大 きな構 造 フ レ-ム で捉え る シグナル伝達
ヘパ リン/ヘパラン硫酸を介 した
増殖因子のシグナル伝達
岩崎わかな ・稲垣冬彦
細胞増殖 因子 の多 くは,細 胞外 マ トリックス と特異 的に結合 する活性 をも ってい る ・細 胞外 マ
トリックスとの相互作用 は,増 殖 因子の安定化 や貯蔵 ・放出,受 容体への高親 和性結 合 など,
機能発現に必須の役割 を担 う,増 殖 因子が受容体 に結合 して細胞内 にシグナルを伝達 するには,
受容体が多量化する ことが必要 であるが,こ のステ ップにお いて は,細 胞外マ トリックス上 の
ヘパ リン/ヘパラン硫酸との相互作用が鍵 とな る.最 近,構 造生物学的研究が進 み,ヘ パ リンを
介 した増殖因子の シグナル伝達機構 を視覚的に理解 できるよ うになってきた.
ヘ パ リン(HP)繊
維 芽 細 胞 増 殖 因 子(FGF)ミ
ッ ドカ イ ン(MK)
は じめ に
プ ロ テ オ グ リカ ンは,コ
ン ドロ イ チ ン硫 酸,ヘ
パ ラ ン
硫 酸,ヘ
パ リ ン(HP)な
ど の グ リ コ サ ミ ノ グ リ カ ン と蛋
白 質 とが 共 有 結 合 した糖 蛋 白質 で あ る.細 胞 外 マ ト リ ッ
ク ス の 主 要 な構 成 成 分 と して,ま た,細 胞 表 面,細
胞 内
小 胞 体 な ど に広 く存 在 し,細 胞 の接 着,形 態,移
動,増
殖,分
化 な ど を細 胞 外 か ら調 節 す る 役 割 を担 う.な か で
も細 胞 表 面 のHPお
よ びヘ パ ラ ン硫 酸 は 多 くの 細 胞 増 殖
因 子 と特 異 的 に結 合 し,増 殖 因子 を 安 定 化 した り,そ の
貯 蔵 や 放 出,会 合 な ど を調 節 す る モ ジ ュ レ ー ター と し
て,機
能 発 現 に 重 要 な役 割 を果 た して い る.こ
れ らHP
結 合 能 を もつ 一 群 の 増 殖 因 子 は,ヘ
パ リ ン結 合 性 成 長 因
子 と よ ば れ て い る*1.
細 胞 増 殖 因 子 の シ グ ナ ル伝 達 にお い て は,増 殖 因 子 が
受 容 体 の 細 胞 外 ドメ イ ンへ 結 合 し,そ れ に よ っ て何 ら か
の 機 構 が 働 い て 受 容 体 の 多量 化 が 誘 起 さ れ,受 容 体 の 細
胞 内 ドメ イ ンの チ ロ シ ンキ ナ ー ゼ 部 位 が オ リ ゴマ ー 間 で
相 手 の チ ロ シ ンを リ ン酸 化 す る こ と に よ り,シ グ ナ ル が
伝 達 さ れ る.す
な わ ち,増 殖 因子 の シ グナ ル が細 胞 外 か
ら細 胞 内へ 伝 え られ るス テ ップ は,受 容 体 の 多 量 化 で あ
る と考 え る こ とが で き る.ヘ パ リ ン結 合性 成 長 因 子 の 場
合,受 容 体 の 多 量 化 に は,HP/ヘ
パ ラ ン硫 酸 が 必 須 の 役
割 を 果 た し て い る.近
年,繊
維 芽 細 胞 増 殖 因 子(FGF)
とHP,受
容 体 細 胞 外 ドメ イ ン との 複 合 体 の立 体 構 造 が
つ ぎつ ぎ と報 告 さ れ,こ
の プ ロ セ ス が 解 明 さ れ つ つ あ
る.ま た 筆 者 らは,新 規 の ヘ パ リ ン結 合 性 成 長 因子 ミ ッ
ドカ イ ン(MK)の
立 体 構 造 を 決 定 し,HP認
識 と2量 体
形 成 に つ い て 知 見 を 得 た.本
稿 で は,FGFお
よ びMK
の構 造 生 物 学 的 研 究 に つ い て述 べ る.
