学 位 申 請 論 文
B 型 肝 炎 ウ イ ル ス 由 来 ポ リ メ ラ ー ゼ の in vitro DNA 伸 長 反 応 の 解 析 お よ び 新 規
非 核 酸 系 阻 害 化 合 物 の 同 定
2020 年 3 月
中 嶋 章 悟
目 次
目 次. . … ……… ……… ……… ………2
略 語 一 覧.. . . …… ……… ……… ………3
要 旨. . … ……… …… ……… ……… ………… … 5
第 一 章 B 型 肝 炎 ウ イ ル ス (HB V ) ポ リ メ ラ ー ゼ D NA 伸 長 活 性 を 阻 害 す る 非 核 酸 系 化 合 物 の 同 定
第 一 節 序 論. …… ……… … ……… ……… …… . . 8 第 二 節 方 法. …… ………… ……… ……… …… 1 0 第 三 節 結 果. …… ……… … ……… ……… …… 2 0 第 四 節 考 察. …… ……… … …… ……… …… 2 5 第 二 章 エ ン テ カ ビ ル 耐 性 HB V 由 来 ポ リ メ ラ ー ゼ 変 異 体 の
カ イ ネ テ ィ ク ス 解 析
第 一 節 序 論.… ……… ……… ……… 2 8 第 二 節 方 法.… … ……… ……… …… 3 0 第 三 節 結 果.… … ……… ………… …… … …… …… 3 3 第 四 節 考 察.… … ……… ……… …… 3 6
結 語……… ...40
引 用 文 献.… … …… ……… ……… …… . …… .4 1 図 と 説 明.. . …… …… ……… ……… ………… 5 2
謝 辞. ………… …… ……… ……… ……… ….. 83
略 語 一 覧
ADV : adefovi r
AP : al kal i ne phos ph at ase AhR : aryl h y d ro ca rbon r ec ept or B S A : bovi ne s erum al bum i n;
ccc DNA : coval ent l y cl osed ci r cul ar D NA dsDNA : doubl e s t rand ed DN A
dATP : deoxyad enos i ne t ri p hos phat e dC TP : deoxycyt i di ne t ri pho s phat e ddC TP : di deoxycyt i di ne t ri p hos phat e ddGTP : di deoxyguanos i n e t ri p hos p h at e ddNTP : di deoxynucl eot i d e t r i phosphat e dGTP : deoxyguanos i n e t ri p hosphat e dNTP : deoxynucl eot i de t ri p hos phat e DMS O : di m et hyl s ul foxi de
DTT : di t hi ot hrei t ol
EDTA : et hyl enedi am i net et r a acet i c aci d ETV : ent ec avi r
ETV-TP : ent ec avi r t ri phosph a t e FAM : 6-ca rboxyfl uo resc ei n HB s : HB V s urf ac e prot ei n F ITC : fl uores cei n i s ot hi oc yanat e HB V : hepat i t i s B vi rus
HC V : hepat i t i s C vi rus HDV : hepat i t i s D vi rus
H IV : hum an i m m unodefi ci ency vi rus HR P : hors er adi sh pe roxi da se
IC 50 : hal f-m axi m al i nhi bi t ory con ce nt r at i o n IFN : i nt erfe ron
LHB s : l arge HB V s ur fa ce p rot ei n LMV : l am i vudi ne
LMV-TP : l am i vudi ne t ri phos p hat e
M MLV : m ol oney m uri ne l eu kem i a vi rus
M TT : 3-(4,5 -di m et hyl t hi a z ol -2 -yl )-2 , 5 -di pheny l -t et ra zol i um b rom i de
NNRT I : n o n-nucl eos (t )i de an al og rev ers e t rans cri pt as e i nhi bi t or NRT I : nucl eos (t )i d e an al og reve rs e t r ans c ri pt as e i nhi bi t or NTC P : s odi um t aurochol at e co -t ra ns port i ng pol y pept i de P VDF : pol yvi nyl i dene di fl u ori de
pgR NA : pregenom i c R NA rcDN A : rel ax ed ci r cul ar DN A R Nase H : ri bonucl e as e H
RT : rev e rs e t r ans c ri pt as e
S P R : s urfa ce pl as m on res onanc e TAF : t enofovi r al af enam i d e TFV : t enofovi r
TAMR A : carboxyt et ram et hyl r hodam i ne TP : t erm i nal prot ei n
TTP : t hym i di ne t ri phosphat e
要 旨
B 型 肝 炎 ウ イ ル ス (HB V) は 、 ヘ パ ド ナ ウ イ ル ス に 属 す る 不 完 全 ２ 本 鎖 DNA ウ イ ル ス で あ り 、HB V の 慢 性 感 染 者 は 世 界 に 約 2 . 6 億 人 存 在 す る と 推 計 さ れ 、 こ れ ら 慢 性 感 染 者 か ら の 肝 硬 変 、 肝 細 胞 が ん 発 症 は 公 衆 衛 生 上 の 大 き な 問 題 と な っ て い る 。 そ の た め 新 た な 抗 ウ イ ル ス 薬 の 開 発 が 強 く 望 ま れ て い る が 、 こ れ ま で H B V の 感 染 分 子 機 構 お よ び 複 製 に 重 要 な ウ イ ル ス タ ン パ ク 質 の 生 化 学 的 特 徴 も 未 だ ほ と ん ど 明 ら か に さ れ て い な い 。 現 在 HB V の 治 療 薬 は 、HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の 逆 転 写 酵 素 (RT ) 活 性 を 阻 害 す る 核 酸 ア ナ ロ グ と イ ン タ ー フ ェ ロ ン が 用 い ら れ て い る 。 抗 HB V 薬 と し て の 核 酸 ア ナ ロ グ に は 、 ラ ミ ブ ジ ン 、 ア デ フ ォ ビ ル 、 エ ン テ カ ビ ル 、 お よ び テ ノ フ ォ ビ ル が あ る が 、 長 期 投 与 に よ る 耐 性 変 異 株 出 現 の 問 題 が あ る 。 イ ン タ ー フ ェ ロ ン は 免 疫 を 賦 活 化 す る こ と に よ っ て ウ イ ル ス を 抑 制 す る が 、 強 い 副 作 用 が 知 ら れ る 。 ま た い ず れ の 治 療 薬 も 感 染 細 胞 か ら HB V を 完 全 に 排 除 す る こ と は 難 し く 、 新 た な 治 療 法 が 求 め ら れ る 。
HB V ポ リ メ ラ ー ゼ は 、HB V ゲ ノ ム の 複 製 を 担 う ウ イ ル ス 性 タ ン パ ク 質 で あ り 、HB V 阻 害 剤 開 発 の 主 な 標 的 で あ る が 、そ の リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク 質 の 発 現 と 精 製 が 困 難 で あ る た め 、i n vi t ro で の 新 た な 阻 害 薬 の ス ク リ ー ニ ン グ が 困 難 で あ っ た 。HB V ポ リ メ ラ ー ゼ は t erm i nal p rot ei n (TP )、ス ペ ー サ ー 、逆 転 写 酵 素 (RT) お よ び R Nas e H の 4 つ の ド メ イ ン で 構 成 さ れ て お り 、3 つ の 活 性 ① 鋳 型 R NA -ポ リ メ ラ ー ゼ 複 合 体 を 形 成 し 、DNA 伸 長 を 開 始 す る プ ラ イ ミ ン グ 活 性 、
②R NA あ る い は D NA を 鋳 型 と し た D NA 伸 長 活 性 、 ③ 鋳 型 R NA を 分 解 す る R Nas e H 活 性 、 を 有 し て い る 。 こ れ ら の う ち ① に 関 し て は こ れ を 担 う リ コ ン ビ ナ ン ト TP ド メ イ ン タ ン パ ク 質 の 、 ③ に 関 し て は R Nase H ド メ イ ン タ ン パ ク 質 の 発 現・精 製 と こ れ を 用 い た i n vi t ro で の 活 性 測 定 系 の 確 立 が 報 告 さ れ た 。一 方 で 、②DNA 伸 長 活 性 を 持
つ リ コ ン ビ ナ ン ト RT タ ン パ ク 質 は こ れ ま で 報 告 さ れ て お ら ず 、 ま た そ の た め こ れ を 用 い た 非 核 酸 系 D NA 伸 長 阻 害 化 合 物 も 同 定 さ れ て い な い 。
こ の 問 題 に 対 し て 最 近 、 共 同 研 究 先 の 福 祉 村 病 院 長 寿 医 学 研 究 所 豊 田 哲 也 博 士 ら は 、 鋳 型 R NA お よ び DNA か ら DNA 伸 長 活 性 を 発 揮 す る リ コ ン ビ ナ ン ト HB V ポ リ メ ラ ー ゼ 断 片 の 発 現 精 製 に 成 功 し た 。 そ こ で 本 研 究 で は 共 同 研 究 先 と と も に 、 伸 長 活 性 を 有 す る リ コ ン ビ ナ ン ト HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の 大 量 発 現 と 精 製 を 行 い 、 伸 長 活 性 を 阻 害 す る 化 合 物 の 探 索 と HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の 生 化 学 的 解 析 を 試 み た 。
第 一 章 で は 、 リ コ ン ビ ナ ン ト HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の 大 量 発 現 と 精 製 を 行 い 、 伸 長 活 性 を 阻 害 す る 化 合 物 の 探 索 を 目 的 と し て 、 新 た な i n vi t ro ス ク リ ー ニ ン グ 系 を 構 築 し た 。 そ の 結 果 、DNA 伸 長 活 性 を 阻 害 す る 5 化 合 物 を 得 た 。さ ら に HB V 複 製 培 養 細 胞 株 を 用 い た HBV 複 製 阻 害 を そ の 5 化 合 物 に お い て 検 証 し た と こ ろ 、 顕 著 な 細 胞 毒 性 な く 濃 度 依 存 的 に 複 製 阻 害 す る 化 合 物 と し て pi ceat ann ol を 得 た 。そ こ で こ の pi ce at ann ol に 着 目 し 、 そ の 構 造 類 似 体 6 化 合 物 を HB V 複 製 培 養 細 胞 株 で 培 養 し た と こ ろ 、pi c eat annol よ り 約 7 倍 阻 害 活 性 が 高 く 、調 べ た 全 て の 濃 度 で 細 胞 毒 性 が 認 め ら れ な い P DM 2 を 同 定 し た 。P DM 2 は HB V 感 染 培 養 系 に お け る HB V 複 製 へ の 阻 害 活 性 も 見 ら れ た 。ま た 表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 法 に よ り 、RT タ ン パ ク 質 と の 特 異 的 な 相 互 作 用 も 認 め ら れ た 。 さ ら に 興 味 深 い こ と に 、 エ ン テ カ ビ ル 耐 性 HB V の 複 製 も 野 生 型 HB V と 同 様 に 阻 害 し 、 ま た 現 在 使 用 さ れ て い る 核 酸 ア ナ ロ グ と の 併 用 に よ り 抗 HB V 効 果 を 上 昇 さ せ る こ と を 明 ら か に し た 。 以 上 か ら 、 リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク 質 を 用 い た DNA 伸 長 反 応 を 利 用 し た 化 合 物 ス ク リ ー ニ ン グ に よ り 、今 回 新 た に HB V 複 製 を 阻 害 す る 非 核 酸 系 逆 転 写 酵 素 阻 害 化 合 物 P D M2 を 得 た 。 こ れ は 既 存 の 核 酸 ア ナ ロ グ と 作 用 機 序 が 異 な る ア ロ ス テ リ ッ ク 阻 害
薬 と 考 え ら れ 、HB V 根 治 を 目 指 す 多 剤 併 用 療 法 開 発 の 重 要 な リ ー ド 化 合 物 に な る と 期 待 さ れ る 。
