超好熱性アーキアのDNA損傷ストレス下におけるゲ ノム維持・修復機構の解明
著者 櫛田 卓志
学位授与大学 東洋大学
取得学位 博士
学位の分野 生命科学
報告番号 32663甲第459号 学位授与年月日 2019‑09‑25
URL http://id.nii.ac.jp/1060/00011257/
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超好熱性アーキアの DNA 損傷ストレス下における ゲノム維持・修復機構の解明
学籍番号 4910131001 氏名 櫛田 卓志
【緒言】
超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisには、Family B型とD型のDNAポリメラーゼ がそれぞれ1つずつ見出されている（PolB, PolD）。これらは校正機能（3′→5′エキソヌクレアーゼ 活性）をもつため（Gueguen et al., 2001; Killelea et al., 2014）、誤った塩基が新生DNA鎖に取 り込まれても除去され、正しい塩基配列を持ったコピーが合成される。更に、鋳型鎖や基質となる デオキシリボヌクレオチドの損傷（塩基修飾など）を認識し、合成反応を停止させることができる ため（Gill et al., 2007; Palud et al., 2008; Richardson et al., 2013）、新生DNA鎖への変異導入を 抑制できる。以上の特徴から、両者は複製型ポリメラーゼであると考えられてきた。PolBは、PolD よりもDNA合成速度が速く、RNAプライマーからのDNA合成活性が低いことから、PolBはリ ーディング鎖の合成を担い、PolD はラギング鎖を合成していると推測されてきた。Čuboňová ら は、T. kodakarensisのpolBを破壊できることを報告した（Čuboňová et al., 2013）。報告された polB 破壊株は、至適生育温度（85℃）で親株と同様に生育した。紫外線に対しては感受性となっ たが、メチルメタンスルホン酸やマイトマイシンCといったアルキル化剤に対しては感受性を示さ なかった。本研究では、T. kodakarensisにおいて、polB遺伝子完全破壊株（ΔpolB株）を作出し た。更に、polB遺伝子相補実験を行うことで、ΔpolB株のDAD 損傷ストレスに対する感受性が、
polB遺伝子の破壊によることを証明した。
【実験・結果】
i. ΔpolB株の作出
T. kodakarensisでは相同組換え機構を利用した遺伝子破壊法が確立されている。この方法によ
り、T. kodakarensis DAD株を親株として作出した株について、PCR解析とサザンブロット解析 を行い、染色体DNA上からのpolB遺伝子の破壊を確認した。
ii. polB遺伝子相補実験
ΔpolB株の親株であるDAD株は、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子（pdaD）の欠損株であり、アグ
マチン栄養要求性を示す。Escherichia coli − T. kodakarensis シャトルベクターpTKG02 は、
pTK02の誘導体であり（Nagaoka et al., 2013）、pdaDを含んでいる。T. kodakarensis由来グル タミン酸脱水素酵素遺伝子（Tko-gdh）は、その細胞内で強力かつ構成的に発現している（Rahman et al., 1998）。ΔpolB株で遺伝子相補実験を行うため、pTKG02を元に、Tko-gdhのプロモーター を利用した、PolB発現プラスミドを構築した。これをΔpolB株に導入した、ΔpolB/pTKG-polB株 を取得した。pTKG02 を DAD 株と ΔpolB 株に導入した株をそれぞれ DAD/pTKG02 株と ΔpolB/pTKG02 株とした。ウェスタンブロット解析を行った結果、ΔpolB 株、ΔpolB/pTKG02 株 ではPolBの発現が認められず、DAD株、DAD/pTKG02株、ΔpolB/pTKG-polB株では、PolBの 発現が認められた。ΔpolB/pTKG-polB株のPolB発現量はDAD株とDAD/pTKG02株のそれを顕 著に上回っていた。
iii. ΔpolB株の変異原に対する感受性
T. kodakarensisには、Base excision repair（BER）（塩基除去修復）、Alternative excision repair
（AER）、Nucleotide excision repair（NER）（ヌクレオチド除去修復）、Mismatch repair（MMR）
