結 果

し く は ddC TP (コ ン ト ロ ー ル：chai n t er m i nat or ) を 加 え 評 価 し た (Fi g.

1 9 )。5 ヌ ク レ オ チ ド 長 を 超 え る ス メ ア な バ ン ド が 産 生 さ れ る と と も に 、 変 異 体 で は 野 生 型 よ り 強 力 な ス メ ア な バ ン ド が 産 生 さ れ た 。 d dC TP と LM V-T P の RT 産 物 を 比 較 す る と 、 今 回 調 べ た 全 タ ン パ ク 質 の 中 で 、明 ら か に ddC TP よ り LM V-TP に お い て ス メ ア な バ ン ド が 産 生 さ れ た 。

H B V と H I V に お け る E T V-TP と L MV-T P の 取 り 込 み

LMV-TP は chai n t erm i nat or で あ り 、ETV-TP は del ayed chai n t erm i nat or と し て 報 告 さ れ て い る (45 )。Fi g. 2 0 に 示 し た 通 り 、HB V RT304 -R Nas e H野 生 型 と 2 0 0 μM dd G TP ま た は ETV-TP だ け を イ ン キ ュ ベ ー ト す る と 1ヌ ク レ オ チ ド 長 で 伸 長 が 止 ま っ た が 、20 0 μM dGTP で は 4-5 ヌ ク レ オ チ ド 長 ま で 伸 長 さ れ た (Fi g . 2 0A 左)。一 方 HIV で は 、H IV RT 野 生 型 と 1 0 0 μM ETV- TP と イ ン キ ュ ベ ー ト す る と 、1 ヌ ク レ オ チ ド よ り 長 い DNA が 産 生 さ れ た 。ま た ETV-TP の 産 生 物 は d GTP の 産 生 物 よ り 短 く 、ddGTP の 産 生 物 は 1 ヌ ク レ オ チ ド 長 で 伸 長 は 止 ま っ た ( Fi g . 2 0 A 右)。同 様 に 、HB V RT 3 04 -R N as e H 野 生 型 と 2 00 μM LM V-TP の 反 応 で は 、2 0 0 μM ddC TP の 反 応 と 同 様 に 1 ヌ ク レ オ チ ド 長 で 伸 長 が 止 ま り 、20 0 μM dC TP で は 5 ヌ ク レ オ チ ド 長 ま で 伸 長 さ れ た ( Fi g . 2 0B )。

H B V RT 3 0 4 - RNas e H の 野 生 型 と 変 異 体 に お け る カ イ ネ テ ィ ク ス 解 析

野 生 型 お よ び 5 種 変 異 体 の カ イ ネ テ ィ ク ス 解 析 は 、 様 々 な 濃 度 の 各 基 質 と 鋳 型 R N A を 用 い た 伸 長 ア ッ セ イ を 定 量 化 し 、 得 ら れ た 値 を ラ イ ン ＝ ウ ェ バ ー バ ー グ の プ ロ ッ ト か ら Km と Vm ax を 算 出 し た (Fi g. 21、22、 お よ び Tabl e.1)。 ラ イ ン ＝ ウ ェ バ ー バ ー グ の プ ロ ッ ト は 、2 回 も し く は そ れ 以 上 の 独 立 し た 実 験 デ ー タ で 構 成 し た 。 野 生

型 の Km は d ATP (19.45 μM ) と TTP ( 17.20 μM ) よ り も d GTP ( 2.35 μM) と dC TP ( 1. 4 4 μM ) が 低 か っ た 。 次 に 野 生 型 と ETV 耐 性 変 異 体 と の 各 基 質 に お け る Km 値 を 比 較 し た と こ ろ 、野 生 型 に 比 べ ETV 耐 性 が 11 5 倍 増 加 す る 変 異 体 L180M/ M 204V で は ( 42)、 野 生 型 よ り も 全 て の 基 質 に お い て Km 値 が 低 く Vm ax が 速 か っ た 。し か し な が ら 、 ETV 耐 性 が 9 9 . 7 倍 増 加 す る 変 異 体 V1 7 3 L/ L180M / M 204V で は (42)、 d GTP に 対 す る Km が 約 10 倍 高 く な り 、 そ の 他 の 基 質 に 対 す る Km 値 は 全 て 低 か っ た 。 ま た Vm ax で は 、 野 生 型 に 比 べ TT P と d GTP は 約 半 分 に 低 下 し 、d ATP は 同 程 度 、dC TP で は 速 く な っ て い た 。