第 二 章 で は 、 こ の DNA 伸 長 活 性 を 持 つ リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク 質 を 利 用 し て 、エ ン テ カ ビ ル (ETV ) お よ び ラ ミ ブ ジ ン (L M V ) 耐 性 株 由 来 RTタ ン パ ク 質 の DNA 伸 長 反 応 の 生 化 学 的 な 特 徴 づ け を 行 な っ た 。 本 章 で は 、 野 生 型 の 他 に ETV 耐 性 を 持 つ と 報 告 さ れ て い る 5 種 類 の 変 異 体 HB V 配 列 か ら リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク 質 を 精 製 し た 。 ETV は デ オ キ シ GT P (dGTP ) の 核 酸 ア ナ ロ グ で あ る が 、 野 生 型 タ ン パ ク 質 に お い て dG TP を 基 質 に 用 い る と 5塩 基 伸 長 ま で DNA 伸 長 反 応 が 見 ら れ る の に 対 し 、ETV 三 リ ン 酸 (ETV-TP ) 存 在 下 で は 1 塩 基 の み の 取 り 込 み で 伸 長 が 停 止 し 、ET V-TP が chai n t erm i nat or で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。 次 に 、 野 生 型 と 5 種 変 異 体 リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク 質 を 用 い た 酵 素 活 性 お よ び ETV- TPの DNA伸 長 阻 害 効 果 を 検 証 し た 。酵 素 活 性 は 、野 生 型 に 比 較 し て M 2 0 4 V と V173L/ L1 80M / M 204V の 2 種 の 変 異 体 で 大 き な 低 下 が 認 め ら れ た 。 一 方 、ET V 耐 性 は 、 野 生 型 よ り L180M / M 204V と L180M / M204V/ M 250V の 2 種 の 変 異 体 で 上 昇 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。さ ら に 4 種 の 基 質 (dATP、TTP、 dGTP、 dC TP ) に 対 す る DNA 伸 長 反 応 よ り 、 ラ イ ン ウ ェ ー バ ー ＝ バ ー グ の プ ロ ッ ト か ら Km 値 お よ び Vm ax を 算 出 し た 。 そ の 結 果 、 野 生 型 タ ン パ ク 質 の 4 種 の 基 質 で の 比 較 で は 、dGTP と dC TP に 対 す る 親 和 性 が 高 か っ た 。 ま た 野 生 型 と 変 異 体 を 比 較 す る と 、 変 異 体 に お い て 概 ね 親 和 性 が 高 ま っ て い た が 、M 204V で は 親 和 性 が 低 く な っ て い た 。以 上 の よ う に 本 研 究 で は 、野 生 株 と ETV 耐 性 株 由 来 ポ リ メ ラ ー ゼ タ ン パ ク 質 の DN A 伸 長 反 応 の カ イ ネ テ ィ ク ス お よ び ETV 耐 性 プ ロ フ ァ イ ル を 明 ら か に し た 。 こ の よ う に 本 発 現 系 を 用 い る こ と で 、ETV 耐 性 以 外 に も 報 告 さ れ る 任 意 の HB V 株 に お け る DNA 伸 長 活 性 の 評 価 が 可 能 と な り 、 新 た な 核 酸 ア ナ ロ グ 製 剤 開 発 に 寄 与 す る 基 礎 的 酵 素 学 的 知 見 を 提 供 で き る も の と 考 え ら れ る 。
第 一 章 B 型 肝 炎 ウ イ ル ス (HBV) ポ リ メ ラ ー ゼ DNA 伸 長 活 性 を 阻 害 す る 非 核 酸 系 化 合 物 の 同 定
第 一 節 序 論
B 型 肝 炎 ウ イ ル ス (HB V) は 、 ヘ パ ド ナ ウ イ ル ス に 属 す る 不 完 全 ２ 本 鎖 DNA ウ イ ル ス (Fi g. 1) で あ り 、HB V の 慢 性 感 染 者 は 世 界 に 約 2 . 6 億 人 存 在 す る と 推 計 さ れ (1 )、 こ れ ら 慢 性 感 染 者 か ら の 肝 硬 変 、 肝 細 胞 が ん 発 症 は 公 衆 衛 生 上 の 大 き な 問 題 と な っ て い る (2 )。 現 在 、現 在 HB V の 治 療 薬 は 、HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の 逆 転 写 酵 素 (RT) 活 性 を 阻 害 す る 核 酸 ア ナ ロ グ (NRTI) (Fi g.13A) と イ ン タ ー フ ェ ロ ン ( IFN) が 用 い ら れ て い る (3,4) (Fi g .2)。NRT I に は 、 ラ ミ ブ ジ ン 、 ア デ フ ォ ビ ル 、 エ ン テ カ ビ ル 、 お よ び テ ノ フ ォ ビ ル が 含 ま れ 、 ウ イ ル ス 逆 転 写 酵 素 (RT) を 阻 害 す る こ と で 、HB V 複 製 を 抑 制 す る 。 IFN -α お よ び そ の ペ グ 化 型 IFN は 、HB V 感 染 に お け る 宿 主 免 疫 応 答 を 賦 活 化 す る と と も に 肝 細 胞 に お け る ウ イ ル ス 複 製 も 直 接 阻 害 す る 。 こ れ ら の 薬 剤 は 患 者 の ウ イ ル ス 量 を 効 率 的 に 減 少 さ せ 、 肝 炎 の 鎮 静 化 を も た ら す 一 方 で 、HB V 抗 原 量 の 低 下 作 用 は 限 定 的 で あ り 、感 染 細 胞 か ら 完 全 に ウ イ ル ス を 排 除 す る こ と は 困 難 で あ る (5)。 さ ら に NRT I の 長 期 投 与 は し ば し ば 薬 剤 耐 性 変 異 の 出 現 が 見 ら れ 、 一 方 で IFN は 認 容 性 が 低 い 重 篤 な 副 作 用 を 引 き 起 こ す 可 能 性 が あ る 。 こ の よ う に 現 在 の 治 療 に は い ま だ 克 服 す べ き 点 が あ り 、 そ の た め 新 し い 抗 HB V 薬 の 開 発 が 求 め ら れ て い る 。
HB V ポ リ メ ラ ー ゼ は t erm i nal prot ei n ( TP )、ス ペ ー サ ー 、逆 転 写 酵 素 (RT) お よ び R N as e H の 4 つ の ド メ イ ン で 構 成 さ れ て い る (6,7) (Fi g. 3)。HB V R NA か ら の HB V ゲ ノ ム 複 製 は 、HB V pre ge nom i c R N A (pgR NA) の 5 ’末 端 上 に 存 在 す る epsilon (ε) RNA と 呼 ば れ る ス テ ム ル ー プ 構 造 に TP ド メ イ ン が 結 合 し 、H B V ポ リ メ ラ ー ゼ と pgR NA の
複 合 体 が ウ イ ル ス の キ ャ プ シ ド 内 に 取 り 込 ま れ 、 ヌ ク レ オ キ ャ プ シ ド を 構 成 す る 。ヌ ク レ オ キ ャ プ シ ド 内 で 、TP ド メ イ ン が タ ン パ ク 質 プ ラ イ マ ー と し て 機 能 し 、RT ド メ イ ン が pgR N A を 鋳 型 と し て マ イ ナ ス 鎖 DNA の 合 成 を 開 始 し （ こ の 合 成 開 始 過 程 を “ プ ラ イ ミ ン グ ” と 呼 ぶ ）、 逆 転 写 活 性 に よ る DNA“ 伸 長 ” が 行 わ れ る 。R Nas e H 活 性 は 鋳 型 p gR NA を 分 解 し (“R NA 分 解 ”)、RT ド メ イ ン は マ イ ナ ス 鎖 を 鋳 型 と し て さ ら に プ ラ ス 鎖 DNAを 合 成 す る (“D NA合 成 ”) (Fi g.
3 )。 こ れ ま で に 遺 伝 学 的 、 生 化 学 的 研 究 に よ り 、 上 記 の 過 程 に 重 要 な HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の モ チ ー フ や ア ミ ノ 酸 残 基 が 明 ら か に さ れ て い る (6 -10 )。 し か し な が ら 、 十 分 な 量 と 高 い 純 度 で 特 に RT 活 性 を 保 持 し て い る 組 換 え 型 タ ン パ ク 質 を 作 製 す る こ と は こ れ ま で 技 術 的 に 困 難 で あ り 、HB V ポ リ メ ラ ー ゼ タ ン パ ク 質 の 立 体 構 造 の 決 定 や 酵 素 学 的 な 解 析 は 長 ら く 妨 げ ら れ て き た 。一 方 で 、TP ド メ イ ン を 介 す る プ ラ イ ミ ン グ 過 程 は 、 昆 虫 細 胞 お よ び ヒ ト 細 胞 で 産 生 さ れ た 組 換 え 型 HB Vポ リ メ ラ ー ゼ を 使 用 し た i n vi t ro ア ッ セ イ に よ っ て 解 析 さ れ て き た (11,12 )。 ま た 近 年 、 活 性 を 保 持 す る 組 換 え 型 R Nas e H ド メ イ ン の 精 製 が 成 功 し 、R Nas e H 活 性 を 阻 害 す る 化 合 物 が i n vi t ro 薬 物 ス ク リ ー ニ ン グ シ ス テ ム に よ り 報 告 さ れ て き た (1 3 -1 5)。一 方 、 RT ド メ イ ン の 精 製 自 体 に 関 し て は 既 に 報 告 が な さ れ て い る が (16 )、 現 在 ま で 伸 長 活 性 を 保 持 す る RT ド メ イ ン タ ン パ ク 質 の 精 製 は 確 証 高 い 報 告 が な く 、 大 き な 問 題 点 で あ っ た (17) (Fi g. 3 )。
最 近 、共 同 研 究 先 の 福 祉 村 病 院 長 寿 医 学 研 究 所 豊 田 哲 也 博 士 ら は 、 R NA あ る い は DNA を 鋳 型 に 、DNA 伸 長 活 性 を 発 揮 す る リ コ ン ビ ナ ン ト HB V ポ リ メ ラ ー ゼ 断 片 の 発 現 精 製 に 成 功 し た 。 そ こ で 本 研 究 で は 共 同 研 究 先 と と も に 、 伸 長 活 性 を 有 す る リ コ ン ビ ナ ン ト HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の 大 量 発 現 と 精 製 を 行 い 、 伸 長 活 性 を 阻 害 す る 化 合 物 の ス ク リ ー ニ ン グ 系 の 構 築 と DN A 伸 長 阻 害 化 合 物 の 探 索 、 得 ら れ た 化 合 物 の 特 徴 付 け を お こ な っ た 。
第 二 節 方 法
試 薬
化 合 物 ラ イ ブ ラ リ ー は Tocri s B i osci ence よ り 購 入 し た 。P DM 2、
P DM 11、C AY10465、 お よ び bref el di n A は C aym an C hem i cal よ り 購 入 し た 。 P i c eat ann ol、 pt eros t i l ben e 、 4 , 4 ´ -di chl oro -t r an s-s t i l bene、 ent ec avi r m onohydr a t e、l am i vudi ne、 お よ び adefovi r di pi vo xi l は 東 京 化 成 工 業 よ り 購 入 し た 。Ten ofovi r al afen am i de は M edC hem Expres s よ り 購 入 し た 。Di m et hyl s ul foxi de ( D MS O) は S i gm a -Al dri c h よ り 購 入 し た 。M ol oney m uri ne l eukem i a vi rus (M M LV) RT タ カ ラ バ イ オ お よ び Therm o Fi s h er S ci ent i fi c (そ れ ぞ れ PrimeScript™ Reverse
Trans cri pt as e と M ul t i S cri be™ R eve rse Tr ans c ri pt as e ) よ り 購 入 し た 。 The am phi pat hi c pol ym er r eag ent (NV-1 0) Exped eon よ り 購 入 し た 。 B ovi ne s erum al bum i n (B S A) は タ カ ラ バ イ オ よ り 購 入 し た 。
Myrcl udex -B は S crum , In c.に て 合 成 し た 。
プ ラ ス ミ ド