Ⅱ,FGFのHPを
介 した シグ ナ ル伝 達
FGFは,細 胞 の 増 殖 や 分 化 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た す ヘ パ リ ン 結 合 性 成 長 因 子 で あ る.酸 性 繊 維 芽 細 胞 増 殖 因 子(aFGF,別 名FGF-),塩 基 性 繊 維 芽 細 胞 増 殖 因 子(bFGF,別 名FGF2)な ど2-の 分 子 が 知 ら れ て お り, フ ァ ミ リ ー を 形 成 し て い る.FGF受 容 体 と し て ば4種 (FGFR-∼4)が 同 定 さ れ て お り,い ず れ も3つ の 免 疫 グ ロ ブ リ ン 様 ドメ イ ン(D1∼3)か ら な る 細 胞 外 の リ ガ ン ド 結 合 部 位,-本 の 膜 貫 通 ヘ リ ッ ク ス,チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 活 性 を も つ 細 胞 内 ドメ イ ン で 構 成 さ れ て い る.細 胞 外 ド メ イ ン の う ち,D2,D3がFGFの 結 合 に 関 与 す る.FGF WakanaIwasaki,理 化 学 研 究 所 播 磨 研 究 所 理 論 構 造 生 物 学 研 究 室E-mail:wiwasaki@spring8.or.jp FuyuhikoInagaki,北 海 道 大 学 大 学 院 薬 学 研 究 科 生 体 分 子 薬 学 専 攻Signal transduction of growth factor mediated by heparin heparan sulfate
白体 は 単 量 体 で あ り,単 独 で は受 容 体 を多 量 化 す る こ と
は で き な い.受 容 体 の 多 量 化 に は,HPの
助 けが 必 要 で
あ る.近 年,FGF-HP複 合 体,FGF-FGFR複 合 体 の 立 体 構 造 が 多 数 報 告 さ れ て い る.さ ら に 最 近,FGF-FGFR-HP複 合 体 の 結 晶 構 造 が 報 告 さ れ た.以 下に,こ れ ら に つ い て 紹 介 し,解 明 さ れ つ つ あ る シ グ ナ ル 伝 達 機 構 に つ い て 述 べ る. 1.FGF,FGF-HP複 合 体 の 構 造 FGF単 独 の 立 体 構 造 は,X線 結 晶 解 析 お よ びNMR に よ り決 定 さ れ て い る1∼3〕.筆 者 の グ ル ー プ で も,小 椋 ら がNMRに よ りFGF1の 溶 液 構 造 を 決 定 し,HP結 合 部 位 に つ い て の 考 察 を 行 な っ て い る4〕.FGFは,い ず れ も β-trefoil(三 つ 葉)構 造 で あ っ た.FGF-HPオ リ ゴ 糖 複 合 体 の 結 晶 構 造 も 決 定 さ れ,ま ず,FGF2とHP4糖, 6糖 と の-:-複 合 体 の 構 造 が 報 告 さ れ た5).続 い て 報 告 さ れ たFGF--HP-0糖 複 合 体 は,2個 のFGF分 子 がHP 1分 「子 を 両 側 か ら挟 む よ う に し て 結 合 し て い た た め,活 性 型2量 体 の 構 造 と し て 注 目 さ れ た6).HPは 塩 基 性 残 基 の 局 在 す る 面.上 に 結 合 し て お り,こ れ は い ず れ の 複 合 体 に も 共 通 し て い た.ま た,上 記 の 複 合 体 中 のHPと FGFの 構 造 は い ず れ も,HP.単 独7),FGF単 独 の 構 造 と ほ ぼ 同 じ で あ っ た.2.FGF-FGFR(細
胞 外のD2,D3ド
