SSH資料（徳島大学総合科学部　佐藤）

だ液タンパク質（α-アミラーゼ）の分析

～電気泳動による分子量決定と酵素活性の測定～

人の体はさまざまなタンパク質から成り立っている。タンパク質とは、20 種のアミノ酸と いう物質が 100 個以上重合して出来る生体高分子である。髪の毛、爪、皮ふなどもタンパ ク質からできており、生体内のタンパク質には、これ以外にもいろいろな種類と機能があ る。このうち、ある化学反応を触媒するタンパク質を特に酵素（こうそ）という。酵素反 応の種類は多岐多様であり、生き物は酵素のおかげで食物を分解して必要な物質を消化吸 収することができたり、低分子化合物から必要な物質を合成したりすることができる。こ の SSH 高大連携事業では、①人のだ液中に存在するタンパク質を電気泳動法により検出し、 ②さらにだ液アミラーゼについてヨウ素―デンプン反応を利用した酵素作用（活性とい う）の検出を行うことにより、だ液中のタンパク質と酵素（α-アミラーゼ）のはたらき について理解を深めることを目的としている。 ＊この実験で自分のだ液を分析したい方は、実験前に採取します。

実験① だ液タンパク質の SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)

による分析

電気泳動について

電気泳動は、「電荷をもつ物質あるいは分子（イオン）を電場に置くと、その電荷と反対 符号の電極方向に移動をはじめる」現象である。電気泳動法は、このときの移動速度の違 いを利用してイオンを分離・分析しようという方法である。電気泳動は、核酸やタンパク 質など電荷を有する分子に適用されるが、電気泳動を行う目的は次のようなものがあげら れる。(1)あるタンパク質の精製の程度（純度）を調べる。(2)部分配列決定のためにタン パク質を分離・精製する（普通の精製が困難な場合）。(3)タンパク質を同定するため、等 電点、組成、分子量、特異反応（酵素反応、抗体との反応）を調べる。(4) タンパク質の 含量を定量する。(5) 各細胞内タンパク質の発現変化の追跡など。 電気泳動には、試料であるタンパク質をそのまま分析する方法（ポリアクリルアミドゲル 電気泳動:PAGE）や、タンパク質を変性させてから分析する方法（SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動:SDS-PAGE）などがある。ここでは後者の SDS-ポリアクリルアミドゲル電 気泳動により、だ液中のタンパク質の分子量について調べる。

－

+

図１ タンパク質の電気泳動概念図 いろいろなタンパク質をゲル（ポリアクリルアミドゲル）に乗せ、電気をかけるとゲル中をタンパク質が 移動する（電気泳動）。ゲルの網目の大きさは一定で、タンパク質がゲル中を移動する距離は分子量や電 荷、会合状態に依存する。ゲルの上部（陰極）および下部（陽極）には緩衝液(pH を一定に保つ液)が満 たされており、ゲルを通して電気が流れる。

SDS－ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動 (SDS-PAGE)

支持体としてポリアクリルアミド・ゲル（下図）を用い、タンパク質を変性条件下で実施 できるようにしたのが SDS-PAGE である。これはタンパク質をβ-メルカプトエタノール（β ME:還元剤）と SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)存在下で加熱し、タンパク質を変性させ、SDS が結合したポリペプチド鎖（立体的な形を持たないタンパク質）の状態とする。SDS の結 合量はタンパク質 1g あたり 1.4g であり、SDS が結合することによりタンパク質は負電荷 を持つ棒状の粒子となり、電気泳動による移動度は長さ（分子量）にのみ依存するため、 SDS-PAGE によりタンパク質の分子量を測定することができる。 図２ アクリルアミドの重合反応 アクリルアミドが重合して出来たポリアクリルアミドはゲル状の物質で、規則正しい網目構造を持つ。

＋SDS

_－

O S O -O O Na+ ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) タンパク質 変性したタンパク質 （ポリペプチド鎖）

高分子の分子量表記

タンパク質のような高分子の分子量（分子質量ともいう）は一般に数値が大きいため、分 子量に単位(D:ドルトン)を付け、キロ(K;103_{)やメガ(M:10}6_{)を使用してケタ数を減らすこ} とで簡便に表示できる。例えば、分子量が 114,000 のタンパク質の場合、この表記法で 114 KDa と簡便に表すことができる。

