及ぼすアルギニン濃度の影響  

静づ乳 升￡cゐ0叩OrOJもⅩ−柑薗，餞体外蛋白質生産に及ぼすアルギエン磯度の影響   57  

酵母，升￡cゐ0岬OrO㌢！Ⅹ−19薗，菌体外賓自質生産に  

及ぼすアルギニン濃度の影響  

山田 哲也，西田 淑男栴，久松  眞，赤木 盛郎＊＊  

（三東大学歴学部，農芸化学軋■倉敷紡績株式会社（現在），＝鈴鹿短期大学（現在））  

緒  言   

微生物によるま自質生産は高等動植物のそれと輿なり   エ楽約手段で行なえることから，積極的に研究が進めら   れている。菌体外蛋白質はその分離，粕製が容易であり   蘭体内蛋白質よりも利点が多いと考えられることから，  

既に譲造愈品などに利用され親近感のある酵母による常  

体外ま自質生産に関する検討を進め酵母（ブナ言c九0叩OrO托   Sp．X−19株）による菌体外蔑自蟹生産に関する報告を   行なってきたま〜7〉。今鳳はアルギニン激魔の蛋白質生産   への影響及びその時の常体の形態変化について検討した。  

実 験 方 法  

1．アルギニン濃度が蛋白質生産に及ぼす影響  

1）培地組成   

菌体外蔑白質の培地としては，TablelのCzapek−  

Dox改良培地を基本培地とした。グリシン（0．3％）を   アルギニンに代え，その放資を0．1％，0．211％（グリシ   ン0．3％に相当），0．5％，1％，3％，5％とした。培   地は1NHClで初発pH 5に凋生した。  

Tablel Czapeck−Dox Modiried Medium  

転振遜機（160rpm）で前培養後，その0．2mゼを100mゼ容   三角フラスコ申のCzapek−Dox改良培地25mgに接穫  

し．30℃，48時間同叫振慮条件で培養した。   

3）蛋白質の抽出と定数   

増凝終了後堵遥液を濾過（発揮液紙No．2）して薗体と   培養液液に分離し，菌体は0．05NNaOH25mgを加え   撹搾後，同一条件で濾過を行ないアルカリ洗浄液巷得た。  

これと培養液液にそれぞれトリタロル酢鞍（でCA）を   終漁度7％になるように加え，生じた沈澱を遼心分離で   奨めてさらに5％TCAで洗浄した後，この沈毅を0．1  

NNaOH25mβに溶解し，Itzhaki＆Gillのミクロピュ   ーレット法8〉で蟹白質の定虚を行なった。  

2．アルギニン濃度変化時の菌体の走査型電子顕微鏡観    察   

アルギニン磯度を0．1％，0．211％，0．5％，1％，3  

％，5％にしたCzapek−Dox改良培地で1，2）と同様に   培養し，濾過により集めた蘭体を純水で3回洗浄し，下   記に従って固定棟作を行い観察した。   

り 5％グルタルアルデヒドに0義2％（W／V）となる    ようにタンニン駿を加え，室温で約6時間処理した。   

2）5％グルタルアルデヒドに2％（W／V）となる    ようにタンニン駿を加え，室温で6時間〜15時間処    理した。   

3）1時間水洗した。   

4）1％OsO。水溶液ゆで3時間〜15時間処理した。   

5）1時間水洗した。   

6）エタノール脱水（30％，50％，70％，90％，95％）   

を各20分間行なった。   

7）100％エタノール申で3匝憾・30分間脱水処理した。   

8）酢敢イソアミル処理として，エタノール：酢酸イ   

ソアミルニ1：1の溶液中で3回各10カ・間処理した    後，酢酸イソアミルゅで3匝‡各10分間処理した。   

Glycine   K2fiPO4   MgSO4 7Ⅰヰ20   EiCl 

FeSO4   Glucose  

Water（dまstilled）   

3．00g   l．00g   O．50g   O．50g    O，01g    30．O g   lOOO ml   adjusted to pH3．O with】N HCI  