N 末 端 に Hi s タ グ を コ ー ド し た 組 換 え 型 HB V ポ リ メ ラ ー ゼ 断 片 DNA (遺 伝 子 型 C - HB V ポ リ メ ラ ー ゼ; GenB ank: AF411411 (18)、 の ア ミ ノ 酸 残 基 30 4 か ら 84 3 番 目 に 対 応) を P C R で 増 幅 し 、pET28b (Mer ck D arm s t adt、G erm any ) の N d eI—E c oR I サ イ ト 間 に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し て p E T28RT304 -R Nase H を 作 製 し た 。 ま た 同 様 に 、 遺 伝 子 型 B (GenB ank: AB 246 341; 田 中 先 生 よ り 譲 り 受 け た) (19) の RTド メ イ ン を コ ー ド す る D NA 断 片 ( HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の ア ミ ノ 酸 残 基 34 7 か ら 69 0 番 目)を P C R で 増 幅 し pET28 b の N deI—Hi ndⅢサ イ ト 間 に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し て pET28RT を 作 製 し た 。ポ リ メ ラ ー ゼ の 触 媒 部 位 YMDD を YM HD に 変 異 さ せ た RT 変 異 体 は (11 )、Qui kC hange II S i t e Di rect ed Mut a genesi s Ki t (S t rat agen e, L a Jol l a, C A) を 用 い て メ ー カ ー
推 奨 プ ロ ト コ ー ル に 従 っ て 作 製 し た 。 作 製 し た プ ラ ス ミ ド の DNA 配 列 は 、DNA シ ー ケ ン ス で 確 認 し た (FAS M AC )。
H B V RT の 発 現 と 精 製
pET28RT304 -R Na s e H は タ ン パ ク 質 発 現 用 の 大 腸 菌 R os et t a (DE 3) pLys S ( Novag en) に 形 質 転 換 し 、 形 質 転 換 し た 大 腸 菌 は 3 7 °C で 、 吸 光 度 600 nm (OD600) =0 . 7 - 0 . 8 に な る ま で 振 と う 培 養 し た 。 組 換 え 型 タ ン パ ク 質 は 1 m M IP TG 添 加 し 、25 °C 3 時 間 振 と う 培 養 す る こ と で 誘 導 し た 。培 養 後 に 大 腸 菌 を 遠 心 回 収 し 、溶 解 バ ッ フ ァ ー [50 m M phos phat e (p H 8.0 ) 、 0.5 M NaC l 、 0.1% Tri t on X - 1 0 0 、 0.1%
2 -m er capt oet h anol、 2 m M i m i dazol e、 お よ び cOmplete™ Protease Inhi bi t or co ckt ai l ( R oche)] に 再 懸 濁 し 、氷 上 で 超 音 波 破 砕 し た 。超 遠 心 後 、 可 溶 性 画 分 に 得 ら れ た RT304 -R Nas e H は 、Ni - NTA a garos e (Qi agen ) に 供 し 続 け て Hi Trap Q ( GE Heal t hc ar e) に 供 す こ と で 精 製 し 、 20 m M Tr i s -HC l (pH 8.0) 、 0.5 M NaC l 、 1 m M et hyl enedi am i net et r a acet i c aci d (E DTA)、1 m M di t hi ot hrei t ol (DTT)、 お よ び 0.02% Tri t o n X -1 0 0 の バ ッ フ ァ ー で 回 収 し た 。 さ ら に ゲ ル ろ 過 カ ラ ム S uperdex 200 I n cr eas e (G E Heal t hc ar e) で 分 画 し 、20 m M Tri s -HC l (pH 8.0)、0 .5 M N aC l、1 m M E DTA、1 m M DTT、お よ び 0.05%
Tri t on X -1 0 0 の バ ッ フ ァ ー で 回 収 し た 。 約 1 58 kDa の S u perdex か ら 溶 出 し た 画 分 を 回 収 し 、1 0 % gry ce ro l を 添 加 し −8 0 °C に 保 存 し た 。
HB V RT ド メ イ ン タ ン パ ク 質 は 変 性 条 件 下 で 精 製 し 、NV10 存 在 下 で リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ し た 具 体 的 に は 、p ET28RT を 大 腸 菌 R os et t a (DE3) p Lys S ( Nova gen) に 形 質 転 換 し 、 形 質 転 換 し た 大 腸 菌 は 3 7 °C で 、 吸 光 度 600 nm (OD600) =0. 6 - 0 .7 に な る ま で 振 と う 培 養 し た 。 RT タ ン パ ク 質 は 1 m M IP TG 添 加 し 、37°C 2 時 間 振 と う 培 養 す る こ と で 誘 導 し た 。 培 養 後 に 大 腸 菌 を 遠 心 回 収 し 、 変 性 バ ッ フ ァ ー [50 m M Na-P hosph at e ( pH 8.0)、0.3 M Na C l、6 M guani di n e - HC l、0.1%
2 -m er capt oet h anol、お よ び 10 m M i m i da zol e] で タ ン パ ク 質 を 抽 出 し 、 Ni -NTA agar os e で 精 製 し た 。次 に RT タ ン パ ク 質 10 m g に 1 m g NV10 を 添 加 し 、5 0 倍 容 量 の バ ッ フ ァ ー [ 20 m M Tri s -HC l (pH 8.0)、0.5 M NaC l、5 m M DT T、 お よ び 1 m M EDTA ] で 3 回 透 析 し 、RT タ ン パ ク 質 を リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ し た 。 リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ し た タ ン パ ク 質 は 、ゲ ル ろ 過 カ ラ ム S uperdex 200 In c rease で 20 m M Tri s -HC l (pH 8.0 )、 0.5 M NaC l、1 m M EDTA、 お よ び 1 m M DTT の バ ッ フ ァ ー で 精 製 し た 。
DNA 伸 長 ア ッ セ イ
DNA 伸 長 ア ッ セ イ は 、0.02 µ M FA M -ol i go (dT15) プ ラ イ マ ー 、 0.02 µ M 5 ’ -bi o t i n -ol i go dA50 鋳 型 DN A、RT3 04 -R Nas e H ( 0 .2 µ M ) ま た は YM HD 変 異 体 (0.2 µ M)、50 m M Tri s -HC l (p H 8.5 )、4 m M M gC l2、 1 m M DTT、0. 4% R Nas e i nhi bi t or ( Invi t rogen)、1 m M dTTP ( Invi t rogen )、 0.02% Tri t on X -1 0 0 を 混 ぜ 、25 °C 3 0 分 間 、3 7 °C 9 0 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。反 応 物 は エ タ ノ ー ル 沈 殿 に よ っ て 精 製 し 、1 0% ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド/ 6M 尿 素 ゲ ル に て 泳 動 分 離 し 、Typhoon R GB s can ner (G E Heal t hc ar e) で 検 出 し 、Im age Qu ant T L v8. 2 (GE H eal t hc are ) で 解 析 し た 。
次 に M g濃 度 を 最 適 化 す る た め に 、0. 2 µ M RT 3 0 4 -R N as e Hを 50 m M Tri s -HC l (p H 7.0)、0.02 µ M FAM -ol i go (dT) プ ラ イ マ ー 、2 m g/ m L pol yA (S i gm a、M I、US A)、1 m M DTT、0 .4% R Nas e i nhi bi t or ( Invi t rogen )、 1 m M dTTP ( Invi t ro gen)、0.02% Tri t on X -1 0 0、お よ び 0、1、2、3、4、
5、6、7、8、 ま た は 9 m M MgC l2を 25 °C 3 0 分 間 、37 °C 9 0 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。
さ ら に p H を 最 適 化 す る た め に 0.2 µ M RT-R Nas e H、5 m M M gC l2、 0.02 µ M fl uo resc ei n i sot hi ocya nat e ( F IT C ) -dT15、2 m g/ m L p ol yA、1 m M DTT、0.4% R Nase i nhi bi t or、1 m M dTT P、0.02% Tri t on X - 100、 お よ
び 50 m M バ ッ フ ァ ーpH 5.0 (M OP S NaOH )、6.0 (M OP S -NaO H)、6.5 (MOP S -NaO H)、 7. 0 (Tri s -HC l )、7.5 ( Tri s -HC l )、8.0 ( Tri s -HC l )、8. 5 (Tri s -HC l )、9.0 ( Tri s -HC l )、9.5 ( Tri s -H C l )、10.0 (C AP S -Na OH)、10.5 (C AP S -NaOH )、 ま た は 11.0 (C AP S -Na OH) を 25 °C 3 0 分 間 、3 7°C 9 0 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。
I n vi t r o 伸 長 ス ク リ ー ニ ン グ
1 次 ス ク リ ー ニ ン グ に お い て 、 bi ot i n 化 鋳 型 DNA (5 ´ -bi ot i n -3ATGTC AAC AATAT GTGGG C C C TC TTAC AGTTAATGAA AA AAAAA AAAA AA -3 ´ )、 お よ び 6-c arbo xyfl uores cei n ( FAM ) ラ ベ ル オ リ ゴ (dT ) プ ラ イ マ ー (5 ´ -FAM -TTT TTTTTT TT TT TT-3 ´ ) を 混 ぜ 、 9 5 °C 5 分 間 加 熱 、2 5 °C 1 0 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し 、96 ウ ェ ル s t rept avi di n コ ー テ ィ ン グ プ レ ー ト (The rm o Fi s che r S ci ent i fi c,
# 43 6 01 4) に 固 相 化 し た 。 こ の 鋳 型 D NA／ プ ラ イ マ ー 二 重 鎖 を 添 加 し た プ レ ー ト に 、0 . 2 µ M RT304 -R N ase H と 0.5 m M dNTP、1% DM S O、 1 00 µ M 被 験 化 合 物 、50 m M Tri s - HC l ( pH 8.5)、4 m M M gC l2、0.5 m M FeC l3、1 m M DTT、お よ び 0 .02% Tri t on X -10 0 を 加 え 、2 5 °C 30 分 間 、 3 7 °C 9 0 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。3 0°C の TE バ ッ フ ァ ー [10 m M Tri s -HC l (pH 8.0)、1 m M EDTA ] で 3 回 洗 浄 し 、伸 長 し て い な い FAM プ ラ イ マ ー を 除 き 、Typhoon scann er R GB (GE Heal t hca r e) で プ レ ー ト 上 に 保 持 さ れ た 蛍 光 シ グ ナ ル を モ ニ タ リ ン グ す る こ と で ヌ ク レ オ チ ド の 伸 長 を 評 価 し た 。
2 次 ス ク リ ー ニ ン グ で は 、 0. 0 4 μM 鋳 型 DN A (5 ´ - ATGTC AAC AATAT GT GGGC C C TC TTA C AGTTAATG AAA A AAAAA AA AAAA- 3 ´ )、 0.04 μM FAM ラ ベ ル し た ol i go (dT) プ ラ イ マ ー (5 ´ -FAM -TTT TTTT TTTTTTTT-3 ´ )、0.4 μ M RT304 -R Nas e H、0.5 m M dNTP、1% DM S O、5 0 m M Tri s HC l (pH 8 .5)、4 m M MgC l2、0.5 m M FeC l3、 1 m M DTT、0.02 % Tri t on X -100、お よ び 0.01、0.1、1、ま た は 10 µ M
被 験 化 合 物 を 混 ぜ 、2 5 °C 3 0 分 間 、37 °C 90分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 RT304 -R Nas e H の 伸 長 活 性 は 、10% ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド/ 6M 尿 素 ゲ ル を 用 い て pol yacr yl am i de gel -el ect rop hores i s (PAGE) で 分 離 し 、 ラ ダ ー バ ン ド を 検 出 す る こ と に よ り 評 価 し た 。検 出 し た 5 0 ヌ ク レ オ チ ド 長 の バ ン ド の 蛍 光 強 度 を 定 量 化 し 、 コ ン ト ロ ー ル よ り 5 0 %以 下 に 蛍 光 強 度 を 低 下 さ え た 化 合 物 を 2 次 ス ク リ ー ニ ン グ の ヒ ッ ト と し た 。
