博 士 （ 薬 学 ） 平 野 良 憲
学位論文題名
Structural and funCtionalanalySeS OftheproteinSinVOlVedinCe11polarity
（細胞極性に関与するタンパク質群の構造および機能に関する研究）
学位論文内容の要旨
生 命は 1 つの 胚細 胞から 発生し ，多様 な性 質をも つ細胞へと分化して組織や器官を形成する．このた め には細 胞に ¨極性 が生 じ，細胞が秩序だって非対称に分裂する必要がある．また上皮細胞やニュー 口 ンは高 度に 極性化 したシ ステムを持っており，極性発現は細胞が正常に機能するために必須である，
近 年 ，atypical プ ロ テ イ ン キナ ー ゼC(aPKC) ，Par6 ，Par3 の 三者 複 合 体 か らな る Par 複 合 体 が 細 胞 極性の 普遍 的な制 御因子 である ことが 明ら かとな ってきた．Par 複合体は線虫から哺乳類に至るまで 進 化的に 保存 され， 胚細胞 の非対称分裂，上皮細胞の密着結合やニュー口ンの軸策形成など多種の細胞 極 性 を 制 御 して い る．ま たPar 複合体 と三 量体G タン バク質 を介し たシグ ナル伝 達経 路が協 調的に 細 胞 骨格の 再編 成を制 御する ことが 示唆さ れて いる． 本研究 はPar 複合体 を中 心とし た細胞 極性に関与 す るタン バク質群の時空間的な制御機構の解明を目指して行い，P ・ar 複合体形成機構とその局在制御に つ いて新 たな 知見が 得られ た．
Par 複 合 体 の う ち，aP ・ KC と Par6 は PB1 ドメ イン 同士の 相互作 用を介 して複 合体 を形成 する， PB1 ド メイン 間の 相互作 用を欠 失した変異体ではその局在に異常が見られることから，この相互作用が重要 で あ る と 考 えら れ る．PB1 ドメ インは PB1 ド メイ ン同士 が相互 作用し ，夕 ンバク 質問相 互作用 を担う モ ジ ュ ー ル とし て 同定さ れた，PB1 ド メイ ン間の 相互作 用は非 常に特 異的 であり ，面ガ m ， わ心朋 の 双 方にお いて 特定のPB1 ド メイン 同士の みが 結合す る．し かしそ の特異 性を 規定す る要因 など，相互 作 用様式 の詳 細は明 らかと なって いない ．そ こでPB1 ドメ インの 詳細な 相互 作用機 構と細 胞内での機 能 解明の ため ，単体 および 複合体 の立体 構造 解析を 行った ．
aPKC 、 の PB1 ド メ イ ン 単体 の 構 造 を NMR で ， PKC ｜ と Par ぬ 、 の PB1 ド メ イ ン複 合 体 の立 体構造 を X 線 結 晶 構 造解 析 によ ってそ れぞれ 決定し た．PKC ｜ とPar6a のPB1 ドメイ ンは ともに ユビキ チンフ オ ー ルドを とり ，立体 構造の 相同性は非常に高かった．しかし複合体中において，それぞれが異なる領域 を 相互作 用面 として 非対称 なヘテ ロ二量 体を 形成し ていた ，PKC ｜では PB1 ドメイン内で保存されてい る 酸 性 残 基 と疎 水 性 残 基 から な る 0PCA モ チ ー フ と呼 ば れ る 領 域の 酸 性 残 基 が， 一 方 のPar6a では 0PCA モチー フとは 立体構 造上 反対側 に位置 する塩 基性 残基が それぞ れ静電相互作用していた，密着結 合 形 成 に お けるPB1 ドメ イン相 互作用 の役 割につ いて検 証した ．立体 構造 情報に 基づい てPar6 の PB1 ド メイン との 相互作 用を欠 失したPKCl 変異 体を作 製し ，過剰 発現さ せたところ密着結合の形成を阻害 し た ， よ っ てPB1 ド メイ ン を 介 し たPar6 と の結 合がaP ・ KC によ る密着 結合形 成の制 御に 必要で ある こ とが明 らか となっ た．
PB1 ド メ イ ン 複 合体 は 本 研 究 で明 ら か にした aPKC ′Par6 複合体 の他に ，p40m 呵 p67m の 構造が 最 近 明らか にさ れた． 両複合 体の相互作用様式を比較すると，いずれの複合体においても保存された残基
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間 の 相 互 作 用 は 保 存 さ れ て い た ． し か し 両 複 合体 の 立 体 構 造 を 重 ね合 わ せ る と ， ド メイ ン 間 の 配 向 に 違 い が あ る こ と が 分 か っ た ， こ の 配 向 の 変 化 に 伴い ， そ れ ぞ れ に 特 異的 な 相 互 作 用 面 が存 在 し て い た ． つ ま り ，PB1ド メ イ ン は ド メ イ ン 問 の 配 向 を 変 化 さ せ る こ と で 特 異 性 を 生 み 出 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た ， 他 の タ ン バ ク 質 問 相 互 作 用 に つ い て 検 索 し た と こ ろ ，Ras binding domainと 低 分 子 量G夕 ン バ ク 質Ras，RaplAの 相 互 作 用 に お い て も ， 同 様 に 配 向 の 変 化 が 分 子 認 識 の 特 異 性 を 見 出 し て い る こ と が 分 か っ た ， こ の よ う に タ ン パ ク 質 問 相 互 作 用 にお い て ， ド メ イ ン 間の 配 向 を 変 化 さ せる こ と で 特 異 性 を も た ら す 方 法 は ， 生 命 が 進 化 の 過 程 で 生 み 出 し た 普 遍 的 な 戦 略 で あ る 可 能 性 を 示 唆 し た ． 