2）培餐姦件   

新鮮な斜面培地から−白金罫をとり100mゼ容三角フラ  

スコ申のYM培地1）25mβに接種し，30やC，24時間，回  

山i羽 哲也・西闇 淑男。久松  厳・赤木 盛郎    5B  

聞放置し浸透させた。切片をゼラチンカプセルに入れ樹   脂混合液を流し込んで1晩室温で放置徽 450cで12時間，  

次いで24時間熟麓合させた。  

Table 2 Composiもion of恥0Ⅹy Resin   9）臨界点乾燥後，金の厚さが200Åになるように金蒸   

督を行ない試料した。   

観察はH汀ACH‡HHR−2Ⅹを使用し，加速閻圧15   KVで行なった。  

3．アルギニン濃度変化時の菌体の透過型電子顕微鏡観    察  

1，2）と同様に培養，処理した菌体を下雷己に従って固私   包哩，および塩静切片作成操作を行ない観察した。   

閲定操作   

機体を2％発寒天上になすりつけ，その上に固まる敵   前温度の2％発寒天を流し，菌体を寒天のサンドイッチ   とした。この切片を1％KMnO。水溶液で1時間処理後，  

‖相聞水洗した。次に1％OsO4水溶液で3時間処理し   た。1時間水洗後，エタノール脱水処理として30％，50  

％，70％，90％と順次張舷を上げて各10分間処理後，  

100％エタ／−ル申で3回各10分間処理して完全脱水し   た。   

2）包埋操作   

脱水後，切片をプロピレンオキサイドで3回各10分間   処理した。切片をでable2に示したエポキシ樹脂混合   液とプロピレンオキサイドの等盛混合液申で擦絆後，密   栓して12時間室温で放置した。プロピレンオキサイド樹   脂混合液を翰てた後，樹脂混合液のみを入れ室温で12時  