メイ ン)複合 体の 構造
FGF-FGFR複
合 体 の 結 晶 構 造 も 多 数 決 定 さ れ て い
*1 構 造 解 析 や 生 化 学 実 験 に はHPが よ く用 い られ るが,HPは 生 体 内 に お け る分 布 が 非 常 に 限 られ て い る こ とか ら,成 長 因 子 の 生 体 内 にお け る 真 の リガ ン ドは,ヘ パ ラ ン硫 酸 で あ る と考 え られ て い る. 図1 FGF2-FGFR1複 合 体 お よ びFGF2-FGFR1-HP10糖複合体の結晶構造
(A)左:FGF2-FGFR1(D2.D3)複 合 体 の 構 造 の 模 式 図8).FGFを 榿 色.FGFRのD2,D3ド メ イ ン を そ れ ぞ れ 緑.青 で 表 示 し た. FGF-FGFR(D2,D3)1:1複 合 体 が さ ら に2量 体 を 形 成 し て い る た め,濃 色 と 淡 色 で 示 し た.右 は 左 図 を 上 か ら 見 た も の(D3ド メ イ ン は 非 表 示).破 線 で 示 し た 位 置 に,正 電 荷 に 富 む 溝 が 走 っ て い る.(B)FGF2-FGFRI(D2,D3)-HP1O糖 複 合 体 の 結 晶 構 造(PDB コ ー ド:IFQ9)11）.FGFを 橙 色,FGFRのD2.D3ド メ イ ン を そ れ ぞ れ 緑,青 で 示 し た,HPは ス テ ィ ッ ク モ デ ル で 表 示.(C)B 図 を 上 か ら 見 た と き の 分 子 表 面 の 静 電 ポ テ ン シ ャル ・正 電 荷 を 青, 負 電 荷 を 赤 で 示 す.正 電 荷 に 富 む 溝 の 上 に,2本 のHP鎖 がhead-to-headで 結 合 し て い た ・2本 と も 蛋 白 質 に 結 合 し て い る6糖 部 分 の み 電 子 密 度 が 観 測 さ れ た.(D)C図 の 模 式 図.2本 のHP鎖 の 結 合 位 置 を 赤 で 示 した.図2
FGF1-FGFR2-HP10糖 複 合 体 の 結 晶 構 造(PDBコ ー ド:1EOO)12) FGFを 橙 色,FGFRのD2,D3ド メ イ ン を そ れ ぞ れ 緑.青,HP を ス テ ィ ッ ク モ デ ル で 表 示 し た,る8∼10).結 晶 内 で は い ず れ もFGF-FGFR1:1複
合 体
が2個,対
称 的 に 会 合 して い た が(図1A左),溶
液 中 で
は単 量 体 と して 存 在 す る.FGFとD2の2:2結
合 面 上
に は,正 電 荷 に富 ん だ溝 が 長 く走 っ て い た(図1A右).
こ こ にHP鎖
が1本 結 合 し,複 合 体 ど う しを 架 橋 す る と
予 想 さ れ た.さ
ら に,溝 の長 さ か ら架 橋 に 必 要 なHP鎖
長 を 予 想 した と こ ろ,-0糖
以 上 が 必 要 と 考 え られ た.
しか し,こ こ で 大 き な 問 題 が 生 じ た.FGFの
シ グ ナ ル
活 性 に 必 要 なHP最
短 鎖 に つ い て は さ ま ざ ま な 説 が あ
り,8糖
や6糖 で も活 性 を示 す とい う報 告 も あ る の で あ
る.よ
っ て,FGFの
シ グ ナ ル 伝 達 に は 受 容 体 の2量 化
が 必 要 で あ り,2量
体 を形 成 させ る に は10糖
以 上 のHP
鎖 長 が 必 要 で あ る はず な の に,実 際 に は-0糖
以 下 で も
シ グ ナ ルが 伝 え られ る とい う矛 盾 が 生 じて しま う.こ の
問 題 を 解 決 す る た め,FGF-FGFR-HP複
合 体 の 構 造 が
待 望 され た.