試薬・装置

＊こちらで準備してあります。 ① ポリアクリルアミドゲル ② 電気泳動装置 ③ 泳動用緩衝液 (25mM Tris-192mM Glycine 緩衝液 (pH 8.3)+0.1% SDS) （①～③は組み立ててあります） ④ マイクロピペット P-20 (1～20μl を取る時に使います)、チップ ⑤ 試料処理液(色素,βME,SDS を含む) ⑥ 分子量マーカー ⑦ だ液試料 ⑧ 1.5ml マイクロチューブ

実験手順

(1) だ液試料(⑦)10ul および試料処理液（⑤）2ul をマイクロチューブに入れる。 混合し、100℃,5 分加熱する。 (2) ポリアクリルアミドゲル中のレーン（溝）に、(1)の試料 5μl をマイクロピペットを 用いて静かに注入する。各自、1 レーンずつ使用する。分子量マーカー(⑥)は、その まま 5ul を空いているレーンに注入する。 (3) 電気泳動装置の電源をセットし、約 30 分間電気泳動を行う。 (4) 泳動終了後、ゲルを取り出し、染色液で 30 分間加温染色する。 図3 ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の作用 SDS は界面活性剤(洗剤の仲間)の一種で、タンパク質の三次元的な形を破壊し、機能を失わせる（変 性という）。

(5) 脱色液で 30 分間加温脱色する。ゲル中のタンパク質があるところ（バンド）は染色 されたままであるが、その他の部分は脱色される。その後、ゲルを写真撮影する。 (6) 分子量マーカーと対比させ、だ液中のタンパク質の種類と分子量を推定する。 （参考）電気泳動からの正確な分子量を求める ためには、まず図 5 のように、分子量マーカー の各バンドの Rf 値を求めます。これを用いて、 横軸に分子量マーカーの Rf 値（表１）、縦軸に log10(分子量)をプロットしたグラフ（検量線: 図 6）を作成します。得られた直線の式を y= ax + b とします。次に、試料の各バンドの相対移 動度(Rf という)を求め、先ほどの式の x に代入 して、y を求めます。求めるタンパク質の分子 量は、10 y (KDa)となります。 図5 電気泳動 (SDS-PAGE) の例 1.分子量マーカー, 2.~4. 試料の例 タンパク質はバンドとして検出される。 各バンドの相対移動度 (Rf) は Y/X で求められる。 Xはゲルの上端から下端までの長さ、Yはゲルの 上端から各バンドの位置までの長さである。

1 2 3 4

上端 下端 バンドの位置 X Y lo g10 (分子量） Rf 図6 検量線の例 図5のレーン1.分子量マーカーで見られる各バン ドの相対移動度 (Rf) を求める。横軸に各バンド のRfを、縦軸に各バンドのlog10(分子量）をプロッ トし、直線の式を求める。次に、試料のバンドの Rfを求め、先の検量線の直線式のxに代入する。 これより、目的のバンドの分子量は10y_(kDa)とな る。 y = ax + b 求めたい バンドのRf 分子量 (kDa) 207 114 78.4 53.0 35.7 28.3 19.3 6.9 表 1 分子量マーカーの各バンドの分子量と対数値 分子量 (kDa) log10(分子量) （y の値） 分子量 (kDa) log10(分子量) （y の値） 207 2.32 35.7 1.55 114 2.06 28.3 1.45 78.4 1.89 19.3 1.29 53.0 1.72 6.9 0.84 図4 電気泳動 (SDS-PAGE) 模式図 1.分子量マーカー, 2. 試料の例 各バンド(A,B,C)は、それぞれ異なるタ ン パ ク 質 で あ る こ と を 示 す 。 A は 53.0~78.4kDa、B は35.7~53.0kDa、C は 6.9kDa~19.3kDaの分子量を持つことが わかる。