Epon812（Queも01812）   7伽1  

DDSA（DodecenylSuccinic Anhydride） 6伽i   MNA（MethylNadまc Anhydride）   5伽I  

DMp−30（TパーDi汀1etllylAminonュethylphenoり  

0．25ml   

3）超薄切骨作成   

ミクロトームを使用し，ガラスナイフで切片の厚みが   500Å以下になるように超薄切片を作成した。（180Åメッ  

シュのグリッドを使用した。）   

電子揖微鏡観察はH汀ACfiIH−700Ilを使用し，加   速電圧100KV，フィラメント電流15〃Aで行なった。  

結  果  

1．アルギニン漉度が螢白質生産に及ぼす影響   

アルギエン濃度を変化させ培養した結果をyig．1に   示した。その結果アルギニン敷皮が0．211％〜0．5％で蛋  

白質生産が厳大となり，それ以上になると虚自質生産が   低下した。  

hO革3忠盛﹇︺  

√こ＝r：︑い−二亡和也  

︵ ∵・号⁚こー⁝T・ごM︑⁝．︷‖﹂1ニ一三・二⁚い帯払  

0  

0  

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′0  5  4  3 2  

胃乱 丁市長両払 可   0  ∩︶  

已mM︑ひ鋼こ  

ぷ刃きOhuO  

0．1  0．211  0．5  1．0   3．0   5．0   År9（宅）  

Fig．1ユ王rrecもOr argl王1ine on protein productぬn by the yeast   

楢葉L 二け吏・／〜（）ぶ〃（げ07‡X〃1鋸軋て繭捗外震自質技塵に及ぼすアルギニン濃度の影響   59  

門10し（）．2．Sl川く汀C測（γパc′！（）β〃f）デ（川SP．X腑柑）  

AFg；rli！le O．21t％（X250（））  

1）ilけぃ｝．仁 Sト：1l（−i■C測（7 ／−〜ぐ／！り叩川・r沼叩．Xml如   か明証Il（さ 0，t5％（X25（〉（り  

Ⅰ）llOtO．4．S服M oI■Cel蔓（7 ノーgぐん（叩0用托叩．X洲】9）  

如・かinel月％（X250（））  

】）llOLo，3．S卜：1lol Cd‡（7I／・k／…埠…門川」†）．Xm′㌦19）  

Arか1iIle O．5％（Y25（附）  

門10tO．6，SIミ〜lof CeI箋（7 rfご力0叩OrOJ？叩．X仙柑）  

Al・か1i！1e 5，0％（Ⅹ2500）   

mlOt（）．5．Sト：汽ノlof Cel‡（7ン・k／…埠）（刑柁叩．X血相）  

心頭油1日 3．0％（X25（）け）  

60   山川 哲也・西田 淑男・久松  展・赤木 盛郎  

王）‡10tO．7．′】11抽】or Cel‡（71・言c九f）叩OJて）柁叩．X…柑）  

八rginin￠ 0，15％（X2＝）（）0）  

M−OtO．8．′Ⅰ 】一；入・lor C（州（7 〟di呵州て）れ叩．X血19）  

山ど；ni110 0．2＝％（X21000）  

】】hot（｝．10． 1 巨：N′】orじ測（7）、〜ぐ／王0坤0用JよS‡）．X【−Ⅰ9）  

∧rかIi11む ユ．0％（XlOOOO）  

I）hoto．9．′用Ⅳloi、CぐIl（γバd？（坤（げり作叩．X肋19）  

直感ninむ 0．5％（X柑（）00）  

門l（〉Lo．12．rl ！，ニト！oiゝcc‡＝↑／・J血叩）OJ・0′l叩，X血19）  

如か1inc 5．0％（XlOOOO）   

J）hoし0，11．rrにM ol■CeIl（7 rgc力p叩OJ−0托叩．X仙19）  

Arginirle 乱0％（X1500（））  

静母，ブナ￡ぐん0叩OrOJlX−19薗，菌体外記自質生産に及ぼすアルギエン濃度の影響   61   

れる付潜物の厳に大喪な差が見られたが．細胞切断面で   の細胞壁部分の厚みは変化が見られなかった。しかし，  

写桑で見られる如く，両者の紬封泡壁の濃淡にかなりの差   があることから密度が異なると考えられ，この差が菌体   外蛋白質によると考えると常体外蛋白質はヨ三として紬胞   壁申に蓄機されるものと推遷された。この肇慕は蘭体外頚   自署生産時の培茶筒体のアニリンブルー染色他紙験の結   果からも支持された。アルカリ洗浄により菌体外蛋白質   を抽出後の細胞壁はアニリンブルー染色性を管しく減じ   ており本曇自照が署色陵の良いことと考え併せると本義   自照の細胞壁内蓄積を示唆するものである。   

鵜商らは，撃・桐蛋白質生産性の高いグラム陽性餞の研   究を発展させた過程で，細胞壁構造とま自照分泌の関係   を追究し，蛋白質生産のメカニズムを明らかにしている。  

さらに異様避伝子導入による蛋白質生産の宿主として，  

この蛋白質生産常を用い成功している。この点から本酵   母の遵伝手工尊への利用が期待されるが，本隊母の場倉   菌体外蛋白質生産時にはかなりの頻度で原形質分離が観   察されることから細胞壁の変化以外に細胞膜，又細胞内   郡も変化していることが示唆されるが， アルギニン浪   度がある程度以上に上界するとこれが解消されると云う   結果から，前述のバクテリアの分泌機構とかなり異なる   メカニズムにより閣体外寵白質生産が制御されているも   のと考えられる。アルギエン濃度が，ある山麗の範囲で   のみ有効であり，高波庶で正常化する箪実は非常に興味   深く，植物ホルモン的生理作用と類似している。しかし，  