3 次 ス ク リ ー ニ ン グ は 、 0.02 μM 鋳 型 R N A (5 ´ -UGUC AAC A AU AUGUC C C UUAC A GUGAA AAAA AAA AAAAA A - 3 ´ ) 、 0.02 μM FAM ラ ベ ル し た ol i go (dT) プ ラ イ マ ー (5 ´ -FAM -TTT TTTT TTTTTTTT-3 ´ )、0.4 μM RT304-RNase H、0.5 m M dNTP、1% DM S O、5 0 m M Tri s -HC l (pH 8.5)、5 m M M nC l2、1 m M DTT、 0.02% Tri t on X -1 0 0、 お よ び 0.4 % R Nase i nhi bi t or (Takar a) お よ び 1 0 µ M 被 験 化 合 物 を 混 ぜ 、2 5°C 30 分 間 、3 7 °C 9 0 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 検 出 し た 3 0 ヌ ク レ オ チ ド 長 の バ ン ド の 蛍 光 強 度 を 定 量 化 し 、 コ ン ト ロ ー ル よ り 50 %以 下 に 蛍 光 強 度 を 低 下 さ え た 化 合 物 を 3 次 ス ク リ ー ニ ン グ の ヒ ッ ト と し た 。
細 胞 培 養
HepG2、H ep38.7 -Te t、HepG2.2.15.7、HepG2 - hNTC P -C 4 細 胞 お よ び 初 代 ヒ ト 肝 細 胞 (フ ェ ニ ッ ク ス バ イ オ, 広 島) は 1 0 m M HEP ES (pH7.4)、10 0 uni t s / m l peni ci l l i n、100 μ g/ m l s t rept om yci n、1 0% FB S、 5 μ g / m l i ns ul i n を 添 加 し た DM EM / F- 12+Gl ut aM ax 培 地 で 37°C、5%
C O2 の 条 件 で 培 養 し た (20 -23 ) 。 Hep38.7 - Tet 、 H ep G2.2.15.7、
HepG2 - hNTC P -C 4 細 胞 は 上 記 培 地 に 500 μg/ml G418
(HepG2 -hNTC P -C 4)、4 0 0 μ g/ m l G418 ( HepG2.2.15. 7、Hep 38.7 -Tet 細 胞) を 加 え て 培 養 し た 。Hep38.7 -Tet 細 胞 に お い て は HB V を 産 生 さ せ な い 場 合 は さ ら に 400 ng/ m l t et racy cl i ne を 加 え て 培 養 し た 。
H B V 複 製 ア ッ セ イ
3 日 間 の 培 養 後 、H ep38.7 -Tet 細 胞 あ る い は Hep G2.2.15. 7 細 胞 を 被 験 化 合 物 を 含 む 培 地 で 6 日 間 培 養 し た 。 こ の 際 、H ep 38.7 -Tet 細 胞 は テ ト ラ サ イ ク リ ン 除 去 培 地 で 実 験 を お こ な っ た 。 培 養 上 清 と 等 量 の S i deS t ep Lys i s & S t abi l i zat i on B uff er (Agi l ent ) を 混 合 し 、含 有 す る HB V DN A を リ ア ル タ イ ム P C R で 定 量 す る こ と に よ り HB V 複 製 活 性 を 評 価 し た (2 1,23)。
ま た 一 過 性 ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン は 、HepG2 細 胞 に 1 . 24 倍 超 の HB V DNA が コ ー ド さ れ た プ ラ ス ミ ド( HB V/ C -AT (19) お よ び ポ リ メ ラ ー ゼ 領 域 に L180 M / S 202G/ M204V の 変 異 が 入 っ た エ ン テ カ ビ ル 耐 性 株) を Tr ans IT LT1 ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 試 薬 (M i rus ) を 用 い て 導 入 し 、3 日 間 化 合 物 処 理 し た 。HB V 複 製 は 、リ ア ル タ イ ム P CR に よ り ヌ ク レ オ キ ャ プ シ ド 内 HB V DN A を 定 量 化 す る こ と に よ り 評 価 し た (24)。
リ ア ル タ イ ム PCR
HB V D NA 遺 伝 子 型 C は 、5 ´ -AC TC AC C AAC C TC TTGTC C T-3 ´お よ
び 5´ -GAC AAAC GGGC AAC ATAC C T-3 ´ の プ ラ イ マ ー と
5 ´ FAM -TATC GTTG GATGTGTC T GC GG C GT-TAM R A -3´ (Hokkai do S ys t em S ci enc e) の プ ロ ー ブ を 用 い て 検 出 し た 。HB V DN A 遺 伝 子 型 D は 、 5 ´ -AAG GTAGG AGC TGG AG C ATTC G -3´ お よ び 5 ´ - AGGC GGAT TTGC T GGC AAAG -3´ の プ ラ イ マ ー と 5 ´ FAM - AGC C C TC AGGC TC AGGGC ATAC -TAM R A 3 ´ ( Hokkai d o S ys t em S ci ence ) の プ ロ ー ブ を 用 い て 検 出 し た 。リ ア ル タ イ ム P C R 用 混 合 液 (1×TaqM an R e al - Ti m e P C R Mat e r M i x、200 nM forw ard pr i m er、2 00 nM reve rs e pri m e r、1 00 nM probe) に DN A を 加 え て P C R 反 応 を 行 っ た 。 P C R 反 応 は 50°C 2 分 、9 4°C 10 分 の 後 、94°C 1 5 秒 、60 °C 1 分 を 50 サ イ ク ル に よ り 行 っ た 。
サ ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析
細 胞 を l ys i s buffer ( 1 0 0 m M Tri s - HC l [p H 8 . 0 ]、0 . 2 % NP 40、150 m M NaC l、com pl eat e p r ot eas e i nhi bi t or [R oc he]) に 溶 解 し た 。遠 心 に よ り 未 溶 解 画 分 を 除 き 、 ラ イ セ ー ト に 混 合 液 (6 m M M gOA C、20 0 μ g/ m l DNas e I、10 0 μ g/ m l R Nas e) を 加 え 37 ° C 2 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し 、キ ャ プ シ ド 外 の D NA、R NA を 消 化 し た 。 そ の 後 、 ラ イ セ ー ト に 混 合 液 (10 m M EDTA、1 00 m M N aC l、1 % S DS、2 00 μ g/ m l prot e i nas e K ) を 加 え 55 °C 1 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト す る こ と で キ ャ プ シ ド を 分 解 し た 。 フ ェ ノ ー ル ・ ク ロ ロ ホ ル ム に よ り タ ン パ ク 質 を 除 去 し 、 エ タ ノ ー ル 沈 殿 に よ り D NA 精 製 し 、 回 収 し た 。 精 製 し た DNA は 1 %ア ガ ロ ー ス ゲ ル を 用 い て 分 離 し 、 キ ャ ピ ラ リ ー ト ラ ン ス フ ァ ー 法 を 用 い て ト ラ ン ス フ ァ ー バ ッ フ ァ ー (0. 4 M N aO H) 中 で H ybond N +メ ン ブ レ ン (GE H eal t hc are ) に 転 写 し た 。 転 写 さ れ た DN A は U V を 用 い て ク ロ ス リ ン ク さ せ た 。H B V DNA 検 出 に 用 い る プ ロ ー ブ は HB V 発 現 プ ラ ス ミ ド (遺 伝 子 型 A、HB V/ Aeus ) を SacII と B s pH I に よ り 切 断 し た DNA 産 物 を Gel Ex t ract i on Ki t (Qi ag en) で 精 製 す る こ と で 作 製 し た 。 こ の プ ロ ー ブ に Al kP hos di rect l ab e l i n g re agent s (G E H eal t hcar e) を 用 い て ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ ラ ベ ル し 、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン バ ッ フ ァ ー (0.5 M N aC l、Hybri di z at i on B uffe r、B l ocki ng r e agent s [ GE Heal t hc ar e ]) と 共 に メ ン ブ レ ン に 加 え て ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 6 5 °C 4 時 間 行 っ た 。S ol ut i on I ( 120 m g / m l 尿 素 、0 .1% S DS、50 m M Na phos phat e [pH 7.0 ]、150 m M N aC l、1 m M M gC l2、2 m g / m l bl ocki ng regent [GE H ael t hc a re ] ) と S ol ut i on II ( 1 M Tri s [p H 10.0 ]、2 M NaC l ) で 各 2 回 洗 浄 後 、 ラ ベ ル さ れ た バ ン ド は Im ag eQu ant L AS 4000 (GE Heal t hc ar e) を 用 い て 検 出 し た 。
細 胞 生 存 率
細 胞 生 存 率 は XT T cel l prol i f er at i on ki t II (R oche )を 用 い て メ ー カ
ー 推 奨 の 使 用 方 法 に 従 い ミ ト コ ン ド リ ア の 酵 素 活 性 を 定 量 す る 方 法 、 お よ び LDH cyt ot o xi ci t y de t ect i on ki t (タ カ ラ バ イ オ) を 用 い て メ ー カ ー 推 奨 の 使 用 方 法 に 従 い 乳 酸 脱 水 素 酵 素 活 性 を 定 量 す る 方 法 に よ っ て 検 出 し た 。
H B V の 調 製 と 細 胞 へ の 感 染
HB V ウ イ ル ス は 、Hep38.7 - Tet 細 胞 由 来 (遺 伝 子 型 D) の も の を 使 用 し た 。 テ ト ラ サ イ ク リ ン を 除 き HB V を 産 生 さ せ て か ら 9-3 0 日 目 の 培 養 上 清 を 3 日 に 1 度 回 収 し た 。 回 収 し た 培 地 は 2 .3% NaC l、 1 0% P EG 8 0 0 0 と 混 合 し た 後 に P EG 沈 殿 を 行 っ た 。 沈 殿 し た HB V を D M E M / F - 1 2 + G l u t a M a x 培 地 で 再 懸 濁 す る こ と で 2 0 0 倍 に 濃 縮 し た 。
HB V 感 染 は 、濃 縮 し た HB V を 1 2,0 00 ( Fi g. 1 0 )、ま た は 5 00 ( Fi g. 11) GEq / cel l 量 で 4% P EG8000 と 培 地 中 に 混 合 し 、16 時 間 処 理 し て 行 っ た 。 未 感 染 の HB V と P EG8000 を 洗 浄 し 、 さ ら に 化 合 物 を 添 加 し た 培 地 で 1 2 日 間 培 養 し た 。 複 製 は 、 リ ア ル タ イ ム P C R に よ り 培 養 上 清 中 の HB V DNA の 蓄 積 を 定 量 化 す る こ と に よ り 評 価 し た 。
ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法