（ミスマッチ修復）、Homologous recombination repair（HR）（相同組換え修復）に関与する酵素 遺伝子が存在し、それらが機能してゲノムを維持していると考えられる。これらのDNA修復機構 の過程には、DNAポリメラーゼによる修復合成が必要である。そこでΔpolB株について、紫外線
（UV-C）、電離放射線（γ線）、メチルメタンスルホン酸（MMS）、マイトマイシンC（MMC）と いった変異原に対する感受性を解析した。MMSは、主にグアニンとアデニンを修飾し、メチル化 塩基を生じさせる。N7-メチルグアニンとN3-メチルアデニンは、MMSにより生じるメチル化塩基
の90％以上を占めている（Beranek, 1990）。MMSによる損傷は、BERまたはNERにより修復
されると考えられる（White et al., 2018）。MMCは、化学的または酵素的に活性化されると、グ アニンに結合し修飾する。更に、2つのグアニン間で架橋を形成させる。同一鎖上でグアニンが隣 接していると鎖内架橋が生じる。5′-CpG-3′配列が存在すると3′側のグアニンと5′側のシトシンに対 合しているグアニンとの間に鎖間架橋が生じる（Tomasz, 1995）。MMCによる修飾塩基と鎖内架 橋はNERにより、鎖間架橋はHRにより修復されると考えられる（White et al., 2018）。UV-Cに より生じる主要なDNA損傷は、同一鎖上で隣接した2つのピリミジン塩基において形成される二 量体（シクロブタン型ピリミジンダイマー（CPD）や(6-4)光産物（(6-4)PP））である。これらの二 量体は、NERにより修復されると考えられる（Sinha et al., 2002; Rastogi et al., 2010）。γ線は、
DNAの二本鎖切断（DSBs）を引き起こす（Daly, 2012）。DSBsは、HRにより修復されると考え られる（White et al., 2018）。変異原に暴露した後の生育頻度をDrop Dilution Assayにより評価 した。その結果、DAD株に比してΔpolB株の生育頻度は低下した。ΔpolB株は、試行した全ての
変 異 原 に 対 し 感 受 性 と な る こ と が 確 認 で き た 。ΔpolB/pTKG-polB 株 の 変 異 原 感 受 性 は 、
DAD/pTKG02株と同程度に回復した。
iv. ΔpolB株の熱ショックに対する感受性
紫外線、電離放射線、種々の化学物質の他に、「熱」によってもDNA損傷は誘発される（Suzuki et al., 1994; Marguet et al., 1998）。高温環境下においてDNAは不安定化し、脱塩基部位（APサ イト）の形成に伴う一本鎖切断（SSBs）や二本鎖切断（DSBs）が促進される。常温環境下でも DNA 鎖は分解され断片化するが、分解速度が非常に遅いため、常温菌細胞内では分解の初期段階 で修復される。一方、高温環境下では分解速度が非常に速く、DNA 鎖は速やかに断片化する
（Kampmann et al., 2004）。塩基の脱アミノ化も「熱」よって促進される（Connolly, 2009）。「熱」
により導入された、DNA損傷を修復するためには、DNAポリメラーゼによる合成が必須であると 考えられる。そこで、ΔpolB 株の熱ショックに対する感受性を解析した。その結果、ΔpolB 株は、
熱ショック対し感受性となることが確認できた。ΔpolB/pTKG-polB 株の熱ショックに対する感受 性は、DAD/pTKG02株と同レベルに回復した。
v. ΔpolB株染色体DNAのゲル電気泳動解析
熱ショックを与えた菌体から染色体DNAを抽出し、損傷の程度を解析した。損傷（二本鎖切断:
DSBs）を受けた染色体 DNA を、アガロースゲル電気泳動（弱アルカリ性条件）に供するとスメ
アバンドとして観察される。アルカリアガロースゲル電気泳動（強アルカリ性条件）では、二本鎖 DNAが融解し一本鎖 DNAへと変性するため、片方の鎖にニック（一本鎖切断: SSBs）が生じて いるだけでスメアバンドとなる。DAD株とΔpolB/pTKG-polB株の染色体DNAを弱または強アル カリ性条件下で電気泳動したところ、熱ショックの有無に関わらず、それぞれ単一バンドとして検 出された。熱ショックを与えなかったΔpolB株の染色体DNAも、DAD 株と同様、熱による分解 は観察されなかった。一方、熱ショックを与えたΔpolB株の染色体DNAを弱アルカリ性条件下で 電気泳動に供すると、熱ショックを与えた時間の増加に伴って、スメアバンドの増大が観察された。
更に、強アルカリ性条件下においては、単一バンドが観察されずスメアバンドとして検出された。
vi. ΔpolB株の増殖特性
ASW-YT-S0 液体培地により、DAD 株、ΔpolB 株、DAD/pTKG02 株、ΔpolB/pTKG02 株、