余りに濃度に凄いがあるので，いわゆる「トリガーH」で   はなく，本質的な代謝過程での変化が原掬していると考   えられる。  

文  献   1）M．AlくAKl，Y，NAKAS】ミKO and T．YAMAf）A：  

Agr￡c．月￡og．Cんemり 42，23E軋1978   2）赤木盛郎・中世苗寒信・lj」閏哲也：三盛大戯学級  

第58号，123（一1979）  

3）赤木盛郎・中世古率信・山田哲也：化学と生物，  

18（9），607，（1980）  

4）M．AKAKl，Y．NAlくASlミKO andl、．Yノ＼M郎）A：  

71／I（ナJ鉦／／t吊JI（ゾ血フJi rJ川圧＼・（ゾノIgバⅢ仙JJ・〔・．  

Åすよe UJl￡ぴ，，64，51，1982  

5）Y．FulモUIC川，1＼TA！くA＝AS川，′r．Y納】Al）A arId   M．A‡くA‡く王：〃以れ月琴）Or￡血￡erJt．，   

2．アルギニン濃度変化時の菌体の走査型電子顕微鏡   観察   

各種培養条件の観察結果をphoto．1〜6に示した。  

その結果アルギニン潰皮が0．5％までは分泌物と思われ   る付署物と細胞の変形度（輿常肥大細胞の出現率）は増   加していたが，これ以上にアルギエン濃度が増加すると   分泌物と思われる付着物や細胞の変形度がかえって減少  

していくことが観察され，蘭体外蛋白質生産結果と・血致   した結果となった。   

3．アルギニン濃度変化時の菌体の透過型電子顕微鏡   観察   

各種培登条件の酵母の観察結果をphoto．7〜i2に   示した。菌体の切断部位により間…蘭体でもかなりの差   が生ずるので本報告に採用した切片写斑はで垂るだけ中   央部位での切片とした。総括的に去ってアルギニン濃度   が0．211％，0．5％で堵饗したものは継胞部分の像が淡い  

ことから密である，と推定され，低濃度および高濃度で   は淡いことよりより租である，と推定された。又0．211  

％と0．5％での培養菌体に原形質分離をおこしている細   胞の率が高かった。但し，Photo 9に示した0．5％培養   菌体切片は原形質分離は観察されなかったものである。  

中東部に於ける切片はphoto 7〜12に示した様に細胞   壁の厚みが殆ぼ同山であることを示している。  

考  察   

木簡母による蘭体外蛋白質生産がみられた培地の窒嚢   源申，アルギニンのみ初発pHが6でも生産が可能で   あること，初発pH2〜5の鶴間で生産性も殆んど変ら   ないことを既に報告しているが，このことは鵜高9）らの   バクテリアによる菌体外蛋白質生産においてグリシンや   イソロイシンが生産性に影響を与えること，又，時にグ   リシンがバクテリアの細胞壁の構造を変化させることの   報告と考え併せると，本酵母においてもアルギェン親政   の増大により酵母の細胞壁構造に何らかの変化を来たし．  

その結果として生産性が向上することが当初示唆された   ので，務実験を行なったのである。結果は予期したもの   と異なり，アルギエン1％以上ではむしろ生産性は減少   すること，又，柵胞の形状も正常化すること，そしてア   ルギニンの増加に伴ない法曹度も督しく増加することが   認められた。   