S DS -PAGE に よ っ て タ ン パ ク 質 を 分 離 し た 後 、 pol yvi nyl i dene di fl uori de (P VD F) 膜 に 転 写 し た 。転 写 後 の メ ン ブ レ ン を 5 % ス キ ム ミ ル ク/ 0.05% Twe e n20 -TB S で ブ ロ ッ キ ン グ し た 。次 に C anget S i gnal Im m uno rea ct i on En hance r S ol ut i on 1 で 希 釈 し た 1 次 抗 体 ant i -Hi s (Medi c al & B i ol o gi cal L abor at ori es ) 、 お よ び C an get S i gnal Im m uno rea ct i on En hance r S ol ut i on 2 で 希 釈 し た 2 次 抗 体 hors eradi s h peroxi das e ( HR P ) -l i nked ant i -m ous e (C e l l S i gnal i ng Technol ogy) に メ ン ブ レ ン を 浸 盪 さ せ 、 そ れ ぞ れ 室 温 1 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 そ の 後 、化 学 発 光 HR P 基 質 (Therm o Fi s her S ci ent i fi c ) を 用 い て 化 学 発 光 さ せ 、Im ag eQuan t LAS 4000 (GE H ea l t hcare ) を 用 い て バ ン ド を 検
出 し た 。
H B V RT-DNA 結 合 ア ッ セ イ
HB V RT と DN A と の 結 合 を 検 出 す る た め 、F ITC ラ ベ ル DN A [5 ´ F ITC -AT GTC AA C AATATGTG GGC C C T C TTAC AGTTAATG ( HB V s equenc e 2581 -2615 ) AA AAA AAAA AA AAAA - 3 ´ ]、0 .4 6 μM HB V RT ド メ イ ン タ ン パ ク 質 を 50 m M Tri s -HC l pH 7.0、1 m M DTT、0.02% Tri t on X-1 0 0、お よ び 8 m M M gC l2を 含 む 溶 液 中 で 3 7 °C 3 0 分 間 反 応 さ せ た 。 そ の 後 、6 % ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル で DNA を 分 離 さ せ 、Typhoon R GB s canne r (GE Heal t hc ar e) で 検 出 し 、Im age Quant T L v8. 2 (G E Heal t h c ar e) で 解 析 し た 。こ の ア ッ セ イ に お い て 、マ ウ ス 白 血 病 ウ イ ル ス (M M LV ) RT ( Takar a B i o) と B S A を そ れ ぞ れ ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル 、 ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル に 用 い た 。
表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 (S PR)
HB V RT ド メ イ ン タ ン パ ク 質 ま た は M M LV RT (The rm o Fi s her S ci ent i fi c) の 被 験 化 合 物 に 対 す る 結 合 親 和 性 は 、B i acor e X100 i ns t rum ent (GE H ea l t hcare ) で 測 定 し た 。HB V RT ド メ イ ン タ ン パ ク 質 ま た は M M LV RT を C M 5 セ ン サ ー チ ッ プ に am i n e cou pl i ng ki t (GE Heal t hc ar e) を 用 い て 、50 m M phos phat e (pH 7.0)、1 m M DTT、8 m M MgC l2、お よ び 0.02% Tri t on X -1 0 0 の 条 件 で 固 相 化 し た 。異 な る 濃 度 の 化 合 物 を ラ ン ニ ン グ バ ッ フ ァ ー [1 0 m M HEP ES (pH 7.4)、150 m M NaC l、3 m M ED TA、0.05% Tw een 20、5% DM S O ] で 希 釈 し 、25°C 、 20 μL/min、1 2 0 秒 間 セ ン サ ー チ ッ プ 上 に イ ン ジ ェ ク シ ョ ン し 、そ の 後 1 2 0 秒 間 ラ ン ニ ン グ バ ッ フ ァ ー を ア プ ラ イ し た 。デ ー タ は 、B i acor e X100 eval u at i on s oft war e (GE He al t hca re ) で 解 析 し た 。
薬 剤 コ ン ビ ネ ー シ ョ ン 評 価
薬 剤 併 用 の 相 乗 ／ 相 加 ／ 相 反 効 果 の 判 定 は 、様 々 な 濃 度 で の HB V 複 製 低 下 プ ロ フ ァ イ ル デ ー タ を M a cS ynergy (M ark P ri cha rd 博 士 よ り 提 供)を 用 い て 、 ソ フ ト の 推 奨 に 従 っ て 解 析 し た (25)。
ア ミ ノ 酸 配 列 比 較 解 析
ア ミ ノ 酸 配 列 比 較 は 、 C LUS TALW
(ht t ps: / / www.genom e.j p/ t ool s -bi n/ cl us t al w) を 用 い て 相 同 性 を 解 析 し た 。
統 計 的 有 意 差 の 検 定
統 計 的 有 意 性 は Student’s t-t est を 用 い て 決 定 し た 。 P 値< 0.05 を 有 意 と み な し た 。 該 当 し た 場 合 、P 値 は*P < 0.05 ま た は **P <0 . 0 1 と し て 示 し た 。
第 三 節 結 果
H B V ポ リ メ ラ ー ゼ の 伸 長 活 性 を 阻 害 す る 化 合 物 の ス ク リ ー ニ ン グ HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の 伸 長 活 性 を 阻 害 す る 化 合 物 を 同 定 す る た め 、 RT ド メ イ ン を 含 む ア ミ ノ 酸 3 04 か ら 8 43 番 目 の HB V ポ リ メ ラ ー ゼ を 組 換 え 型 タ ン パ ク 質 (RT304 -R N as e H、Fi g. 4 A) と し て 大 腸 菌 で 部 分 発 現 し 、 精 製 し た (Fi g. 4B )。 精 製 し た RT304 -R Nas e H は 、5 0 ヌ ク レ オ チ ド 長 の 鋳 型 DNA と 15 ヌ ク レ オ チ ド 長 の プ ラ イ マ ーDNA と と も に イ ン キ ュ ベ ー ト す る こ と で 、DNA 伸 長 反 応 に よ る ラ ダ ー バ ン ド を 生 じ た ( Fi g . 4 C 中 央)。 一 方 で 、 発 現 精 製 し た 触 媒 部 位 変 異 体 組 換 え 型 タ ン パ ク 質 で は 、DNA 伸 長 活 性 が 検 出 さ れ な か っ た ( Fi g.
4 C 右)こ と か ら 、こ の DNA 伸 長 反 応 は 大 腸 菌 か ら 混 入 す る コ ン タ ミ ネ ー シ ョ ン に 由 来 す る も の で は な く 、 精 製 し た 組 換 え 型 タ ン パ ク 質 の 活 性 に 由 来 す る こ と を 示 し て い る 。こ の DNA 伸 長 活 性 は 、M g2 + 濃 度 お よ び p H に 依 存 的 (活 性 は M g2 + 濃 度 4 -7 m M、 お よ び p H 範 囲 7 .0-9 . 5 で 顕 著) で あ る こ と が 示 さ れ た (Fi g. 4D、E )。 そ こ で こ の 組 換 え 型 タ ン パ ク 質 を 用 い て 、HB V RT の 伸 長 活 性 を ハ イ ス ル ー プ ッ ト に 評 価 で き る i n vi t ro ス ク リ ー ニ ン グ シ ス テ ム を 以 下 の よ う に 構 築 し た(Fi g. 5 A)。5 ’-bi ot i n 化 DNA ol i go ヌ ク レ オ チ ド を 鋳 型 と し て 5 ’-FAM ラ ベ ル 化 o l i go (dT)プ ラ イ マ ー と イ ン キ ュ ベ ー ト し 、 こ の ア ニ ー リ ン グ し た 鋳 型 ／ プ ラ イ マ ー 二 重 鎖 を s t rept avi di n コ ー ト ウ ェ ル に 固 相 化 し た 。さ ら に DNA 伸 長 至 適 条 件 下 で 被 験 化 合 物 の 存 在 、 非 存 在 下 で RT304 - R Nas e H タ ン パ ク 質 と と も に イ ン キ ュ ベ ー ト し 、 DNA 伸 長 反 応 を お こ な っ た (方 法 お よ び Fi g . 4 C -E 参 照)。 反 応 後 、 伸 長 し た 二 重 鎖 は ウ ェ ル に 保 持 さ れ る が(Fi g . 5 A 左)、 伸 長 し て い な い プ ラ イ マ ー は 洗 浄 さ れ る ( Fi g. 5 A 右) 条 件 の 30 °C で 、TE バ ッ フ ァ ー で 3 回 洗 浄 し た 。 保 持 さ れ た プ ラ イ マ ー の 蛍 光 強 度 を 測 定 す る こ と で 、HB V RT 依 存 的 DNA 伸 長 の 指 標 と し た 。こ の ア ッ セ イ を 用
い て 、本 研 究 で は 1 , 1 2 0 種 類 で 構 成 さ れ る 化 合 物 ラ イ ブ ラ リ ー を 10 0 μM 添 加 で ス ク リ ー ニ ン グ し た 。Fi g. 5 B に お い て 、 白 色 の ウ ェ ル は 低 い 蛍 光 シ グ ナ ル 、 す な わ ち HB V RT 依 存 的 DNA の 伸 長 を 阻 害 し て い る こ と を 示 し 、 黒 色 の ウ ェ ル は DNA が 伸 長 し て い る こ と 、 す な わ ち DNA 伸 長 が 行 な わ れ て い る こ と を 示 し て い る と 期 待 さ れ る 。 こ の 1 次 ス ク リ ー ニ ン グ で は 蛍 光 強 度 を 定 量 し 、5 0 %以 下 に 蛍 光 強 度 を 減 少 さ せ る も の を ヒ ッ ト と し て 、2 3 化 合 物 を 同 定 し た (Fi g. 6 )。 2 次 ス ク リ ー ニ ン グ と し て 、 鋳 型 D NA と 蛍 光 プ ラ イ マ ー を 用 い た DNA 伸 長 反 応 を PAGE に よ る ラ ダ ー バ ン ド で 評 価 し 、5 0 ヌ ク レ オ チ ド 長 の バ ン ド の 蛍 光 強 度 を 5 0 %以 下 に 減 少 さ せ る 化 合 物 を 1 次 ヒ ッ ト か ら 選 別 し 、1 5 化 合 物 を 得 た (方 法 参 照) ( Fi g. 7 A )。 さ ら に 3 次 ス ク リ ー ニ ン グ と し て 鋳 型 R NA を 用 い た 同 様 の 方 法 で 評 価 し 、 DNA 伸 長 の ラ ダ ー バ ン ド を 減 少 さ せ る 5化 合 物 を 同 定 し た (方 法 参 照) ( Fi g. 7 B )。Fi g. 5 C で は ヒ ッ ト 化 合 物 を 加 え る こ と で 3 0 ヌ ク レ オ チ ド 長 以 上 の ラ ダ ー バ ン ド が 減 少 す る 代 表 的 な PAGE を 示 し た 。 こ れ ら 5 化 合 物 の 、 培 養 系 に お け る H B V 複 製 へ の 効 果 を 調 べ る た め に 、テ ト ラ サ イ ク リ ン 非 存 在 下 で HB V を 複 製 す る Hep3 8.7 -Tet 細 胞 を 用 い た HB V 複 製 ア ッ セ イ を 行 っ た (23 )。Hep3 8. 7-Tet 細 胞 に 化 合 物 を 10、3 0、100 µ M 処 理 し 、6 日 間 培 養 後 の 培 養 上 清 よ り HB V DN A を 定 量 し 、 そ の 阻 害 効 果 を 評 価 し た (Fi g. 8 )。 そ の 結 果 、OR -4 8 6 と pi ceat annol は 100 µ M で HB V DNA を 顕 著 に 減 少 さ せ た (Fi g. 8 )。た だ し OR -4 8 6 に 関 し て は 市 販 さ れ る 類 縁 体 が 殆 ど な か っ た た め 、 本 研 究 で は pi ceat ann ol に 着 目 し て 、 以 下 の 解 析 を 進 め た 。
Pi ceatan n ol 類 縁 体 の H B V 複 製 阻 害 効 果
よ り 高 い 抗 HB V 効 果 が 高 い 化 合 物 を 探 索 す る た め に 、6 つ の pi ceat annol 類 縁 体 、 P DM2、 P DM 11、C AY10465、 pt e rost i l bene、 resve rat rol、お よ び 4,4´ -di chl oro -t rans- st i l bene ( Fi g. 9A) の 抗 HB V 活
性 お よ び 細 胞 毒 性 を 評 価 し た 。HepG 2.2.15.7 細 胞 に (23 )、様 々 な 濃 度 の 化 合 物 を 6 日 間 処 理 し 、リ ア ル タ イ ム P C R に よ り 培 養 上 清 中 の HB V DNA を 定 量 す る こ と に よ り 、 阻 害 効 果 を 評 価 し た (Fi g. 9 B )。
P DM2、P DM 11、 お よ び C AY10465 は pi ceat annol よ り 阻 害 効 果 が 高 く 、細 胞 毒 性 を 発 揮 せ ず に 濃 度 依 存 的 に HB V 複 製 を 阻 害 し た (Fi g.
