6．BALB/c と C57BL6 マウス系統差の比較 マウスの系統と個体の違いで血中の IgG 濃度にどのような違いが出るかを調べた。 対象はいずれも 8 週齢の個体を使用した。表中の測定値は、血清サンプル 10,000 倍希釈 の値を示す。
BALB/c-1 BALB/c-2 BALB/c-3 C57BL/6-1 C57BL/6-2 C57BL/6-3 血中 IgG 換算濃度
（mg/ml） 1.098 1.219 1.377 2.954 3.216 5.325
C57BL/6-2
BALB/c-1 BALB/c-2 BALB/c-3 C57BL/6-1 C57BL/6-3 6.000 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000
個体 No.
マウスの系統及び個体別 血中IgG濃度（mg/ml）
＜結果＞7．反応時間延長による検出感度の向上 反応時間を延長した高感度プロトコールの場合、標準曲線の測定領域の向上がみられる。 ● 標準プロトコール 第一反応 25 分 → 第二反応 25 分 → 第三反応 10 分 標準曲線：10 ～ 640 ng/ml Mouse IgG 濃度 （ng/ml） 640 320 160 80 40 20 10 0 A450 2.322 1.097 0.465 0.196 0.109 0.079 0.066 0.048 ●高感度プロトコール 第一反応 2 時間 → 第二反応 1 時間 →第三反応 15 分 標準曲線：5 ～ 320 ng/ml Conc 10 100 1000 0 0.5 1 1.5 2 Standard Curve Mean Value Conc 1 10 100 1000 0 1 2 3 StandardCurve Mean Value Mouse IgG 濃度 （ng/ml） 320 160 80 40 20 10 5 0 A450 3.761 1.693 0.594 0.251 0.130 0.086 0.065 0.051
＜結果＞ 反応時間を延長すると検出限界が 5 ng/ml に向上した。 サンプル数が多数ある場合、および標準プロトコールのような短時間で操作を終えること がスケジュール的に困難な場合は、反応時間を第一反応 2 時間、第二反応 1 時間、第三 反応 15 分の高感度プロトコールに変えて行うことができる。 8．溶血の影響 溶血の有無によってサンプルの測定が影響を受けるか検討した。 ＜方法＞ マウス全血採取後、血液を 2 分割したのち、一方を意図的に注射針内を数回通過・溶血させ、 その後に遠心操作により血清を調製した。 ＜結果＞ 意図的な溶血処理により赤血球成分が混入している場合と、混入していない場合を比較し たところ、混入した赤血球溶血成分による極端な反応妨害はないと考えられた。 希釈倍率 8 × 103 16 × 103 32 × 103 64 × 103 128 × 103 Mouse IgG 濃度 （ng/ml） 未処理 603.231 285.727 150.898 73.627 41.235 溶血処理 595.980 318.414 175.844 98.731 54.497 9．Mouse IgA 交差反応
Mouse IgA に対する交差反応を調べるために、Mouse IgA 産生ハイブリドーマの培養上清 を適宜希釈し、当キットで測定した。 希釈倍率 吸光度（A450） 測定値（ng/ml） × 1 1.563 508.83 × 5 0.601 216.53 × 25 0.126 46.11 × 125 0.064 3.68 ＜結果＞ Mouse IgA にも交差反応が確認された。
右： 上記と同様のフォーマットによ る単離抗原を固相化したマイク ロタイタープレートでの ELISA 法 による活性確認テスト 反応停止液 （1N H2SO4） 添加 本キットでのマウス IgG 検出例
