学位論文内容の要旨

博 士 （ 薬 学 ） 有 馬    隆

学 位 論 文 題 名

脳細胞における一酸化窒素産生系とその調節機構に関する研究

学位論文内容の要旨

  内 皮 由 来 弛 緩 因 子 （EDRF)と し て 発 見 さ れ た 一 酸 化 窒 素(NO)は 広 汎 な 生 命 現 象 に 深 く 関 与 し て い る 。 脳 細 胞 に お け るNO合 成 酵 素(NOS)と し て は 、 神 経 細 胞 由 来 のnNOSと グ リ ア 細 胞 由 来 のiNOSが 存 在 し 、 産 生 さ れ るNOは シ ナ プ ス の 可 塑 性 に お け る 逆 行 性 伝 達 物 質 と し て 、 あ る い は 神 経 細 胞 死 に お け る 原 因 物 質 と し て 作 用 す る と さ れ て い る 。nNOSお よ びiNOSの 活 性 調 節 機 構 な ら び に 酵 素 蛋 白 質 の 誘 導 機 構 に つ い て は 詳 細 に 研 究 さ れ て い る が 、 本 酵 素 の 基 質 結 合 活 性 の 調 節 機 構 、 お よ び 基 質 選 択 性 に つ い て は ほ と ん ど 研 究 さ れ て い な い 。 ま た 、NO産 生 機 構 に つ い て もNOSだ け で 完 全 に 説 明 で き る と は 言 え な い 。 本 研 究 に お い て は 、1） 脳nNOSの 基 質 親 和 性 調 節 機 能 に 対 す る 補 助 因 子 の 影 響 、2） 脳 nNOSとiNOSに お け るL・Arg含 有 ベ プ チ ド 性 神 経 伝 達 物 質 に 対 す る 基 質 特 異 性 、3） 神 経 細 胞 の モ デ ル 細 胞 に お け る 新 規NO産 生 系 の 可 能 性 に つ い て 検 討 し た 。

1、 ラ ッ ト 小 脳nNOSに 対 す る 基 質 結 合 親 和 性 の 調 節 と NO生 成 の 調 節   nNOSの 活 性 発 現 に 必 須 と さ れ る 補 助 因 子 のNOの 生 成 過 程 に お け る 役 割 に つ い て は 明 ら か に さ れ て い る が 、 酵 素 反 応 の 第 一 ス テ ッ プ で あ る 基 質 と 酵 素 の 結 合 に 対 す る こ れ ら 補 助 因 子 の 調 節 的 役 割 に 関 し て は 明 ら か に さ れ て い な い 。 そ こ で 、L−Arg誘 導 体 でNOSの 基 質 結 合 領 域 に 結 合 す る ［3H]NNAを 用 い て nNOSへ の 基 質 結 合 調 節 機 構 の 検 討 を 行 っ た 。nNOS標 本 の ラ ッ ト 小 脳 可 溶 性 画 分 に お い て 、BH、NADPHお よ ぴCa2゛ の 非 存 在 下 で 認 め ら れ た ［3H］NNA結 合 はCa2十 ま た はNADPH単 独 で は 影 響 を 受 け な か っ た が 、BH。 の 存 在 下 で 増 加 しBH／NADPHで は さ ら に 増 加 し た 。 し か し な が ら 、 以 上 の 条 件 で は ［1℃ ］L― Argか ら の ［14C］L−citrullineの 産 生 は 認 め ら れ な か っ た 。BH/NADPHにCa2＋ を 添 加 し て も さ ら な る ［3］NNA結 合 の 増 加 は 認 め ら れ な か っ た が 、 こ の 条 件 に おい て のみt4C］L―citrumneの産 生が 認め られ た。 また 、Scatcham解析の結果、

結 合 活 性 の 増 加 は 親 和 性 の 増 加 に よ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 こ の こ と は 、 BHdとNADPHが ［3H］NNA結 合 親 和 性 に 対 し て ア ロ ス テ リ ッ ク な 調 節 を 行 つ て い る こ と を 示 唆 し て い る 。 ラ ッ ト 小 脳 よ り 精 製 し たnNOSに お い て も 同 様 な 結 果 が 得 ら れ た 。 以 上 の 結 果 よ り 、BH4／NADPHはnNOSの 基 質 親 和 性 に 対 し ア ロ ス テ リ ッ ク な 調 節 を 行 っ て い る こ と 、Ca2ッCaMはnNOSの 基 質 親 和 性 に は 影 響 せ ず 、 酵 素 反 応 ス テ ッ プ の ト リ ガ ー で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。