一 方Par3は 複 数 の ド メ イ ン か ら な る マ ル チ ド メ イ ン タ ン バ ク 質 で あ り ，PDZド メ イ ン が3つ 存 在 し て い る(N末 端 側 か らPDZ1，PD22，PD23). PDZド メ イ ン は 一 般 的 に 膜 タ ン バ ク 質 な ど のC末 端 と 相 互 作 用 し て タ ン バ ク 質 の 局 在 に 関 与 す る た め ，Par複 合 体 の 局 在 に 機 能 し て い る と考 え ら れ るPDZ ド メ イ ン に 着 目 し た ．Par3のPDZ1は 上 皮 細 胞 の 密 着 結 合 の 構 成 因 子 のJAMやPar6と 結 合 す る が ， PD22， PD23に 対 す る 結 合 相 手 は 同 定 さ れ て い な い ， 本 研 究 で はPar3のPD23と 結 合 す る タ ン パ ク 質 と し て 新 規 に 同 定 さ れ た 上 皮 細 胞 の 密 着 結 合 の 形 成 に 関 与 す る 分 子 ，Par3BMPと の 相 互 作 用 様 式 の 詳 細 を 明 ら か と す る こ と を 目 的 と し た ，
Par3BMPは 一 回 膜 貫 通 型 の 膜 夕 ン パ ク 質 でC末 端 にPDZ結 合 配 列 を 有 し て い る ．PDZ結 合 配 列 の す ぐN末 端 側 に はSer残 基 が 多 数 存 在 し て お り ， ま た カ ゼ イ ン キ ナ ー2(CK2)の り ン 酸 化 コ ン セ ン サ ス 配 列 に も 相 当 し ， 生 体 内 に お い て り ン 酸 化 さ れ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る ．PDZド メ イ ン と 結 合 リ ガ ン ド の 結 合 が り ン 酸 化 に よ り 調 節 さ れ る 例 が い く っ か 知 ら れ て い る た め ，Par3 PD23とPar3BMPの 結 合 に お い て も り ン 酸 化 に よ る 調 節 機 構 が 存 在 し な い か 検 討 し た ， リ ン 酸 化 ミミ ッ ク 体 を 用 い た 血vitro プ ル ダ ウ ン ア ッ セ イ の 結 果 ，CK2の り ン 酸 化 コ ン セ ン サ ス 配 列 に 相 当 す るSerをAspに 変 異 し た り ン 酸 化 ミ ミ ッ ク 体 で は 野 生 型 よ り 結 合 が 強 く な っ た ．PDZド メ イ ン の 相 互 作 用 に お い て は り ン 酸 化 に よ り 結 合 が 弱 く な る 例 が 多 く ， 結 合 が 強 く な る 例は あ ま り 報 告 さ れ てお ら ず 興 味 深 い ．ま た ミ ミ ッ ク 体 で は な く り ン 酸 化Ser360に よ るPar3 PD23に 対 す る 結 合 へ の 影 響 を 検 証 し た ．NMRに よ る 滴 定 実 験 を 行 い ，16N標 識 し たPar3 PD23の 化 学 シ フ ト 変 化 を 追 跡 し た と こ ろ ， 非 リ ン 酸 化Par3BMPで は 化 学 シ フ ト 変 化 が 飽 和 す る ま で 約2.5当 量 の 滴 定 量 を 要 し た が ， リ ン 酸 化Par3BMPで は 約1.0当 量 で 飽 和 し た ． し た が っ て ，Par3BMPとPar3a PD23の 相 互 作 用 は り ン 酸 化 に よ っ て 増 強 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た ，
次 にPar3a PD23単 体 お よ びPar3BMPリ ン 酸 化 ミ ミ ッ ク 体 と の 複 合 体 の 立 体 構 造 をNMR法 に よ り 決 定 し た ， Par3a PD23とPar3BMPは 分 子 間 で 逆 平 行D． シ ー ト を 形 成 し ，Par3BMPのC末 端3残 基 はPar3 PD23上 に 存 在 す る 疎 水 性 の 溝 に は ま り 込 む よ う に し て 相 互 作 用 し て い た ， ま た ， リ ン 酸 基 を ミ ミ ッ ク し たAspは 他 のPDZド メ イ ン で は 見 ら れ な いP．ar3 PD23特 有 の 塩 基 性 残 基 の 集 積 し た 正 電 荷 の ク ラ ス タ ー と 静 電 相 互 作 用 す る こ と で 相 互 作 用 を 強 め て い る こ と が 明 ら か と な っ た ．
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