L180M / M 204V に 対 す る S 202 I ま た は M 2 5 0V の 追 加 変 異 は 、 さ ら に ETV 耐 性 を 増 加 さ せ る た め ( 35, 36)、L180M / S 202 I/ M 204V と L180M/ M 204V / M 250V の 変 異 体 を 検 証 し た 。L180M / M204V / M 250V は 、全 て の 基 質 に お け る Km 値 は 野 生 型 に 比 べ 低 下 し て お り 、Vm ax は dATP と d C TP で 速 く な っ て い た 。L1 80M / S 202I/ M 204V で は 、d GTP に 対 す る Km が 野 生 型 に 比 べ 高 く な っ て お り 、Vm ax は TTP を 除 く 基 質 に お い て 速 く な っ て い た 。

ま た LM V 耐 性 と L1 8 0 M に 重 要 な 変 異 で あ る M 204 V 変 異 体 を 作 製 し た 。M 2 0 4 V は TTP、dGTP お よ び dC TP に 対 す る Km 値 が 野 生 型 に 比 べ 高 く な っ て お り 、Vm ax は dAT P、TTP お よ び dC TP に お い て 速 く な っ て い た 。ま た L180M の RT 伸 長 活 性 は 分 析 す る に は 不 十 分 で あ っ た (デ ー タ 未 記 載)。

第 四 節 考 察

ウ イ ル ス ポ リ メ ラ ー ゼ を タ ー ゲ ッ ト と す る NRTI は 、HB V だ け で な く HC V (46)、H IV (47)、 お よ び ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス な ど で も 使 用 さ れ る 重 要 な 薬 剤 で あ る (48)が 、NRT I 治 療 に は 薬 剤 耐 性 出 現 の リ ス ク が あ る (48,4 9)。 H IV RT で は 生 化 学 的 な 薬 剤 耐 性 の 解 析 (45,50 -5 5 ) や 構 造 的 (鋳 型 (38 )、鋳 型 と 基 質 (39)、NRT I (5 6)、お よ び 阻 害 剤 (57) と の 複 合 体) 解 析 の よ う に 、 様 々 な 研 究 が な さ れ て い る 。対 照 的 に HB V RT で は 、生 化 学 的 な 薬 剤 耐 性 の 解 析 (37,58,59) や 推 定 構 造 で の 解 析 (8,9,41) の 報 告 が あ る が 、HB V RT の 十 分 な タ ン パ ク 質 量 を 準 備 す る こ と が 困 難 で あ る た め 、 ほ と ん ど 研 究 が な さ れ て い な い 。 本 研 究 で は 、 鋳 型 R NA を 用 い た ETV/ L M V 耐 性 HB V RT30 4 -R Nas e H の 伸 長 活 性 に お け る カ イ ネ テ ィ ク ス パ ラ メ ー タ ー を 比 較 す る と と も に 、 伸 長 活 性 に お け る ETV と LM V の 阻 害 効 果 を 検 証 し た 。

ETVは 抗 H B V薬 の NRTIの 中 で 最 も 抗 ウ イ ル ス 活 性 の 高 い 薬 剤 で あ り 、そ の 阻 害 メ カ ニ ズ ム と し て ネ イ テ ィ ブ 基 質 と 競 合 し 、DNA 鎖 に 組 み 込 ま れ 、P ri m i ng 活 性 、RT 活 性 お よ び DNA 鋳 型 で の 伸 長 活 性 を 阻 害 す る (7,34 )。ま た H IV で の E TV の 効 果 は 、i n vi t ro 伸 長 ア ッ セ イ よ り“delayed chain termination”と し て 示 さ れ て い る も の の (45,53)、 細 胞 培 養 系 に お い て は 複 製 阻 害 効 果 が 極 め て 低 い こ と が 報 告 さ れ て い る (60)。 本 研 究 に お い て 、i n vi t ro 伸 長 ア ッ セ イ に お け る ETV-TP の 阻 害 効 果 を 検 証 し た と こ ろ 、HIV で は“delayed chain termination”で あ る こ と を 示 し た ( Fi g. 2 0 A 右) が 、HB V で は 、ETV の 構 造 に 3 ´ -OH を 有 す る に も 関 わ ら ず 、明 ら か な“chain termination”

と し て 効 果 を 示 し た (Fi g. 2 0 A 左)。 こ の 結 果 は 、ETV が HB V に 対 し て 特 異 的 に 高 い 阻 害 効 果 を 示 す こ と (60) を 強 く サ ポ ー ト し て い た 。 一 方 で L M V-T P の HB V に 対 す る 効 果 は 、 構 造 的 に も 3’-OH を

欠 い て い る た め に chai n t erm i nat or と 機 能 し て い た ( Fi g. 2 0 B )。 こ れ は 以 前 示 さ れ て い た 結 果 と 同 様 で あ っ た (61,62)。