2、 ラ ッ ト 脳NOSイ ソ 酵 素(nNOSとiN〇S） に お け る 基 質 特 異 性 の 相 違   NOはL−Argのguanidino基か ら生成さ れるため 、L―Arg含有 ペプチド性 神経 伝 達 物 質 もNOSの 基 質 に な る 可 能 性 が 考 え ら れ る が、 脳nNOS、iNOSに 対 す る基 質として の作用様 式の相違 の有無に ついては明らかではない。そこで、各 イ ソ酵素に おける[3H]NNA結 合、NO産生 活性に対 する内因性 鎮痛物質L―Tyr一 L−Arg（L−kyotorphin：L―KTP)の 作用につ いて検討を行った。nNOS標本であ る ラ ッ ト 小 脳 可 溶 性 画分 に おい てL‑KTPは ［3H]NNA結 合を 抑 制 した が 、L‐ KTP分 解酵素阻 害薬のbestatinの 添加によ り作用が 減弱し、Hill係 数も低下 し た。L―KTP拮抗薬であるLーLeu−L−Argでも同様な作用が認められたことから、

こ の抑制作 用がKTP受容 体を介す るもので はなく、L―Arg含有ベプ チドの分 解 に よ り 生 じ たL−ArgがnNOSへの ［3H]NNA結 合 に 拮抗 し たと 考 え られ る 。一 方 、 初代 培 養 した ラ ット 脳 グ リア 細 胞を り ポ 多糖(LPS)処 置し て誘導し て得 たiNOS標本にお いては、L−KTPの添加 によりnitriteの 蓄積が確認 されたが 、 この作用はbestatinによって影響を受けなかった。また、L−Leu−L―Argにおいて も同 様であっ た。この 結果はiNOSがL―Arg、L―KTP、L‑Leu―L―Argを基質とし て 区 別し な い こと を 示し て い る。以上 の結果から 、nNOSはL―Arg含 有ペプチ ド を 基質 と す ると は 考え に く いが 、iNOSはL‑Arg含有 ペ プチ ドを直 接的に基 質として利用しNOを産生し得ると考えられる。

3、 NG108‑15細 胞 の 5‑HT応 答 性 cGMP産 生 機 構 に お け る NOの 関 与   神 経細 胞 のモ デ ル であ るNG108―15細胞 において 、5―HT誘発cGMP産生に、

5―HL受 容 体 を 介 し てCa2+/CaM/NOS系 に よ りNOを産 生 す る機 構 と、Ca2゛ 非 依 存 性の未 知の機構 が報告され ている。 後者にお いては、ANP受容体様 膜結合 型 の グ アニ ル 酸シ ク ラ ーゼ （GC)の 可 能 性が 示 唆 され て いる が 詳細は 明らか で は ない。 そこで、 この．cGMP産生 機構の解 明を試み た。NG108−15細 胞の膜 画 分 を5ーHT刺 激し て もcGMP産生 は 認め ら れ ず、 少 なく と も 可溶 性画分に 存 在 する因子 が必要で あることが明らかになった。Ca2十非存在下、無傷細胞にお い て 、 可 溶 性GC阻 害薬methylene blueお よ び細 胞 膜 非透 過 性NO選 択的 捕 捉 薬carboxyPTIOに よ り5−HT誘 発cGMP産 生 が 阻 害 さ れ た が 細 胞 膜 非 透 過 性 NO捕 捉薬 のoxyhemoglobinで は阻 害 が認 め ら れな か っ たこ と から 細胞内で の NO産 生 が 強 く 示 唆 さ れ た 。 し か し な が ら 、 膜 透 過 性Caキ レ ート 薬BAPTA− AM、CaM拮 抗 薬 W− 7、 NOS阻 害 薬NAME、NIO、NMMA、NNAに よ る 抑 制 を 受 け なか っ たこ と か らNOSの 関与 は 否 定さ れ た 。一 方 、無 刺 激細胞 におい て 、 細 胞内 にnitratとnitrosothiol (RSNO)，が 検出され、5−HT刺激に より nitrateの 増加とこ れに呼応 したRSNOの低下 が認めら れた。細 胞外にお いては い ずれの物 質も検出 されなか った。以上 の結果か らNG108―15細胞のCa2゛非依 存 性 の5ーHT誘 発cGMP産 生 機 構に お いて は 、5‑HT刺激 に より 細 胞内に 貯蔵さ れ たRSNOか らNOが 産 生 さ れ 可 溶 性GCを 活 性 化 す る こ と に よ りcGMPが 産 生 されると 考えられ る。また 、5−HT刺激に よるnitrateとRSNOの濃度変化は、