3.FGF-FGFR(D2,D3)-HP10糖 複 合 体 の 構 造 最 近,FGF-FGFR-HP複 合 体 の 結 晶 構 造 が2つ 発 表 さ れ た.1つ は,Schlessingerら に よ っ て 決 定 さ れ た FGF2)FGFR1-HP-0糖 複 合 体 の 構 造 で あ るID(図-B). HPは,図1A右 で 予 想 さ れ た と お り,正 電 荷 に 富 む 溝 の 中 に 結 合 し て い た 子 しか し,HP10糖 は,こ の 溝 を1 本 で 横 断 す る の に 十 分 な 長 さ で あ る の に も か か わ らず, 驚 く べ き こ と に2本 結 合 し て い た の で あ る(図1C). 2本 のHP鎖 がFGFとFGFRお よ びFGF_FGFR複 合 体 ど う し を 架 橋 し,FGF-FGFR-HP=2:2:2の 結 合 比 で 安 定 な 複 合 体 が 形 成 さ れ て い た.こ の 構 造 は,前 項 で 生 じ た 矛 盾 に 解 を 与 え た.つ ま り,HPが 短 鎖 で あ っ て も,2本 結 合 す る こ と に よ り,FGF-FGFR複 合 体 を2 量 化 さ せ る こ と は 可 能 と考 え ら れ る. こ う し てHPに よ るFGFRの2量 体 形 成 機 構 が 見 え て き た と 思 わ れ た の で あ る が,直 後 にSchlessingerら の 複 合 体 と は ま っ た く異 な る 構 造 が 報 告 さ れ た(図2). Pellegriniら の 決 定 し たFGF1-FGFR2-HP10糖 複 合 体 は2:2:1の 結 合 比 で,蛋 白 質 に 対 し てHPは 非 対 称 的 に 結 合 し て い た12)(図2).HPな し のFGF-FGFR複 合 体 (図1A)に 比 べ て,D3がD2-D3リ ン カ ー の 周 り に 約170° 回 転 し て い た こ と に 注 日 さ れ た 子 こ の こ と か ら,次 の よ う な 機 構 が 考 え ら れ た.ま ず,FGFとFGFRが 図1A の よ う な 複 合 体(溶 液 中 で は 単 量 体)を 形 成 す る 子 そ こ へHPが 結 合 す る と,複 合 体 が2量 化 さ れ る と 同 時 にD 3ド メ イ ンが 回 転 し,コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン 変 化 に よ っ て シ グ ナ ル が 細 胞 内 へ 伝 え ら れ る と い う 流 れ で あ る. Schlessingerら の 構 造 とPellegriniら の 構 造 の 相 違 を ど う 解 釈 す べ き だ ろ う か.構 造 解 析 で はHPが 用 い ら れ て い る が,生 体 内 で の ヘ パ ラ ン 硫 酸 の 組 成 と 構 造 の 多 様 性,FGFお よ び 受 容 体 フ ァ ミ リ ー の 多 様 性 を 考 え る と, HP/ヘ パ ラ ン 硫 酸 を 介 し たFGF受 容 体 の 活 性 化 機 構 は 1つ で は な い 可 能 性 が あ る.今 後,さ ま ざ ま な 組 合 せ の 複 合 体 の 立 体 構 造 情 報 が 集 積 さ れ れ ば,活 性 化 機 構 の 全 貌 が 見 え て く る と 期 待 さ れ る.Ⅱ.MKの
立 体構 造 とHP認
識 機構
ミ ッ ドカ イ ン(MK)は,門
松 ・村 松 ら に よ り発 見 さ れ
た新 規 の ヘ パ リ ン結 合 性 成 長 因 子 で あ る13).そ の 機 能 は
実 に多 彩 で,ま ず ひ とつ に は,神 経 突 起 の伸 張.神
経 細
胞 の生 存 ・神 経 分 化 を促 進 させ る活 性 を もつ こ とが 知 ら
れ て い る14).ま た,MKは
組 織 の 修 復 や 炎 症 に 関 して も
さ ま ざ まな 活性 を示 す.な
か で も注 目 され て い る の が 線
溶 系 の 活 性 化作 用 で,MKは
血 管 内 皮 細 胞 の プ ラ ス ミノ
ー ゲ ン活 性 化 因 子(PA)の
活 性 を 増 大 させ る15).ま た,