9 B、C )。対 照 的 に res verat r olと 4,4 ´ -di chl oro -t r ans-s t i l beneは HB V DNA レ ベ ル の 顕 著 な 低 下 は 認 め ら れ な か っ た (Fi g. 9 B )。P iceat annol、 P DM 2、P DM 11、 お よ び C AY10465 の IC5 0値 (±は S D を 示 す) は 、 そ れ ぞ れ 96.2 ± 4.6、1 4 . 4 ± 7.7、5 5 . 0 ± 27.0、 お よ び 90.0 ± 13.8 μM で あ っ た 。 こ れ ら 結 果 を 支 持 す る サ ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 に お い て 、 P DM2 お よ び P DM 11 処 理 し た Hep G2 .2.15.7 細 胞 か ら 抽 出 し た ヌ ク レ オ キ ャ プ シ ド 内 の HB V DNA が 減 少 し て い る こ と が 示 さ れ た(Fi g.
9 D)。
H B V 感 染 細 胞 で の PDM2 と P DM11 の 抗 H B V 効 果
さ ら に HB V 感 染 細 胞 で の HB V 複 製 へ の 化 合 物 の 効 果 を 評 価 し た 。 HB V 感 受 性 の あ る HepG2 - hNTC P -C 4 細 胞 (21) を 用 い て 、ウ イ ル ス の 侵 入 フ ェ ー ズ (実 験-a：化 合 物 を H B V 感 染 前 2 時 間 お よ び 感 染 中 1 6 時 間 に 処 理) お よ び 複 製 フ ェ ー ズ (実 験-b：化 合 物 を 感 染 後 1 2 日 間 処 理) へ の 化 合 物 の 効 果 を 評 価 し た (Fi g. 10 A )。 実 験-a で は 、 ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル と し て 既 存 の HB V 侵 入 阻 害 剤 M yrcl udex -B は 、HB V DNA 量 を 顕 著 に 減 少 さ せ た 一 方 で 、P DM 2 と PDM 11 は ほ と ん ど 効 果 を 示 さ な か っ た 。 一 方 実 験-b で は 、 複 製 を 阻 害 す る 核 酸 ア ナ ロ グ ET V は 強 く HB V DN A を 減 少 さ せ 、 こ の 時 P D M 2 お よ び P DM11 も H B V DN A を 減 少 さ せ た 。 こ の 結 果 は 、P DM 2 と P DM 11 は HB V の 複 製 過 程 を 阻 害 す る こ と を 示 す も の で あ る( Fi g. 1 0B -b )。
ま た 、P DM2 に よ る HB V 複 製 の 阻 害 は 、HB V 感 染 初 代 ヒ ト 肝 細 胞 に お い て も 同 様 に 認 め ら れ 、 こ の 時 細 胞 毒 性 は 見 ら れ な か っ た(Fi g.
11 A、B )。こ の よ う に こ れ ら 化 合 物 は 、HB V 感 染 細 胞 で の HB V 複 製 を 阻 害 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。
PDM2 と H B V RT ド メ イ ン の 相 互 作 用
P i ceat a nno l 類 縁 体 の 中 で 最 も 阻 害 活 性 が 高 か っ た P D M 2 に 焦 点 を あ て 、 組 換 え 型 HB V RT ド メ イ ン タ ン パ ク 質 と の 分 子 相 互 作 用 を 表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 で 検 討 し た 。 こ の 解 析 の た め 、Hi s タ グ を 付 加 し た 組 換 え 型 HB V RT ド メ イ ン タ ン パ ク 質 (ア ミ ノ 酸 3 4 7 番 目 か ら 6 90 番 目) を 発 現 精 製 し た と こ ろ 、 ク マ シ ー 染 色 お よ び ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト 解 析 よ り 、 純 度 9 0 %以 上 を 示 し (Fi g. 1 2 A)、 化 合 物 ス ク リ ー ニ ン グ に 使 用 し た RT3 0 4-R Nase H ( Fi g. 4 B ) よ り も 高 い 純 度 で あ っ た 。 ま た こ の 組 換 え 型 HB V RT は 、 ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル と し て 用 い た 市 販 の M M LV RT と 同 様 、DN A結 合 活 性 を 保 持 し て い た(Fi g.
1 2 B )。そ こ で こ れ ら タ ン パ ク 質 を S P R 解 析 セ ン サ ー チ ッ プ に 固 相 化 し 、様 々 な 濃 度 の P DM 2 お よ び ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル 化 合 物 と し て B refel di n A を チ ッ プ 上 に 流 し た (Fi g. 1 2 C )。P DM 2 は 濃 度 依 存 的 に HB V RT 固 相 化 チ ッ プ と S P R シ グ ナ ル を 示 し た が (Fi g. 1 2 C -a )、 B refel di n A で は そ の よ う な シ グ ナ ル は 認 め な か っ た ( F i g. 1 2C -b )。 ま た P DM 2 は 、 コ ン ト ロ ー ル タ ン パ ク 質 で あ る M M LV RT の 固 相 化 チ ッ プ と は 相 互 作 用 は 示 さ な か っ た (Fi g. 1 2 C -c )。以 上 の 結 果 よ り 、 P DM 2 は HB V RT ド メ イ ン と 特 異 的 に 相 互 作 用 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。
NRT I 耐 性 H B V 複 製 へ の PDM2 の 効 果
Ent ec avi r (ETV )、l am i vudi ne (LM V)、 ade fovi r (AD V)、 お よ び t enofovi r al a fen am i de (TAF ) は NRT I に 含 ま れ (Fi g. 1 3 A )、DNA 合 成 に お け る ヌ ク レ オ シ ド の 取 込 み 時 に 拮 抗 す る こ と で 、H B V 複 製 を 阻 害 す る 。P DM2 は NRT I 構 造 を そ の 分 子 内 に 持 っ て お ら ず 、 従 っ て
NRTI と は 異 な る 作 用 機 序 で HB V 複 製 を 阻 害 す る と 考 え ら れ た 。 こ の 仮 説 を 検 証 す る た め 、ETV と LM V に 耐 性 を 獲 得 し た HB V 臨 床 分 離 株 、す な わ ちHB Vポ リ メ ラ ー ゼ の RTド メ イ ン 内 に L18 0M、S 202G、 お よ び M 204V 変 異 を 持 つ HB V 株 ( 24 ) の 複 製 に 対 す る P DM 2 の 効 果 を 検 討 し た 。 HepG 2 細 胞 に HB V 野 生 型 あ る い は L180M/ S 202G/ M 2 0 4 V 変 異 体 の 発 現 プ ラ ス ミ ド を ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し 、3 日 間 化 合 物 を 処 理 し 、 ヌ ク レ オ キ ャ プ シ ド 内 HB V DN A を 定 量 し た ( Fi g. 1 3B )。予 測 さ れ た 通 り 、ETV は 野 生 型 HB V の 複 製 を 強 く 阻 害 す る 一 方 で 、L180M/ S 202 G/ M 204V 変 異 体 の 複 製 に は ほ と ん ど 阻 害 活 性 を 示 さ な か っ た 。一 方 P DM 2 は L180M / S 202G/ M 204V 変 異 体 に お い て も 野 生 型 と 同 様 に H B V DN A レ ベ ル を 減 少 さ せ た (Fi g. 1 3 B )。野 生 型 お よ び L180M/ S 202G/ M 204V 変 異 体 複 製 へ の ETV の IC5 0 (±は S D を 示 す) は そ れ ぞ れ 2 .5 ± 1.7 n M、 お よ び > 10 0 n M で あ る 一 方 で 、P D M 2 は 1 3 . 3 ± 1.1 4 μM、 お よ び 16.4 ± 5.4 μM で あ っ た 。 こ の よ う に P DM 2 は 野 生 型 と HB V 分 離 耐 性 変 異 体 の 両 方 に お い て 、 同 様 の 阻 害 効 果 を 示 し た 。
さ ら に HepG2.2.1 5.7 細 胞 に お け る 、P DM 2 と 上 記 NRTIs の 共 処 理 に よ る 抗 HB V 効 果 を 測 定 し た 。 こ れ ら NRT Is の 単 独 処 理 に よ っ て HB V D NA レ ベ ル は 濃 度 依 存 的 に 減 少 し (Fi g. 1 3 C - F、左, “PDM2 0”)、 さ ら に P DM 2 と の 共 処 理 を 行 う と よ り 強 い DNA レ ベ ル の 減 少 が 見 ら れ( Fi g. 1 3 C - F、 左 、“P DM2 5、10、20”)、 細 胞 毒 性 は 見 ら れ な か っ た (Fi g. 1 3 C -F、 中 央)。B l i s s i ndepe ndenc e m odel (25 ) を 用 い た 相 乗/相 加/相 反 効 果 の 解 析 で は 、P DM2 と NRT Is の コ ン ビ ネ ー シ ョ ン に よ る 抗 HB V 活 性 は お お む ね z 軸 の 0 平 面 付 近 に プ ロ ッ ト さ れ 、つ ま り 検 証 し た ほ と ん ど の 濃 度 域 で 2 剤 は 相 加 効 果 を 示 す こ と が 判 明 し た (Fi g. 13 C - F、右)。こ の よ う に P DM2 は 臨 床 で 用 い ら れ る NRTIs と は 異 な っ た 作 用 機 序 を 持 つ こ と が 示 唆 さ れ た 。
第 四 節 考 察