1 2

－

+

分子量 (kDa) 207 114 78.4 53.0 35.7 28.3 19.3 6.9 泳動方向

実験② だ液のα―アミラーゼ活性の分析

人は食物として摂取した高分子を、低分子に分解するさまざまな消化酵素（表２）を持 っている。食物に含まれる高分子としては、多糖類、タンパク質、脂質などがあり、その ままでは栄養素として吸収が難しい。そこで消化酵素で低分子化することにより腸管から 吸収される。人のだ液は一日で約 1L 生産され、このだ液中にも消化酵素の一種であるα-アミラーゼが存在し、デンプン（多糖類：グルコースが多数結合したもの）をマルトース （麦芽糖：二糖類でグルコースが 2 分子結合したもの）に加水分解するはたらきを行う。 このマルトースは小腸でマルターゼという別の消化酵素でグルコース（ブドウ糖）2 分子に 分解され、腸管から吸収される。 α―アミラーゼはだ液腺やすい臓から分泌される、分子量約56,000（56KDa）のアミノ 酸が約500 個つながった酵素（タンパク質）である。デンプンの加水分解反応には、α― アミラーゼが三次元的に決まった形（図7）をとり、Ca が結合していなければならない。 また、α―アミラーゼが作用する最適な温度やpH がある（無機触媒と異なる）。デンプン の存在はヨウ素―デンプン反応によりむらさき色～こげ茶色になることで検出されるが、 α―アミラーゼによりデンプンが分解されると、ヨウ素―デンプン反応が薄くなる。この 実験では、だ液中のアミラーゼの作用によるデンプンの加水分解率を調べ、活性に与える 要因について考察する。 表２ 種々の消化酵素の作用 酵素の種類 作用 はたらく場所 だ液アミラーゼ ご飯（でんぷん）を麦芽糖に分解する 口 ペプシン 肉（タンパク質）をペプチドに分解する 胃 トリプシン 肉（タンパク質）をペプチドに分解する すい臓、小腸 リパーゼ 油(脂質）を分解する すい臓 図 8 ヒトだ液α―アミラーゼの三次元立 体構造 タンパク質は、いろいろな原子同 士の相互作用により特定の三次元的な形 を形成することで機能を発揮する。 図 7 デンプンを構成するアミ ロースと アミロペクチン デンプンは、アミロース75％、 アミロペクチン 25%の混合物 である。両者ともグルコースが 縮合したものであるが、縮合様 式が異なる。 このくぼみ（活性部位）でデンプンを分解する。 カルシウム

試薬・装置

① 試験管5～6 本（対照実験用、各自だ液用） ② スポイト2 本（デンプン用、発色液用） ③ 0.1%(w/v) 可溶性デンプン(pH 7.0) ④ 2×発色液（0.33%(w/v)ヨウ素―3.3%(w/v)ヨウ化カリウム液） ⑤ 蒸留水 ⑥ 各自のだ液試料 ⑦ 吸光度計

実験手順

(1) ①の「対照」（班で共通）「pH 7」（各自）試験管を準備する。「対照」試験管には蒸留 水0.1 ml を、「pH 7」試験管には、だ液試料を 0.1ml ずつ入れる。 (2) 「対照」と「pH 7」の試験管に、③の可溶性デンプン(pH 7)を 1ml 入れる。 これらの試験管をミキサーで混合する。 (3) (2)の試験管を、37℃の湯浴に 5 分つける。 (4) 試験管を湯浴から取り出し、試験管の外側をふき取る。 (5) 試験管に発色液 1ml ずつ加える。ミキサーで混合する。 (6) 室温で 5 分間放置する。 (7) 吸光度計を用いて、各試験管の 660nm の吸光度を測定する。 *値が安定しない時には、セットして 5 秒後の値を読み取る。 (8) 以下のように結果を表にまとめる。 対照 A 君 B さん C 君 D さん 吸光度 分解率(%) - 吸光度の行には、(7)で測定した吸光度の値を記録する。 分解率(%)はデンプンの分解された割合で、下記の式で求められる。 分解率(%) = 100 ― {(「pH 7」各々の吸光度)／（対照の吸光度）×100} 各試験管の発色の違いも観察する。アミラーゼ活性の違いの要因について、電気泳動の結 果と併せて考察する。 (9) 余裕のある人は、pH 4 での活性も試してみてください。 質問等は下記までお願いします。この資料は、下記HP からダウンロードできます。 http://www.geocities.jp/satokichi2004jp/syllabus/jyugyou.htm