MKは
癌 との 関連 で も注 目 を集 め て い る.ヒ
トの さ ま ざ
ま な 臓 器 の 癌 に お い てMKが
高 発 現 して お り,発 現 量
が 多 い ほ ど予 後 が 悪 い 傾 向が あ る16).MKの
癌 進 展 へ の
か か わ り,腫 瘍 マ ー カ ー や 遺 伝 子 治 療 へ の 応 用 に つ い
て,現 在 研 究 が 進 め られ て い る.一 次 構 造 は 塩 基 性 残 基
に 富 む の が 特 徴 で,既
知 の 成 長 因 子 との 相 同 性 は 見 い だ
され ず,続
い て 発 見 され た ヘ パ リ ン結 合性 成 長 関 連 因 子
図3
ヒ トのMKとHB-GAM(別 名プ レイ オ トロ フ ィン)の アミ ノ酸配列
共通 す る残 基 を 白抜 き で示 し,ジ ス ル フ ィ ド結 合 を線 で 結 ん だ.(HB-GAM)17,18)と と も に 新 た にMKフ ァ ミ リ ー を 形 成 す る こ と と な っ た.10個 の シ ス テ イ ン を 含 む が,こ れ ら はN末 端 半 分 側,C末 端 半 分 側 で そ れ ぞ れ 架 橋 さ れ て い る こ と か ら19),MKは2つ の ドメ イ ン に 分 け ら れ る と 予 想 さ れ た(図3).以 下 で は,MKのHP認 識 と2量 体 形 成 に つ い て,立 体 構 造 解 析 か ら 得 ら れ た 知 見 を 述 べ る20). な お,紙 数 の 都 合 上,MKの 機 能 に 関 す る 多 くの 文 献 を 割 愛 せ ざ る を え な か っ た.代 表 と し て 村 松 に よ る 総 説14)を 引 用 す る こ と に し,個 々 の 原 著 論 文 に つ い て は そ ち ら を 参 考 に し て い た だ き た い. 1,MK(1-59),MK(62-104)の 構 造 筆 者 ら は,乾 ら に よ り 合 成 さ れ たMK全 長,MK(1-59),MK(60-121),MK(62-104)21)に つ い て,そ れ ぞ れ 2次 元 プ ロ ト ンNMRを 測 定 し,ス ペ ク トル の 帰 属 を 試 み た.し か し,MK全 長,MK(60-121)に つ い て は,シ グ ナ ル の 重 な りが 激 し く,帰 属 を 完 了 で き な か っ た.当 時 は 組 換 えMKの 大 量 発 現 系 が 確 立 さ れ て お ら ず,安 定 同 位 体 標 識 す る こ と は で き な か っ た.MKの 主 要 な HP結 合 活 性,神 経 突 起 伸 長 活 性,PA促 進 活 性 は,い ず れ もC末 端 側 のMK(62-104)に あ る22,23).よ っ て,MK は 機 能 の う え で も,ジ ス ル フ ィ ド結 合 の 架 橋 様 式 か ら も,N,C両 末 端 半 分 の2つ の ド メ イ ン に 分 け ら れ る と 考 え ら れ た.そ こ で 筆 者 ら は,MK(1-59)とMK(62-104) の 構 造 解 析 を 行 な う こ と に し た.図4A,Bに,NMR法 に よ っ て 決 定 し たMK(1-59),MK(62-104)の 立 体 構 造 を 示 す.い ず れ も3本 の β 鎖 か ら な る 逆 平 行 β シ ー ト構 造 で あ っ た.MK(1-59)の β 鎖 を βNl,βN2,βN3,MK (62-104)の β鎖 を βCl,βc2,βc3と よ ぶ こ と に す る(図 4AB右).MK(1-59),MK(62-104)のNOESYを 重 ね 合 わ せ た も の と,MK全 長 のNOESYを 比 較 し た と こ ろ, 両 者 は ほ ぼ 完 全 に 一 致 し た.し た が っ て,MK全 長 に お い て はNC末 端 半 分 ドメ イ ン の 構 造 は 独 立 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た.の ち に 報 告 さ れ た 沈 降 速 度 解 析 の 結 果 も,2つ の ド メ イ ン が 独 立 に 運 動 し う る こ と を 示 し て い る24).