HB V ポ リ メ ラ ー ゼ は ウ イ ル ス 複 製 に 不 可 欠 な 、ウ イ ル ス 性 タ ン パ ク 質 の う ち 唯 一 酵 素 活 性 を 有 す る 魅 力 的 な 創 薬 標 的 で あ る 。NRTIs は HB V 逆 転 写 で の ウ イ ル ス DNA 伸 長 過 程 に お い て 、D N A 鎖 に 取 込 ま れ 、 伸 長 を 拮 抗 阻 害 す る (7)。HB V 同 様 に 逆 転 写 酵 素 を 持 つ H IV の 抗 ウ イ ル ス 薬 に は 、NRT Is と 異 な り ア ロ ス テ リ ッ ク に RT と 相 互 作 用 し そ の 活 性 を 阻 害 す る NNRT Is が 開 発 さ れ て い る (26,27)。こ の NNRT Is の 特 長 と し て は 、NRT Is と 併 用 す る こ と に よ り 治 療 効 果 が 改 善 さ れ 、 実 際 に 初 期 の H IV 治 療 を 大 き く 進 展 さ せ た (2 7,28)。HB V の よ う な 限 ら れ た 数 の ウ イ ル ス タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る ウ イ ル ス に 対 し て は 特 に 、N N RTI の 開 発 と そ れ に よ る 多 剤 併 用 は 抗 ウ イ ル ス 治 療 を 改 善 す る た め の 強 力 な ア プ ロ ー チ で あ る 。 し か し な が ら HB V に 対 す る NN RT Is の 同 定 は 、HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の RT 酵 素 活 性 を 有 す る 組 換 え 型 タ ン パ ク 質 の 精 製 が 技 術 的 に 困 難 で あ っ た こ と か ら 達 成 さ れ て い な か っ た (6,7)。 本 研 究 で は 近 年 精 製 に 成 功 し た 組 換 え 型 HB V ポ リ メ ラ ー ゼ を 用 い て 、RT ド メ イ ン を 介 し た DNA 伸 長 を 阻 害 す る 化 合 物 を ス ク リ ー ニ ン グ す る i n vi t ro ハ イ ス ル ー プ ッ ト ア ッ セ イ を 開 発 し た 。 ま た 今 回 同 定 し た 化 合 物 は 核 酸 構 造 を 持 た ず 、 NRT Is と は 異 な る 作 用 機 序 に よ り H B V 複 製 を 阻 害 す る と 考 え ら れ た 。 実 際 に 今 回 同 定 し た P DM2 は 、 臨 床 で 問 題 と な っ て い る 既 存 核 酸 ア ナ ロ グ へ の 耐 性 HB V に も 効 果 を 示 し た 。 こ れ ら の デ ー タ は 、 本 研 究 で 構 築 し た ス ク リ ー ニ ン グ 系 が NNRT Is の 同 定 に 有 用 で あ る こ と を 示 し て い る 。
本 ス ク リ ー ニ ン グ で は 、抗 HB V 化 合 物 と し て s t i l bene 類 縁 体 を 同 定 し た ( Fi g. 9A )。Fi g.1 4 に 構 造 と 活 性 の 関 係 性 を ま と め た 。 ま ず P DM2、P DM11、C AY10465、 お よ び pt erost i l bene は pi c eat annol や resve rat rol よ り 高 い 阻 害 活 性 を 持 っ て お り 、R 1 お よ び R 2 の OH を
C l ま た は OC H3に 置 換 す る こ と で 阻 害 活 性 が 増 加 す る と 考 え ら れ た 。 ま た P DM 11 と pt eros t i l bene の 比 較 、お よ び P DM 2 と C AY10465 の 比 較 か ら 、R 4に C lを 有 す る こ と で 阻 害 活 性 が 増 加 す る と 考 え ら れ た 。 一 般 に こ れ ら s t i l bene は 、 生 体 異 物 を 認 識 し そ の 代 謝 プ ロ セ ス に 関 与 す る 転 写 因 子 で あ る aryl hyd roc a rb on rec ept or (AhR ) の 潜 在 的 な リ ガ ン ド と な り (2 9)、P DM 2 に AhR ア ン タ ゴ ニ ス ト 活 性 、C AY10465 に AhR ア ゴ ニ ス ト 活 性 が あ る こ と が 報 告 さ れ て い る (30)。 こ の 両 者 は そ れ ぞ れ AhR ア ゴ ニ ス ト 、ア ン タ ゴ ニ ス ト と 逆 の 活 性 を 有 し て い る に も 関 わ ら ず 、 双 方 と も HB V 複 製 阻 害 す る と い う 事 実 は 、 観 察 さ れ た 抗 HB V 活 性 は AhR に 対 す る 作 用 と は 独 立 し た も の で あ る こ と を 強 く 示 唆 し て い る 。S t i l bene の 構 造 活 性 相 関 に 基 づ く さ ら な る 類 縁 体 解 析 に よ っ て 、 よ り 強 力 な HB V 阻 害 剤 が 今 後 得 ら れ る と 期 待 さ れ る 。 さ ら に HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の RT と AhR の リ ガ ン ド 結 合 ド メ イ ン (PAS -B ) の ア ミ ノ 酸 配 列 に 関 し て 相 同 性 を 比 較 す る と 、 RT 1 6 2‐1 7 6 aa の 領 域 に 2 7 %の 相 同 性 、2 3 4‐2 4 3 aa の 領 域 に 4 0 % の 相 同 性 の よ う に 、類 似 性 が あ る 領 域 が 見 ら れ た ( Fi g. 15)。特 に RT の ボ ッ ク ス B に 位 置 す る 16 2‐166 aa 領 域 で は 、 一 致 す る ア ミ ノ 酸 と 類 似 性 が 高 い ア ミ ノ 酸 が 5 個 続 く 配 列 が 見 ら れ た 。今 後 は 、PAS -B と 相 同 性 の あ る RT 領 域 欠 失 変 異 体 を 作 製 し 、s t i l bene 類 縁 体 と の 相 互 作 用 解 析 を 行 う こ と に よ り 、HB V ポ リ メ ラ ー ゼ に お け る s t i l bene 類 似 体 と の 結 合 部 位 が 実 験 的 に 解 明 さ れ る 可 能 性 が あ る 。
一 般 的 に 多 剤 併 用 は 治 療 効 果 を 改 善 す る こ と が 、H IV や HC V に 対 す る 治 療 で 示 さ れ て い る (31 -33 )。 特 に 臨 床 的 に 使 わ れ る NRTIs と P DM2 に よ る 共 処 理 は 細 胞 培 養 で の 抗 HB V 活 性 を 増 強 し 、P DM 2 は HB V 薬 剤 耐 性 株 に 対 し て も (細 胞 培 養 に お い て) 効 果 的 で あ っ た 。 こ の よ う に 、 今 回 ス ク リ ー ニ ン グ に よ っ て 同 定 し た 化 合 物 は 、 慢 性 B 型 肝 炎 に 対 す る 活 性 を 持 つ 新 し い 治 療 法 改 善 に 有 効 で あ る と 期 待 さ れ る 。本 研 究 の 結 果 は 、HB V ポ リ メ ラ ー ゼ を タ ー ゲ ッ ト に す る こ
と に よ り 、N NRT Is の 開 発 に 新 た な 可 能 性 の 光 を 当 て た 。
第 二 章 エ ン テ カ ビ ル 耐 性 HBV 由 来 ポ リ メ ラ ー ゼ 変 異 体 の カ イ ネ テ ィ ク ス 解 析
第 一 節 序 論
全 て の NRTI は 伸 長 活 性 を 阻 害 し 、 ま た ETV、ADV、 お よ び TFV で は プ ラ イ ミ ン グ 活 性 も 阻 害 す る こ と が 知 ら れ て い る (34 )。NRT I の 耐 性 変 異 は RT 内 の ア ミ ノ 酸 が 置 換 さ れ る こ と で 引 き 起 こ さ れ る が 、こ れ ら 変 異 は R NA d epend ent ポ リ メ ラ ー ゼ の 種 間 で 保 存 性 が 高 い ア ミ ノ 酸 配 列 内 (小 ド メ イ ン) で 起 き て お り (35,36 ) ( Fi g . 1 6A)、
ま た 既 知 の H IVポ リ メ ラ ー ゼ 立 体 構 造 を 用 い た 分 子 モ デ リ ン グ に よ る HB V ポ リ メ ラ ー ゼ 立 体 構 造 に お い て 、 耐 性 変 異 に 関 係 す る ア ミ ノ 酸 位 置 が 推 定 さ れ て い る (35) (Fi g. 1 7 )。LM V 耐 性 は 、RT 内 の 触 媒 部 位 YM DD (RT 内 の ア ミ ノ 酸 位 置 : 203 -2 06 ) に 含 ま れ る M 204の 変 異 M 204V/ I が 1 次 変 異 と し て 構 成 さ れ 、 さ ら に L180 M の 変 異 が 2 次 変 異 と し て 加 わ る と 、 ウ イ ル ス 複 製 効 率 を 補 う 変 異 と し て 複 製 が 増 幅 さ れ る 。 ま た V1 7 3 L の 変 異 が L180M / M 204V 変 異 体 に 加 わ る こ と で 、 さ ら に ウ イ ル ス 複 製 が 増 幅 さ れ る (35 ,37 )。V 173 と L180 は RT の ボ ッ ク ス B に 位 置 し て い る が (Fi g. 1 6 A )、RT 内 に 存 在 す る 各 小 ド メ イ ン の 機 能 は H IV RT の 立 体 構 造 か ら 想 定 さ れ て お り 、 ボ ッ ク ス B と E は テ ン プ レ ー ト 結 合 に 重 要 で あ り 、 ボ ッ ク ス A と D は ヌ ク レ オ シ ド 結 合 に 重 要 と さ れ て い る (35,38,39)。L 80V/ I も ウ イ ル ス 複 製 を 補 填 す る 変 異 と し て 報 告 さ れ て い る 。 さ ら に ま た L180M/ M 204V の 変 異 に 、2 次 変 異 と し て I169、T184、S 20 2、 ま た は M250 の 変 異 が 加 わ る と 、L180M / M 204V よ り も ET V 耐 性 が 高 く な る こ と が 報 告 さ れ て い る (35)。AD V と TFV 耐 性 は 、A181T/ V (ボ ッ ク ス B ) ま た は N236T (ボ ッ ク ス D) が 1 次 変 異 と し て (36)、
A194T (ボ ッ ク ス B ) が 2 次 変 異 と し て 報 告 さ れ て い る (4 0)。
NRTI 薬 剤 耐 性 変 異 に お け る 、ウ イ ル ス 複 製 と 薬 剤 耐 性 の 大 き さ に つ い て は 前 述 の よ う に 多 く 分 析 さ れ て い る が 、 生 化 学 的 な 研 究 は 組 換 え 型 タ ン パ ク 質 の 発 現 が 困 難 で あ る た め に 殆 ど さ れ て い な い 。 一 部 、ヒ ト 細 胞 よ り 産 生 さ れ た 組 換 え 型 HB V ポ リ メ ラ ー ゼ を 用 い て 、 ETV 耐 性 変 異 体 ポ リ メ ラ ー ゼ の カ イ ネ テ ィ ク ス 研 究 が さ れ て い る (9,37,41) が 、伸 長 活 性 に 着 目 し た 研 究 は 未 報 告 で あ る 。一 般 的 に 酵 素 の 生 化 学 的 特 性 を 解 析 し 理 解 す る こ と は 、 新 た な 薬 剤 開 発 に 非 常 に 重 要 で あ る 。本 論 文 で は 、蛍 光 プ ラ イ マ ー 伸 長 法 を 使 用 し て 、ETV 耐 性 ポ リ メ ラ ー ゼ の 伸 長 活 性 に 着 目 し た 生 化 学 的 解 析 を 初 め て 試 み た 。
第 二 節 方 法
試 薬
Deoxynu cl eot i de ( dNTP ) は Therm o F i s her S ci ent i fi c よ り 購 入 し た 。 Di deoxynucl eot i de ( ddNTP ) は S i gm a-A l dri ch よ り 購 入 し た 。LM V-TP abcam よ り 購 入 し た 。ETV- TP は Gen eAC T, In c (久 留 米 、日 本) に て 合 成 し た 。
プ ラ ス ミ ド