刺 激後2 ‑ 2.5分で ピークになった後それぞれ初期値に向かって変化したことか ら 、 nitrateを RSNOに 再 生 す る 機 構 の 存 在 が 示 唆 さ れ た 。

学 位 論 文 審 査 の 要旨 主 査

副 査 副 査 副 査

教授 教授 助教授 助教授

野 村 長 澤 徳 光 高 橋

学 位 論 文 題 名

靖 幸 滋 治 幸 子 和 彦

脳細胞における一酸化窒素産生系とその調節機構に関する研究

  申 請 者 は 、 脳 細 胞 に お け る 一 酸 化 窒 素(NO)産 生 系 と そ の 調 節 機 構 に 関 す る 研 究 を 進 め て き た が 、 今 回 、NO合 成 酵 素(NOS)の 基 質 結 合 性 に お け る 補 助 因 子 の 役 割 、NOSイ ソ 酵 素 に お け る 基 質 特 異 性 の 相 違 を 明 ら か に し 、 さ ら に NOSを 介 さ な い 新 規 なNO産 生 系 の 存 在 を 明 ら か に し 、 本 学 位 論 文 と し て 申 請 した 。

  内 皮 由 来 弛 緩 因 子(EDRF)と し て 発 見 さ れ たNOは 広 汎 な 生 命 現 象 に 深 く 関 与 し て い る 。 脳 組 織 に お け るNOSと し て は 、 神 経 細 胞 由 来 のnNOSと グ リ ア 細 胞 由 来 のiNOSが 存 在 し 、 産 生 さ れ るNOは シ ナ プ ス の 可 塑 性 に お け る 逆 行 性 伝 達 物 質 と し て 、 あ る い は 神 経 細 胞 死 に お け る 原 因 物 質 と し て 作 用 す る と され てい る。

  nNOSの 活 性 発 現 に 必 須 と さ れ る 補 助 因 子 のNO生 成 過 程 に お け る 役 割 に つ い て は 明 ら か に さ れ て い る が 、 酵 素 反 応 の 第 一 ス テ ッ プ で あ る 基 質 と 酵 素 の 結 合 に 対 す る こ れ ら 補 助 因 子 の 調 節 的 役 割 に 関 し て は 明 ら か に さ れ て い な い 。 そ こ で 、L―Arg誘 導 体 でNOSの 基 質 結 合 領域 に結 合す る[3H]NCーnitro−Lーarglmne (NNA)を 用 い てnNOSへ の 基 質 結 合 調 節 機 構 の 検 討 を 行 っ た 。nNOS標 本 の ラ ッ ト 小 脳 可 溶 性 画 分 に お い て 、BH、NADPHお よ びCa2゛ の 非 存 在 下 で 認 め ら れ た ［3H］NNA結 合 はCa2十 ま た はNADPH単 独 で は 影 響 を 受 け な か っ た が 、 BH4の 存 在 下 で 増 加 しBH・ ・4／NADPHで は さ ら に 増 加 し た 。 し か しな がら 、以 上 の条 件で は［14C］L‐Argからの［14C］L―citrIlmneの産生は認められなかった。一 方 、BH：d／NADPHにCa2゛ を 添 加 し て も さ ら な る ［3H］NNA結 合 の 増 加 は 認 め ら れな かっ たが 、こ の条 件に おい て のみ ［1゜C］L−citrumneの産生が認められた。ま

た、Scatchard解析の結 果、結合 活性の増加は親和性の増加によることが明らか に な っ た 。 こ の こ と は 、BH4とNADPHが[3H]NNA結 合 親 和 性 に 対 し て ア ロ ステ リックな 調節を行 っている ことを示唆 している 。ラット 小脳より精製した nNOSに お い て も 同 様 な 結 果 が 得 ら れ た 。 以 上 の 結 果 よ り 、  BH,/NADPHは nNOSの 基 質親 和性 に対しア ロステリ ックな調 節を行っ ているこ と、Ca2+/カル モ ジ ユ リ ン(CaM） はnNOSの 基質 親 和性 に は 影響 せ ず 、酵 素 反応 ス テ ップ の トリガーであることが明らかになった。

  NOはLーArgのguanidino基から 生成され るため、L−Arg含有ベ プチド性 神経 伝 達 物 質 もNOSの 基 質 に な る 可 能 性 が 考 え ら れ る が 、 脳nNOS、iNOSに 対 す る基質と゛し、ての作用様式の相違の有無については明らかではない。そこで、各 イ ソ 酵素 に おけ るPH］NNA結 合、N0産生 活性に対 する内因 性鎮痛物 質LーTリ―