ETV-T P に 対 す る 薬 剤 感 受 性 は 、 L180 M / M 204V と

L180M/ M 204V/ M 250V に お い て 低 下 し て お り ( Fi g. 1 8 B )、 こ の ２ つ の 変 異 体 は 野 生 型 に 比 べ て 、d GTP に 対 す る 親 和 性 が 増 加 し て い た (Tabl e. 1 )。 同 様 に HepG 2 細 胞 よ り 発 現 し た HB V ポ リ メ ラ ー ゼ を 用 い た i n vi t ro ポ リ メ ラ ー ゼ ア ッ セ イ に お い て も (9)、d GTP に 対 す る 親 和 性 が 野 生 型 よ り も ETV 耐 性 変 異 体 で 増 加 し て お り 、 親 和 性 が L180M/ M 204V で は 野 生 型 に 比 べ 1 . 4 倍 、L180M / M 204V/ M 250V で は 2 .2 倍 高 く な っ て い た 。 ま た 細 胞 培 養 系 に お い て 野 生 型 と 変 異 体 の 薬 剤 耐 性 を 比 較 す る と 、L180M / M 2 0 4 で は 野 生 型 よ り 115 倍 [本 実 験 と 同 じ ク ロ ー ン (42)] も し く は 1 0 倍 ( 9)、L180M / S 20 2I/ M 204 V で は 40 2 倍 (9)、L 180M / M 204V/ M250V で は 1 02 8 倍 (9)、ETV 耐 性 の 上 昇 が 報 告 さ れ て い る 。本 実 験 の 伸 長 活 性 に お け る ET V 耐 性 の 結 果 で は 、L180M / M 204V / M 250V で は ETV 耐 性 が 向 上 し て い た が L180M/ S 2 0 I/ M 204 V で の ETV 耐 性 の 向 上 は 見 ら れ な か っ た 。こ の こ と か ら S 202I の 追 加 変 異 は 、伸 長 活 性 に お け る ETV 耐 性 上 昇 に は 無 関 係 で あ り 、p ri m i ng 活 性 の 阻 害 効 果 が 大 き い こ と が 示 唆 さ れ た 。一 方 で LM V-TP ( Fi g . 1 9 B ) の 阻 害 は ETV-TP ( Fi g. 1 8 B ) よ り も 低 く 、こ れ は 細 胞 培 養 系 で の 結 果 と 一 致 し て い た (37,41,60)。LT V-TP の 低 い 阻 害 効 果 は 、dC TP に 対 す る 野 生 型 お よ び 変 異 体 の 親 和 性 が 高 い た め に ( Ta b l e . 1 )、LT V- T P の 取 り 込 み が 難 し い 可 能 性 が 考 え ら れ た 。

ETV と LM V 耐 性 変 異 体 に お け る 培 養 系 で の 複 製 効 率 は 、 触 媒 モ チ ー フ で あ る YM DD の 変 異 体 M20 4V で は 野 生 型 と 比 べ て 低 い が [0 . 8% (63 )、1 0 % ( 64)]、L180 M 変 異 が 追 加 さ れ た L180 M / M 204V 変 異 体 [3 . 9 % (63 )、6 8 % (64)] で は YM D D 変 異 に よ る 複 製 活 性 低 下 を 回 復 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 本 実 験 で の 伸 長 活 性 測 定 で も 、 こ の 細 胞 培 養 系 で の 結 果 と 同 様 に 、L 180M が 伸 長 活 性 を 補 う 結 果 が