N 末 端 に Hi s タ グ を コ ー ド し た 組 換 え 型 HB V ポ リ メ ラ ー ゼ 断 片 DNA [遺 伝 子 型 C - HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の ア ミ ノ 酸 残 基 3 0 4 か ら 8 43 番 目 に 対 応；ク ロ ー ン A1 (a cc ess i on num ber AB 246344 )、A2、A1+M V (42)、A1+L1 8 0M / S 202 I/ M 204V、 お よ び A1+ L180M / M 20 4V/ M 250V、 こ れ ら プ ラ ス ミ ド は 加 藤 先 生 よ り 譲 り 受 け た] は 、P C R で 増 幅 し 、 pET28b (M er ck D ar m s t adt、Germ a ny) の N d eI-E coR I サ イ ト 間 に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し て 、 そ れ ぞ れ pET28 - wi l d t ype 、
pET28 -V173L/ L1 80 M / M 204V 、 pET28 -L180M / M 204V 、
pET28 -L180M / S 202 I/ M 204 V、お よ び p ET28 -L180M / M 204 V/ M 250V を 作 製 し た 。M 20 4 V は 、A1 を 鋳 型 に 使 用 し 、Qu i kC hange II S i t e Di r ect e d Mut agenes i s Ki t (S t rat ag ene, L a Jol l a, C A) を 用 い て メ ー カ ー 推 奨 プ ロ ト コ ー ル に 従 っ て 作 製 し 、pET28 - M 204V と し た 。作 製 し た プ ラ ス ミ ド の DN A 配 列 は 、DNA シ ー ケ ン ス で 確 認 し た (FAS M AC も し く は eurofi ns genom i c s )。
組 換 え 型 H B V ポ リ メ ラ ー ゼ の 野 生 型 と 変 異 体 の 発 現 と 精 製
組 換 え 型 HB V RT304 -R Nas e H の 野 生 型 (A1) と 5 種 変 異 体 は 、大 腸 菌 で 発 現 し 、 非 変 性 条 件 下 で 精 製 し た 。 発 現 と 精 製 は 、 第 一 章/ 第 一 節 に 記 載 の 方 法 で 行 っ た 。
H B V RT 3 0 4 -R Nas e H の 伸 長 ア ッ セ イ
HB V RT304 -R N a s e H 野 生 型 と 5 種 変 異 体 の 各 タ ン パ ク 質 (0.4 μM)、50 m M Tri s -H C l (pH 8. 0)、3 m M M gC l2、1 m M DTT、0.02% Tri t on X-1 0 0、0.25 m M M n C l2、0.4 % R Nase i n hi bi t or (Takar a)、0.02 μM FITC ラ ベ ル し た プ ラ イ マ ー (5 ´ -F ITC -TC A C GGTGGTC TC C AT GC G -3 ´ )、
0.02 μM 鋳 型 R NA ( 2 1A :
AAAAA AAAA AAA AAAAA AAAAC GC AUGGA GAC C -AC C GUGA、
21U : UUUUUU UU UUUUU UUUU UUU UC GC AUGGA GAC C AC C GUGA、 4C : C C C C C GC AUGGAGAC C AC C GUG A、
5G : GGGG GC GC AUGGA GAC C AC C GUGA )、 お よ び 各 濃 度 の 基 質 (dATP、TTP、dC TP、dGTP、ETV-TP、L M V-TP、ddGTP、お よ び ddC TP ) を 混 合 し 、3 7 °C 2 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 伸 長 し た バ ン ド の 検 出 は 、10% ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド/ 6M 尿 素 ゲ ル に て 泳 動 分 離 し 、Typhoon R GB s canne r (GE Heal t hc ar e) で 検 出 し 、Im age Quant T L v8. 2 (G E Heal t hc ar e) で 解 析 し た 。
H I V RT の 発 現 と 精 製 、 お よ び 伸 長 ア ッ セ イ
組 換 え 型 H IV RT は 、pQEH IV (93JP - NH1) RT p 51 / p 6 1 (4 3) (佐 藤 先 生 よ り 譲 り 受 け た) を タ ン パ ク 質 発 現 用 の 大 腸 菌 XL-1 B l ue (M er ck) に 形 質 転 換 し 、 形 質 転 換 し た 大 腸 菌 は 3 7 °C で 、 吸 光 度 600 nm (OD600) =0 . 6 に な る ま で 振 と う 培 養 し た 。 組 換 え 型 タ ン パ ク 質 は 1 m M IP TG 添 加 し 、3 7°C 3 時 間 振 と う 培 養 す る こ と で 誘 導 し た 。培 養 後 に 大 腸 菌 を 遠 心 回 収 し 、 溶 解 バ ッ フ ァ ー [50 m M p h os phat e (p H 8 .0 )、0.5 M NaC l、0.1% Tri t on X -100、1 m M i m i dazol e、1 m M DT T お よ び cOmplete™ Protease Inhibitor cocktail (Roche)] に 再 懸 濁 し 、 氷 上 で 超 音 波 破 砕 し た 。 超 遠 心 後 、 可 溶 性 画 分 に 得 ら れ た H IV RT は 、Hi s Trap c rude (GE Heal t h car e) に 供 す こ と で 精 製 し 、20 m M Tri s -HC l (pH 8.0)、0.5 M NaC l、1 m M et hyl enedi am i net et r a acet i c a ci d
(EDTA )、1 m M di t hi ot hrei t ol (DTT)、 お よ び 0.02% Tri t on X -1 0 0 の バ ッ フ ァ ー で 回 収 し た 。 さ ら に ゲ ル ろ 過 カ ラ ム S uperd ex 20 0 Incr eas e (GE H eal t hc are ) で 分 画 し 、20 m M Tri s -HC l (pH 8.0 )、0.5 M NaC l、1 m M EDTA、1 m M DTT、 お よ び 0.05 % Tri t on X -1 0 0 の バ ッ フ ァ ー で 回 収 し た 。目 的 タ ン パ ク 質 を 含 む 画 分 は 10 % g ryc erol を 添 加 し −8 0 °C に 保 存 し た 。
伸 長 ア ッ セ イ は 、 組 換 え 型 H IV RT (0.4 μM )、50 m M Tri s -HC l (pH 8 . 0)、1 m M M gC l2、1 m M DTT、50 m M KC l、0 .4 % RNas e i n hi bi t or
(Taka ra) 、 0.02 μM FITC ラ ベ ル し た プ ラ イ マ ー
(5 ´ -F ITC - TC AC GGT GGTC TC C ATGC G -3 ´ )、0.02 μM 鋳 型 RNA ( 1 9C : C C C C C CC C C CC C CC C C C C CC GC AUGGAGAC C AC C GUGA )、お よ び 各 濃 度 の 基 質 (dGTP、ETV-TP、 お よ び ddGTP ) を 混 合 し 、3 7 °C 2 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。バ ン ド の 検 出 は 、10% ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド / 6M 尿 素 ゲ ル に て 泳 動 分 離 し 、Typho on R GB s c an ne r (GE He al t hca re) で 検 出 し 、Im ag e Q uant TL v8. 2 (GE He al t hcar e) で 解 析 し た 。
カ イ ネ テ ィ ク ス 解 析
野 生 型 お よ び 変 異 体 の 各 基 質 に お け る 伸 長 ア ッ セ イ は 、2 回 も し く は そ れ 以 上 の 独 立 し た 実 験 を 行 い 、 そ の DNA 伸 長 産 物 を Im age Quant TL v8.2 で 定 量 化 し た 。 シ ト シ ン (4C ) と グ ア ニ ン (5 G) は 2 次 構 造 を 形 成 し や す い た め 、短 い 鋳 型 を 用 い た 。Vm ax お よ び Km は ラ イ ン ＝ ウ ェ バ ー バ ー グ の プ ロ ッ ト か ら 算 出 し た 。
第 三 節 結 果
組 換 え 型 H B V ポ リ メ ラ ー ゼ の 野 生 型 と 変 異 体 の 発 現 と 精 製
A1 (野 生 型) お よ び A2 (V173L/ L1 80M/ M 204V ) は 臨 床 分 離 株 で あ り (42)、L180M / M 2 04V、L180M / S 202 I/ M204V、L180M / M 204V/ M 250V お よ び M 204V は 既 知 の LMV お よ び ETV 耐 性 変 異 を 導 入 し た 変 異 体 で あ る (36,44 )。精 製 し た タ ン パ ク 質 量 は 、N 末 端 Hi s 抗 原 を 用 い て 定 量 化 し た 。 組 換 え 型 タ ン パ ク 質 が 含 ま れ る ゲ ル ろ 過 精 製 画 分 に は 、 多 量 の 大 腸 菌 由 来 の タ ン パ ク 質 が 含 ま れ 、 ま た 各 組 換 え 型 タ ン パ ク 質 は 精 製 過 程 の 間 に 分 解 し て い た が 野 生 型 と 各 変 異 体 は 同 様 の 泳 動 パ タ ー ン で 得 ら れ た (Fi g. 1 6 B )。
H B V RT 3 0 4-R Nas e H の 野 生 型 と 変 異 体 に お け る E T V-TP の 効 果 野 生 型 お よ び 5 種 変 異 体 に お け る ETV-TP の 阻 害 効 果 は 、10 μM dGTP に 2 0 0、1 0 0、5 0、お よ び 25 μM ETV-TP も し く は d dGT P (コ ン ト ロ ー ル ：ch ai n t e rm i na t or) を 加 え 評 価 し た (Fi g. 1 8 )。ETV-TP は ddGTPと 同 様 に 、野 生 型 と 各 変 異 体 に お い て 濃 度 依 存 的 に 阻 害 し た 。 野 生 型 お よ び 各 変 異 体 に お い て 、 逆 転 写 反 応 に よ り 鋳 型 R NA-4 C よ り 1 つ 基 質 が 付 加 さ れ た 5 ヌ ク レ オ チ ド 長 が 産 生 さ れ た 。 V173/ L/ L180M / M 20 4 の RT 伸 長 活 性 は 最 も 弱 く 、M 2 0 4 V も 野 生 型 よ り 活 性 が 弱 か っ た 。 ま た L180M / M20 4V と L 180M / M 204 V/ M 250V に お い て 、ETV-TP の 高 濃 度 領 域 で 野 生 型 よ り も 3 -4 ヌ ク レ オ チ ド 長 の 伸 長 反 応 が 強 く 検 出 さ れ た こ と か ら 薬 剤 耐 性 を 獲 得 し て い た ( Fi g.
1 8 B )。
H B V RT 3 0 4-R Nas e H の 野 生 型 と 変 異 体 に お け る L MV-TP の 効 果 ETV 耐 性 変 異 は LM V の 耐 性 変 異 と 共 有 し て お り (36)、LMV-TP の 阻 害 効 果 は 10 μM dCTP に 200、100、50、お よ び 25 μM LMV-TP も