ΔpolB/pTKG-polB株を 85℃、93℃で培養し、増殖曲線を解析した。その結果、DAD 株とΔpolB 株 の 増 殖 に 顕 著 な 相 違 は 認 め ら れ な か っ た 。 更 に 、DAD/pTKG02 株 、ΔpolB/pTKG02 株 、 ΔpolB/pTKG-polB株の間でも増殖に顕著な相違は認められなかった。
【考察】
T. kodakarensis DAD株を親株とし、polB遺伝子破壊株（ΔpolB株）を作出した。更に、pTKG02 由来のプラスミドを用いた遺伝子相補株（ΔpolB/pTKG-polB 株）を取得した。ウェスタン解析の 結果、DAD株とDAD/pTKG02株のPolB発現量は、同程度であったが、ΔpolB/pTKG-polB株の PolB 発現量は、それらの株を顕著に上回っていた。85℃、93℃培養では、DAD 株と ΔpolB株の 増殖特性に顕著な相違は認められなかった。これらのことから、PolB の欠失や過剰発現は、細胞 の生育に影響しないことが明らかとなり、PolB は、DNA 複製に必須ではないと考察できた。T.
kodakarensisでは、PolDをコードする遺伝子は破壊できないことが報告されている（Čuboňová et al., 2013）。細胞内でPolDは、複製起点認識タンパク質（Orc1/Cdc6）やDNA複製ヘリカーゼ（MCM, GINS）と複合体を形成していることが報告されている（Li, et al., 2010）。これらのことから、細 胞内でPolDは、DNA複製に重要な役割を果たすと考えられた。
Čuboňováraらが報告したpolB破壊株は、UV-Cに対しては感受性となったが、MMSやMMC といったアルキル化剤に対しては感受性を示さなかった。本研究で作出したΔpolB株は、試験した 全ての変異原（UV-C、γ 線、MMS、MMC、熱ショック）に対し高い感受性を示した。この表現 型が、polBの破壊によるものであることを証明するため、E. coli − T. kodakarensisシャトルベク ターpTKG02を用いてpolB遺伝子を相補した、ΔpolB/pTKG-polB株を取得した。この相補株の変 異原感受性は、DAD/pTKG02株と同程度に回復した。これらの結果から、ΔpolB株の示す、紫外 線（UV-C）、電離放射線（γ線）、アルキル化剤（MMSとMMC）、熱ショックに対する感受性は、
polB遺伝子の破壊によることが証明できた。PolBは、BER、AER、NER、HRといったDNA修 復機構に関与することが強く示唆された。これらのことから、細胞内でPolBは、DNA修復に重要 な役割を果たすと考察した。
【参考文献】
Beranek, D. T. (1990). Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 231(1), 11−30.
Connolly, B. A. (2009). Biochem. Soc. Trans., 37, 65−68.
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Gill, S. et al., (2007). Journal of Molecular Biology, 372(4), 855−863.
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Killelea, T. et al., (2014). Frontiers in Microbiology, 5, 195.
Li, Z. et al., (2010). mBio, 1(5), e00221-10.
Marguet, E. et al., (1998). Extremophiles, 2(2), 115−122.
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Palud, A. et al., (2008). Molecular Microbiology, 70(3), 746−761.
Rahman, R. et al., (1998). Molecular and General Genetics MGG, 257(3), 338−347.
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Sinha, R. P. et al., (2002). Photochemical & Photobiological Sciences, 1(4), 225−236.
Suzuki, T. et al., (1994). Nucleic Acids Research, 22(23), 4997−5003.
Tomasz, M. (1995). Chemistry & Biology, 2(9), 575−579.
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