見 ら れ た（Fi g. 1 8、Tabl e. 1）。さ ら に Ta bl e. 1に お い て 、L18 0M / M 204V は 野 生 型 よ り も 、 反 応 速 度 と 親 和 性 が 全 て の 基 質 で 上 昇 し て い た 。 し か し な が ら 、本 実 験 で L1 8 0 M の 単 独 変 異 は 野 生 型 に 比 べ る と 活 性 の 低 下 が 示 唆 さ れ て い る (デ ー タ 未 記 載)。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 L180M 単 独 で は 伸 長 活 性 を 上 昇 さ せ る 効 果 が な く 、M 20 4V に L1 8 0 M の 変 異 が 加 わ る こ と で 伸 長 活 性 が 野 生 型 よ り も 高 い 能 力 を 持 つ 酵 素 に 変 化 す る こ と が 示 さ れ た 。 ま た L1 80M / M 204V の 伸 長 活 性 が 野 生 型 よ り 上 昇 す る 結 果 は 、 細 胞 培 養 系 と は 異 な っ て い た が 、 こ れ は 培 養 系 で は p ri m i ng 活 性 も 含 ん だ 結 果 と し て 複 製 活 性 を 示 す た め と 考 え ら れ た 。同 様 に V 1 7 3 L 変 異 の 追 加 は 細 胞 培 養 系 に お い て さ ら に 複 製 効 率 を 高 め る こ と が 報 告 さ れ て お り (42,65 )、 野 生 型 へ の 変 異 追 加 で 複 製 効 率 が 37 % 上 昇 、L 180M / M 204V へ の 変 異 追 加 で 4 8% 上 昇 が み ら れ る (65 )。V1 7 3 は 鋳 型 と の 結 合 に 重 要 な ド メ イ ン B に 位 置 し て お り ( Fi g. 1 6A、1 7 )、V173 L 変 異 は 酵 素 活 性 中 心 に 有 益 で あ る と 構 造 的 に 推 測 さ れ て い る (65 )。 し か し な が ら 本 実 験 に お け る V173L/ L180M / M 204 V で は 、野 生 型 と L180M / M 204V よ り も 低 い 速 度 と 親 和 性 を 示 し (Tabl e. 1 )、特 に dG TP に お い て そ れ ら の 低 下 は 顕 著 で あ っ た 。 こ れ ま で の HB V に 関 す る 構 造 的 な 報 告 は 、 構 造 既 知 で あ る H IV を 鋳 型 に 利 用 し た 推 定 構 造 を 用 い て い る が 、HB V と HIV の 相 同 性 は わ ず か 2 5% 以 下 で あ る (8 )。こ の 問 題 と 本 実 験 で の 結 果 よ り 、伸 長 活 性 に お け る V1 73 L の 役 割 は 、以 前 の 報 告 と は 異 な る メ カ ニ ズ ム で あ る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 今 後 、 本 実 験 結 果 の さ ら な る 議 論 に は 、 推 定 構 造 で は な い 鋳 型 と の 複 合 体 構 造 の 解 析 が 求 め ら れ る 。

本 実 験 に お け る 野 生 型 で の 親 和 性 は 、dATP (Km = 19. 45 μ M ) お よ び TTP (Km = 17.20 μ M ) に お い て 低 く 示 し た 。 こ の 結 果 よ り 、d ATP ア ナ ロ グ で あ る 既 存 薬 剤 の テ ノ フ ォ ビ ル や ア デ フ ォ ビ ル が 効 果 的 で あ る 可 能 性 が あ り 、 ま た dATP ア ナ ロ グ を タ ー ゲ ッ ト に し た 新 規 薬

剤 の 開 発 が 抗 HB V 治 療 に お い て 有 効 で あ る 可 能 性 も 示 唆 さ れ た 。 以 上 の 本 研 究 の 結 果 は 、 こ れ ま で 全 く 未 知 で あ っ た H B V ポ リ メ ラ ー ゼ の 伸 長 活 性 に お け る 薬 剤 耐 性 の 生 化 学 的 解 析 を 行 う と と も に 、 そ の 伸 長 活 性 阻 害 を タ ー ゲ ッ ト に し た 新 た な 薬 剤 開 発 に も 可 能 性 を 見 出 し た 。

結 語

本 研 究 で は HB V ポ リ メ ラ ー ゼ の DN A 伸 長 活 性 を 用 い た ス ク リ ー ニ ン グ 系 を 開 発 し 、 こ れ を 用 い て H B V 複 製 を 阻 害 す る 新 規 非 核 酸 系 阻 害 化 合 物 を 同 定 し た 。 ま た i n vi t ro で ETV 耐 性 株 由 来 ポ リ メ ラ ー ゼ の 酵 素 活 性 の 特 徴 づ け を 行 っ た (Fi g. 23)。 こ れ ら は い ず れ も 、 DNA 伸 長 活 性 を 保 持 し た ポ リ メ ラ ー ゼ タ ン パ ク 質 の 利 点 を 利 用 し た 研 究 成 果 で あ る 。 こ れ ら の 結 果 よ り 、 今 後 新 た な ラ イ ブ ラ リ ー を 用 い た 新 規 非 核 酸 系 化 合 物 の さ ら な る 探 索 や P DM 2 を リ ー ド と し た 誘 導 体 展 開 に よ る 化 合 物 の 最 適 化 、 基 質 親 和 性 が 低 い d ATP と TTP に 着 目 し た 新 規 核 酸 ア ナ ロ グ の 開 発 な ど に 展 開 で き る と 期 待 さ れ る 。 以 上 の よ う に 、本 研 究 で 明 ら か に し た HB V ポ リ メ ラ ー ゼ DNA 伸 長 活 性 の 知 見 は ポ リ メ ラ ー ゼ 酵 素 の 理 解 だ け で な く 新 た な 抗 ウ イ ル ス 薬 開 発 に も 資 す る も の で あ る 。

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