2.HP結
合部位 の同定
MK標
的 細 胞 をヘ パ リチ ナ ー ゼ 処 理 す る と,MKの
神
経 突 起 伸 長 活 性 ・PA促 進 活 性 は 低 下 す る14).こ の こ と
か ら,MKの
機 能 発 現 に は,細 胞 表 面 の ヘ パ ラ ン硫 酸 と
の 相 互 作 用 が 必 須 で あ る と 考 え ら れ る.MKの 主 要 な HP結 合 活 性 はMK(62-104)に あ る の で22),得 ら れ たMK (62-104)の 構 造 を も と に,HP結 合 部 位 に つ い て 考 察 を 行 な っ た.βC2と βC3を 結 ぶ 長 い ル ー プ は 塩 基 性 残 基 を 含 む が,こ の ル ー プ は β シ ー ト側 へ と 湾 曲 し て い る(図 4B).そ の 結 果,β シ ー ト上 の 塩 基 性 残 基(ク ラ ス タ ー 1)と ル ー プ 上 の 塩 基 性 残 基(ク ラ ス タ ー2)と が,同 じ面 上 に 露 出 さ れ て い る(図4C右)土 ほ か に は 塩 基 性 残 基 の ク ラ ス タ ー は 見 ら れ な い こ と か ら,こ の 面 がHP結 合 面 で あ る と 予 想 さ れ た.こ の 予 想 は,MK(62-104)にHP12 糖 を 加 え,相 互 作 用 に 伴 うNMRシ グ ナ ル の 変 化 を 調 べ る こ と に よ り,確 か め ら れ た.こ の 結 果 を 受 け て,Asai ら は ク ラ ス タ ー1,2の 残 基 をGlnに 置 換 し た 変 異 体 を 作 製 し,予 想 ど お りヘ パ リ ン 結 合 活 性 と 神 経 突 起 伸 長 活 性 が と も に 低 下 す る こ と を 示 し て い る25). MK(1-59)もMK(62-104)と 同 様 に 多 く の 塩 基 性 残 基 を 含 む が(図4C左),HP結 合 能 は 低 い.HPを 特 異 的 に 認 識 す る に は,分 子 表 面 に 正 電 荷 が あ る だ け で は な く,そ れ ら が 立 体 構 造 上 で 適 切 な 形 状 の ク ラ ス タ ー を 構 成 す る こ と が 重 要 だ と 考 え ら れ る(後 述).3,HPに
よって誘 起 され るMKの2量
化 と,2量 体 モデル
MKの
神 経 突 起 伸 長 作 用 は,HPに
よ っ て 阻 害 さ れ
る 子 阻 害 作 用 を 示 すHPの
最 短 鎖 長 は,約22糖
で あ
る14).筆 者 ら は 多 角 度 光 散 乱 法 に よ り,MKとHP12,
20,29糖
との 結 合 比 を 調 べ た.解 析 の 結 果,MK-HP12
糖 複 合 体 は1:-で,MK-HP20糖,MK-HP29糖
複 合
体 は い ず れ も2:1で
結 合 し,ま た,フ
リー のMKは.単
量 体 と して存 在 す る こ とが 明 らか に な っ た.以 上 の結 果
よ り,MKの
神 経 突 起 伸 長 作 用 を 阻 害 す る最 短 のHP鎖
長(22糖)と,MKを2量
化 す る の に必 要 なHP鎖
長(約
20糖)は,ほ
ぼ 一 致 す る こ と が 明 らか に な っ た.こ の 解
釈 と して 筆 者 ら は,MKは
単 量 体 よ りも2量 体 の ほ うが
HPに
対 す る 親 和 性 が 高 く,HPが
神 経 細 胞 表 面 の ヘ パ
ラ ン硫 酸 と拮 抗 してMKの
神 経 突 起 伸 長 作 用 を 阻 害 す
る に は,MKを2量
体 と して 強 く結 合 で き る 長 さ のHP
鎖 長 が 必 要 な の で あ ろ う と考 えて い る.