L―Arg（L−kyoto叩hin：L−KTP）の作用について検討を行った。nNOS標本である ラ ッ ト小 脳 可溶 性画分 においてL‐KTPは［3H］NNA結合を抑 制したが 、L‐KTP 分 解 酵素 阻 害薬 のbestatinの添 加により 作用が減 弱し、Hm係 数も低下 した。L

‐KTP拮 抗薬であるL―LeuIL―Argでも同様な作用が認められたことから、この抑 制 作 用がKTP受容 体を介す るもので はなく、L−Arg含有ペ プチドの 分解により 生 じ たL‐ArgがnNOSへ の ［3用NNA結 合 に拮 抗 し たと 考 えら れ る 。一 方 、 初 代 培 養し た ラッ ト 脳 グリ ア 細 胞を り ポ多 糖 （LPS） 処 置に よ り 誘導 し て得 た iNOS標 本 にお い ては 、L−KTPの添 加 によ りnimteの 蓄 積が 確 認さ れ た が、 こ の作 用はbesta血に よって影 響を受けなかった。また、L−kuIL‐Argにおいても 同様 であった 。この結 果はiNOSがL―Arg、L―KTP、L−ku―L―Argを基質として 区 別 しな い こと を 示 して い る 。以 上 の結 果 から、nNOSはL−Arg含有 ペプチド を 基 質と す ると は 考 えに く い が、iNOSはL一A昭 含有ペプ チドを直 接的に基質 として利用しNOを産生し得ると考えられる。

  神経 細 胞 のモ デ ルで あ るNG108ー15細 胞に おいて 、5―HT誘発cGMP産生に、

5−HT3受 容 体 を 介 し てCa2ッCaMNOS系に よ りN0を 産生 す る機 構 と 、Ca2＋ 非 依 存 性の 未 知の 機構が 報告され ている。 後者にお いては、ANP受容体様膜 結合 型 の グア ニ ル酸 シ ク ラー ゼ （GC） の可 能 性 が示唆さ れている が詳細は明 らか で は ない 。 そこ で 、 このcGMP産 生機 構 の 解明 を 試 みた 。NG108−15細 胞 の膜 画 分 を5‐HT刺激 し て もcGMP産 生 は認 め ら れず 、 少 なく と も可 溶 性 画分 に存 在す る因子が 必要であ ることが 明らかになった。Ca2＋非存在下、無傷細胞にお い て 、 可 溶 性GC阻 害 薬memyleneblueお よ び 細 胞 膜 透 過 性N0選 択 的 捕 捉 薬 carboxy冏Oに よ り5―HT誘 発cGMP産 生 が 阻 害 さ れ た が 細 胞 膜 非 透 過 性NO

捕 捉 薬のoxyhemoglobinで は 阻害 が 認め ら れ なか っ た こと か ら細胞 内でのNO 産 生 が強 く 示唆 さ れ た。 し か しな が ら、 膜 透 過性Caキ レ ー ト薬BAPTA―AM、 CaM拮抗薬W−7、NOS阻害薬NNA、NG―nitro−L−arginine methyl ester、NG̲iminoー ethyl−L−omithine、NO―monomethyl―L―argmmeによる抑制を受けなかったことから NOSの 関与 は 否定 さ れ た。 一 方 、無刺激 細胞にお いて、細 胞内にはnitrateと nitrosothiol (RSNO)が検出され、5−HT刺激によりnitrateの増加とこれに呼応 し たRSNOの低 下 が認 め ら れた 。 細胞外に おいては ぃずれの 物質も検 出されな か っ た。 以 上の 結 果 からNG108−15細 胞 のCa2十 非 依 存性 の5ーHT誘 発cGMP産 生 機 構 に お い て は 、5‑HT刺 激 に よ り 細 胞 内 に 貯 蔵 さ れ たRSNOか らNOが 産 生 さ れ 可 溶 性GCを 活 性化 す る こと に よ りcGMPが 産 生さ れ る と考 え られ る 。 ま た 、5‑HT刺 激 によ るnitrateとRSNOの 濃 度変 化 は 、刺 激 後2‑ 2.5分でピー ク にな った後そ れぞれ初 期値に向か って変化 したこと から、nitrateをRSNOに 再 生 する 機 構の 存 在 が示 唆 さ れた。 このよう に、5−HT情 報伝達にNOSを介さ ない新規なNO産生系の存在が示唆された。

  以上、 審査委員 会は、本 論文をNOSの基 質結合性 における 補助因子 の役割、

NOSイ ソ 酵 素 に お ける 基 質特 異 性 の相 違 、さ ら に 、NOSを 介 さな い 新規 なNO 産生 系の存在 に関して 新知見を 得た内容で あると判 定し、博士（薬学）の学位 を受けるに十分値するものと認めた。