IRUCAA@TDC : №９：EpCAM 陽性エクソソームと親和性界面との相互作用解析

Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/

Title

№９：EpCAM 陽性エクソソームと親和性界面との相互作

用解析

Author(s)

山本, 恵史; 岩井, 千弥; 吉田, 光孝; 吉成, 正雄; 矢

島, 安朝

Journal

歯科学報, 115(3): 276-276

URL

http://hdl.handle.net/10130/3685

Right

目的：エクソソームとは，細胞から放出される３０− １００nm 程 度 の 細 胞 外 分 泌 小 胞 で，血 液，唾 液， 尿，羊水，腹水などの体液中に多量に存在する。エ クソソームは，それを放出する親細胞由来のタンパ ク質や，RNA を含んでおり，これらの分子はエク ソソームを取り込んだ別の細胞内で発現し，機能す る。エクソソームは，がんの進展を始めとするさま ざまな生物現象に関与していることが次々と明らか にされており，エクソソームを核とした新しい医療 が生まれようとしている。本研究ではがんマーカー として知ら れ て い る EpCAM（Epithelial Cell Ad-hesion Molecule）分子に着目し，体液中に存在す るさまざまなエクソソームの集団の中から EpCAM 陽性エクソソームを選別する方法の開発を目指して いる。このために，がん研究所で開発された Ep-CAM 結合ペプチド「Ep１１４」をポリマーコート剤 と複合化した「EpiVeta」を用い，材料表面に Ep-CAM 親和性界面を形成し，その表面での EpEp-CAM 陽性エクソソームの相互作用を原子間力顕微鏡を用 いて評価することを目的とした。 方法：「EpiVeta」をポリスチレンプレートへコー トし，EpCAM 陽性エクソソー ム お よ び EpCAM 陰性エクソソームとの結合を原子間力顕微鏡（As-ylum Research 社）により評価した。エクソソーム は HCT１５（EpCAM 陽 性），お よ び HT１０８０（Ep-CAM 陰性）より調製した。また，EpHT１０８０（Ep-CAM 結合ペ プチドを提示しないコート剤として MPC ポリマー （日油社）を用いた。定量的評価は SPIP イメージ 解析ソフ ト ウ ェ ア（Image Metrology 社）を 使 っ て行なった。 結果：EpiVeta をコートしたポリスチレンプレート において，EpCAM 陰性エクソソームと比較して EpCAM 陽性エクソソームでは，数倍の結合を確認 した。これにより，EpiVeta をコートしたポリスチ レンプレートと EpCAM 陽性エクソソームとの特 異的な結合を定性的，定量的に評価することができ た。 考察：EpCAM 結合ペプチドである Ep１１４により構 成されるコート剤『EpiVeta』が形成する親和性材 料表面が示す EpCAM 陽性エクソソームに特異的 な結合力を，原子間力顕微鏡を用いて定量的に評価 できることが明らかとなった。 目的：Extracytoplasmic function（ECF）シグマ因 子は菌体外の生活環境変化に応答し，遺伝子の転写 量を制御することで細菌のストレス応答に関与して い る。歯 周 病 原 細 菌 Porphyromonas gingivalis は６ 種の ECF シグマ因子を保有しており，その一部は DNA 修復や酸化ストレス物質の消去に関与すると の報告がある。また，鉄は細菌の増殖に必須の栄養 素であり他のグラム陰性菌においては鉄取り込み に関与する ECF シグマ因子が存在するが，P. gin-givalisにおける ECF シグマ因子と鉄取り込みとの 関連性は明らかにされていない。本研究では ECF シグマ因子の遺伝子挿入変異株を作製し，鉄取り込 み機構との関連性を検討した。 方法：P. gingivalis ３３２７７株の６種の ECF シグマ 因 子遺伝子内にエリスロマイシン耐性遺伝子カセット が挿入された変異株を作製した。また，そのうち１ 種の ECF シグマ因子において遺伝子とその周辺部 を PT-COW ベクターに組み込み，変異株に導入し て相補株を作製した。野生株と変異株において通常 時およびヘミン制限条件下における増殖曲線を評価 した。また網羅的遺伝子発現を DNA マイクロアレ イにて検討後，野生株，変異株および相補株において Real-time RT-PCR にて遺伝子転写量を評価した。 結果および考察：ヘミン制限条件下において，野生 株と比較し PGN_０３１９変異株の増殖速度の減少が認 め ら れ た。ま た マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 に お い て， PGN_０３１９変異株において外膜タンパク質に関与す る遺伝子発現の減少が認められた。Real-time RT-PCR の結果，野生株と比較し PGN_０３１９変異株に おいて P. gingivalis の鉄取り込 み 機 構 に 関 与 す る PGN_０５５７（HmuR）の遺伝子転写量の減少が認め られ，相補株において野生株と同等レベルに回復し た。 以 上 の 結 果 よ り ECF シ グ マ 因 子 PGN_０３１９は PGN_０５５７（HmuR）の遺伝子発現制御に関与し， P. gingivalisの増殖における鉄取り込み機構に関与 することが示唆された。

№９：EpCAM 陽性エクソソームと親和性界面との相互作用解析

№１０：Porphyromonas gingivalis ECF シグマ因子 PGN_０３１９の機能解析

太田功貴１）２）_{，菊池有一郎}２）３）_{，今村健太郎}１）_{，吉川幸輝}１）_{，喜田大智}１）_{，藤瀬和隆}２）３）_{，国分栄仁}２）３）_，

齋藤 淳１）２）_{，石原和幸}２）３）_{（東歯大・歯周）}１）_{（東歯大・口科研）}２）_{（東歯大・微生）}３）

学 会 講 演 抄 録 ２７６