PA活
性 の 促 進 に お い て,MKは2量
体 と し て 働
く26).こ の こ と と上 記 の 結 果 を考 え合 わ せ る と,MKは
単 量 体 と して 存 在 す るが,機
能 を 発 現 す る の は2量 体 と
して で あ り,2量
化 に はHP/ヘ
パ ラ ン硫 酸 の 助 けが 必 須
で あ る と考 え ら れ る.そ
こ で 筆 者 らは,HP上
にお け る
MK2量 体 の モ デ ル を 考 え た.前 述 し た よ う に,MKは 単 量 体 よ り も2量 体 の 状 態 の ほ う がHPに 対 す る 親 和 性 が 高 い と 考 え ら れ る.よ っ て,MK2量 体 は,単 量 体 に 比 べ てHP親 和 性 が 高 く な る よ う な 構 造 を と る は ず で あ る.さ ま ざ ま な モ デ ル を 検 討 し た と こ ろ,MK(62-104) ど う し がhead-to-headと な る よ う に2量 体 を 形 成 し た 場 合,2量 体 界 面 上 に 両 分 子 の ク ラ ス タ ー2ど う し が 集 ま り,新 た に 大 き な 正 電 荷 ク ラ ス タ ー が で き る こ と が わ か っ た(図5A).前 述 の と お り,ク ラ ス タ ー2は 長 い ル ー プ 構 造 を と る(図4B ,C右).head-to-head2量 体 で は,こ の 柔 軟 な ル ー プ がHPの 硫 酸 基 を.上 下か ら 挟 む よ う に フ ィ ッ トす る と 考 え ら れ る(図5B).さ ら に,head-to-head2量 体 で は,正 電 荷 ク ラ ス タ ー がHPの 硫 酸 基 ク ラ ス タ ー と 互 い に よ く.一致 し た 間 隔 で 並 ぶ た め,.単 量 体 に 比 べ て 高 いHP親 和 性 を もつ と考 え ら れ る(図5A). と こ ろ で,こ の と きMK(1-59)は ど の よ う な 相 対 配 置 に あ る の だ ろ う か.主 要 なHP結 合 活 性 はC末 端 半 分 に あ る も の の,N末 端 を 欠 失 さ せ る と,HP結 合 活 性 はMK 全 長 に 比 べ て や や 低 下 す る.N末 端 半 分 も 塩 基 性 残 基 を 多 く含 ん で お り,ま た,C末 端 半 分 と は 独 立 し た 構 造 を と っ て い る こ と か ら,N末 端 半 分 は,C末 端 半 分 の 構 造 を 安 定 化 さ せ る と い う よ り は,弱 い な が ら も 白 身 が 直 接 HPと 相1η1作 川 す る と 思 わ れ る,HP鎖 上 に は 硫 酸 基 が らせ ん 状 に 並 ん で い る た め,図5Aに 示 し た 面 の 裏 側 に も,表 側 と 同 様 に 負 電 荷 が 分 布 し て い る.HP20糖 鎖
図4
MK(1-59),MK(62-104)の 溶 液 構 造20) (A)MK(1-59)の 構 造.両 末 端 部(1-13,53-59)は 構 造 が 収 束 し て い な い た め,図 に は 示 し て い な い.N末 端 か らC末 端 へ を,白 か ら 緑 色 の グ ラ デ ー シ ョ ン で 示 し た.黄 色 は ジ ス ル フ ィ ド結 合.Pro 22は β-バ ル ジ と な っ て い る.(B)MK(62-lO4)の 構 造,N末 端 か らC末 端 へ を,白 か ら 桃 色 の グ ラ デ ー シ ョ ン で 示 した 、 βClに は Asn68-Trp69-G.y70か ら な る β-バ ル ジ が 挿 入 さ れ て い た,(c) MK(l-59)(左),MK(62-lO4)(右)の 空 間 充 填 モ デ ル,分 子 の 向 き はA,Bと 同 じ で,塩 基 性 残 基 の 局 在 し て い る 面 を 示 し た ・塩 基 性 ・ 酸 性,疎 水 性 残 基 を そ れ ぞ れ 青,赤,べ ー ジ ュ で 表 示 し た,図5
HP結 合 によ っ て形 成 され るMK2
量体 のモ デル