更に，電子据緻鏡により，菌体外蛋白質生産時と非生  

産時とでは，菌体の変形波や菌体外蛋白質の山部と患わ  

山田 哲也・西田 淑男・久松  廃・赤木 盛郎   62  

31（2），329，1985  

6）赤木盛郎・西拇淑男・久松厳・山田哲也：三意大   腰学級 第7i考，97（1985）  

7）西‡君淑男，山田哲也，久松 輿，赤木盛郎：三盛   大戯学部学術報告 73号 75（1986）  

8）況．F．IrllZl】ノ＼lく‡andO．M＼GlIふ：A托α〜．戌ocんem．，  

9，401（ま964）  

9）S．MIYASl】！呈I10，H，RNlミl，Y．HliiOSEandS．U】〕八一   

1くA：Agr王c．戯og．Cぁだm．，44，105（1980）  

10）S．Ur）A】くA：Agr￡c．戯og．仇gm．i40，523（1976）  

11）S．MIYASⅢ‡モ0，H．EN軋Ⅹ．TAiくIN納l㍉Y．Hl‡iO・  

封・：，T．Tsu（ニ川l）AandS．Ui〕AKA：AgrZc．戯og．  

Cん酎釣．，44，2297（1980）  

12）H．YA九1Al）A，N．TsuIくAGOSiw‡iand S．U‡）AKA：   

J．月αC紬7†王og．，148，322（1981）  

13）A，TsulうOi，N．でSUKAGOS川andS．UDAKA：  

よガαC紬㍗￡og‥柑1，1485（柑82）  

14）H．0‖kilZU，T．SASA主く1，N．TsuKAG〔）S川，S∴U】〕八一   KA，N．KANlミ1）A and K．YA（】l：Jβ￡oc九em．，  

94，1077（1983）  

15）N．でSUlくAGOS用，H．ⅢARA，H．YAMA（ユA′l、A and   S．Ul〕AKA：Aオog．Gだ乃．G♂花だま．，193，58（1984）  

柑）w．rrAKAliASl叫H．YAMAGA−】、A，K．YAMA〔；tプCトil，  

N．TSUKAGOS川and S．Ur）AKA：よ月αC紬㍗よog．，   

156，1130（1983）  

17）T．TSUKA（〕OS【il，R．TAlきA′l≠7．でAKE軋…lモA，  

H．YAMA（jA′IIA and S．U】〕A‡くA：よ月αe紬「￡og．，   

158，1054（1984）  

EffectofArginine Concenもratio王10n ExもraCellularProteinProducもion   byYeasも，7 r￡cんosporo71Ⅹ仙19  

でeもSuyaYAMADA，Yoshio NIS王iIDA＊，Makoto H王SAMAでSIJ   and Morio AKAKI＊＊  

（DeparもmentoぎAgriculturalChemistry，MieUniversity，  

＊KurashikiSpinningMill，＊幾SuzukaJuniorCollege）  

Summary  

We repoiゃも￠din the previous paperもhat t王Ie yeaSt，ブナ￡cゐ0叩OrO氾Ⅹ洲19，prOduced extra cellular  

protein（ECP）whenitwascultul・edin an acidic onvironmenも．However，adoption orarg▼inine as乱   nitrog・enSOurCerOrthemediummadeitpossiblefortheyeasttoprodueeECPev￠nもboughinaneutral  

erlVirorlmenも．   

Havi11g prOVenもhaもhigh conc￠ntration glycine modified and eollapsed bacterialmembranes，We   discussed痛eeffectoぎarg・ユnilleCOr王eentra損）n On the ECP producもiomandcellmembraneconstrtlCtion  

Ofもbeyeasも．Tosummarize■Ourrindings：a‡・glnlneaCteddifrer倶1tlyrromg・1yeln￠，thatis，anarglnirまe   COnCenもra貢0110用．2慎 h・▲0．5％gavelnaXimumI雲Cpproduction，howeverinthehig・hconcentr乱tjonmedium  

OnlypoorECPproductionwasobserved．Observatiぐ〉nOfthoyeastcel】s underan eiectron microscope  

（SRMandり ￡M）alsorevealedapparenもabTlOrmaliti￠S，SuCba＄prOtOplasmolysis，inthecellscl山ure（i  

in旺em￠diumcontainingO．2仙0．5％arglrline，Incontrast，hardユyany abl−Ormalities were observedin  

thece11sculturedinth￠mediumcontainingunderO．1％oroverl％aI・ginin￠．