(A)MK(62・104)のhead-to-head2量 体 モ デ ル とHP20糖 の 構 造,両 者 が 相 互 作 用 す る と 思 わ れ る 面 を手 前 に 示 した.2量 体 の 境 界 を 白破 線 で示 ず 酸 性,塩 基 性 残 基 を赤 と 青,Glnを 緑,HPの 硫 酸 基 中 の 酸 素 原 子 を ピ ン クで 表示 ・正電 荷 お よ び負 電 荷 の ク ラス ター を,紫 と ピン クの 破 線 で 囲ん だ.(B)(C) はIAを90°,180° そ れ ぞ れ 回転 さ せ た も の ・の 片 側 にMK(62)104)のhead-to-head2量 体 が 結 合 す る と,同 じ 側 にMK(1_59)が 結 合 す る だ け の 余 地 は わ ず か し か な い た め,MK(1-59)は 裏 側 に 結 合 す る 可 能 性 が 高 い と 考 え ら れ る. head-to-head2量 体 モ デ ル は,小 嶋 ら に よ る ト ラ ン ス グ ル タ ミ ナ ー ゼ に よ る 架 橋 実 験 の 結 果 を 説 明 す る こ と が で き る.ト ラ ン ス グ ル タ ミナ ー ゼ を 作 用 させ る とMK は 分 子 間 で 架 橋 さ れ,架 橋 反 応 はHPが 共 存 す る と 強 く 促 進 さ れ る26).架 橋 反 応 に お い て は,MK(1-59)で はGln 42ま た はGln44,MK(60-121)で はGln95が,ア ミ ン 受 容 体 と し て 働 く26).立 体 構 造 上 で はGln95はHP結 合 部 位 の 裏 側 に 露 出 さ れ て お り(図5C),ト ラ ン ス グ ル タ ミ ナ ー ゼ はHPと は 逆 側 か らGln95に 作 用 す る と 考 え ら れ る.head1to-headモ デ ル で は,MK(62-104)のGln95が, も う 一 方 のMK(62-104)のLys63の 近 傍 に 位 置 し て い る こ と に 注 目 さ れ る.ア ミ ン 供 与 体 が ど の 残 基 で あ る か は 同 定 さ れ て い な い が,お そ ら くLys63で は な い か と 予 想 さ れ る.HPが 共 存 す る とMKがhead-to-head2量 体 を 形 成 し,Gln95とLys63が 互 い に 近 傍 に 露 出 さ れ る こ と に よ り,架 橋 が 促 進 さ れ る の で あ ろ う.
お わ り に
MK受 容 体 は ま だ 確 定 さ れ て い な い が,い くつ か の 受 容 体 や 補 受 容 体 の 候 補 が 見 つ か っ て い る 子MKは,シ ン デ カ ン-1,3や リ ュ ー ド カ ン な ど の シ ン デ カ ン フ ァ ミ リ ー と 結 合 す る27∼29).シ ン デ カ ン フ ァ ミ リ ー は,ヘ パ ラ ン 硫 酸 と コ ン ドロ イ チ ン硫 酸 を も つ 膜 貫 通 型 プ ロ テ オ グ リ カ ン で あ る.シ グ ナ ル 伝 達 機 能 を もつ 受 容 体 と し て は, 受 容 体 型 チ ロ シ ン ポ ス フ ァ タ ー ゼPTPζ30)とLDL受 容 体 フ ァ ミ リ ー の 一 員 で あ るLRP31)がMKを 強 く 結 合 す る こ と が 見 い だ さ れ て い る.一 方,MK結 合 に よ っ て チ ロ シ ン リ ン 酸 化 を 受 け,JAK(Janusチ ロ シ ン キ ナ ー ゼ) と 結 合 す る 膜 蛋 白 質 も 報 告 さ れ て い る32).お そ ら く 受 容 体 は,受 容 体 自 身 の も つ 硫 酸 化 糖 鎖 がMKを 結 合 す る か,あ る い は 硫 酸 化 糖 鎖 を も つ 補 助 的 受 容 体 がMKを 細 胞 表 面 に 提 示 し て 受 容 体 に 結 合 さ せ る,と い う 様 式 で MKシ グ ナ ル を 受 け 取 る と 思 わ れ る.MKの 受 容 体 活 性 化 機 構 は 未 知 で あ る が,FGFの 例 か ら も,構 造 生 物 学 的 ア プ ロ ー チ は,シ グ ナ ル 伝 達 機 構 を 解 明 す る う え で 非 常 に 強 力 で あ る と期 待 さ れ る.1)
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