学位論文内容の要旨

博 士 （ 農 学 ）    末 田 香 恵

学 位 論 文 題 名

キュウリモザイクウイルス2b 夕ンノヾク質の大量発現系の      開発および機能解析

学位論文内容の要旨

11キ ュ ウ リモ ザ イ ク ウ イル ス(CMV) 2bタ ン パ ク 質(2b)の 大 量発 現 系 の 開 発

    生化 学 的 に タ ンパ ク 質 の 機能 解析を 行う場 合、目 的タ ンパク 質が大 腸菌に より可 溶性 の状態 で大量 に 合 成 さ れ る 必要 が あ る 。 これ は 、可溶 性のタ ンバ ク質が 適切に フオー ルデ ィング され、 正しく 機能す る状 態 に あ る と 考え ら れ る た めで あ る ふ 本 研 究で 用 い るCMVの2bは、 植 物 と ウ イル ス の 相 互 作用 に 様 々な 役 割 を も つ 多 機 能 タ ン バク 質 で あ る 。し か し な が ら、 サ ブ グ ル ー プIのCMVの2bは 大 腸菌 に 毒 性 を 示す た め に 大 量 発 現が 困 難 で あ り、 わ ず か に 得 られ る2bも不 溶 性 で あ る こと か ら 生化学 的解析 が容 易でな かっ た 。 詳 細 な2bの 機 能 解 析の た め に は 可溶 性 の2bを大 量 に 発 現 させ る 系 が 必要 である 。そ こで本 研究で は ま ず 、2bが 大 腸 薗 毒 性 を 示 す 要 因 を 明 ら か に し 、2bの 大 量 発 現 系 の 確 立 を 試 み た 。     CMVの 黄 斑 系 統 で あ るCMV‑Yの2b (Y2b)はMaltose Binding Protein（MBP)と の 融 合 タ ン パ ク質 (MBP‑Y2b)と し て 大 腸 菌 で 発 現 さ せ る と 、 大 腸 菌 の 増 殖 を 抑 制 し 、MBP‑Y2bはほ と ん ど 発 現 しな か っ た 。 一 方 、 日 本 の 食 用 ユ り か ら 単 離 さ れ たHL‑CMVの2b (HL2b)は 同 様 にMBP‑HL2bと し て 発 現 さ せ て も 大 腸 菌 の増 殖 を 抑 制 せず 、 可 溶 性 の 状態 で 発 現 させる こと ができ た。2つの2bのアミ ノ酸 配列を 比較 し た と こ ろ 、こ れ ら の ア ミノ 酸 は94％と 高 い 同 一 性を 示し 、異な るアミ ノ酸は7つ しか存 在し なかっ た。

そ こ で 、 こ れら の 異 な る アミ ノ 酸 に 基 づ いた 様 々 なY2bとHL2bの キ メ ラ 変異 体 を 作 製 し、 そ れ ら の大腸 菌 毒 性 や 大 腸菌 発 現 レ ベ ルを 比 較 し た と ころ 、Y2bの 大 腸 菌 毒 性に は104番目 のアミ ノ酸が 関与す ること が 分 か っ た 。2bの104番 目 の ア ミノ 酸 は 、Y2bで は グ ´ レタ ミ ン 酸 （ 酸性 ア ミノ 酸）で あり、HL2bでは り ジ ン （ 塩 基 性ア ミ ノ 酸 ） であ っ た た め 、104番 目 のア ミノ 酸の電 荷と 大腸菌 毒性の 関係を 調べ た。こ の結 果 、104番 目 の ア ミ ノ 酸 の 負 電荷 が2bの 大腸 菌 毒 性 を 決定 す る こ と が 分か っ た 。 ま た、 大 腸 菌 で 大Iに 発 現 す る よ う に な っ た2bの 可 溶 性を 評 価 し た が、MBP‑HL2bほど 可 溶 性 画 分 の割 合 が 高 い もの は な く 、 2bの 大 腸 菌 毒 性 と 可 溶 性 は 直 接 関 係 し な か っ た 。 さ ら に 、2bはCMVの 病 徽 誘 導に 影 響 しRNAサ イ レ ン シ ン グ サ プ レ ッ サ − （RSS)と し て も 働 く た め、CMVの病 原 性 に 対 する 影 響 を 調 べ たと こ ろ 、2bの 大 腸 菌 毒 性 の 有 無 は タ バ コ で の 病 徴 、CPや2bの 蓄 積 、RSS活 性 に は 直 接 は 影 響 し な か っ た 。

2） CMVの2bの 機 能 解 析

【2bのDNA結合 缶 】

    Y2bのC末 端 側 は 転 写 因 子 に 重 要 な ア ミ ノ酸 を 含 む こ とが 分 か っ て いた が 、2bとDNAが 直 接結 合 す る か を示 し た 研 究 はな か った 。こ れまで の大腸 菌毒性 の実 験から 、毒性 に関わ る領域 と転 写活性 部位が 同 じ で ある こ と が 分 かっ た た め 、2bは 大 腸 菌 のDNAと 結 合し て 転 写 を 阻害 し 、 毒 性 を示 し て い る可 能性が 考 え ら れ た 。 大 腸 菌 のDNAと 結 合 す る の で あ れ ば 、 植 物 細 胞 中 でもDNAと 結合 す る と い う2bの 新 た な

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作 用点 を 発 見 で きる 可 能 性 が ある 。 そこで 、Dynabeads M‑280 Streptavidinを用 いたDNAP assayを行 い、

2bがDNAと 結 合 す る か 調 べ た と こ ろ 、 大 腸 菌 毒 性 を 示 し た2bはdsDNAに もssDNAに も 結 合 し 、 さ ら に104番 目 の ア ミ ノ 酸 の 電 荷 は2bのDNA結 合 能 に も 重 要 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。CMVの2bはN 端 側 の 正 電 荷 を 持 つ ア ミ ノ 酸 領 域 でdsRNAに 結 合 す る た め 、DNAと もN端 側 で 結 合 する か ど う か を調 ぺ た 。 そ の 結 果 、2bはdsRNAと 同 じN端 側 でDNAと 結 合 し 、dsRNAと は 異 な りDNAと の 結 合 に はC端 側 の104番 目 の ア ミ ノ 酸 の 電 荷 が 影響 す る こ と が示 さ れ た 。CMV感 染 時 、2bは 肩 主 細胞 の 核 内 や 核上 に 蓄 積す る こ と 、 また 、Y2bとArabidopsis thalianaの 核DNAは ゲ ノ ム 規 模で 相 互 作用す るこ とが知 られて い る。 従 っ て 、2bのDNA結 合 能 に は 重要 な 生 物 学 的 意義 が あ る と 考え ら れ 、 宿 主植 物 細 胞 の 核に 蓄 積 し た2bが 特 定 のDNA配 列 を 認 織 し て 遺 伝 子 発 現 を 制 御 す る 可 能性 も 考 え ら れ る。 そ こ で 、DNAP assayを 応用し たSELEX  (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)を行 った ところ、2bが結 合 し や す い 複 数 の 配 列 を 得 た が 、CMV感 染 と の 関 係が 推 測 で き るよ う な 遺 伝 子は 特 定 で き なか っ た 。

【2bの りン1化 ● 茸 】

    Y2bは 酵 母で 発 現 し た とき に 転 写 を 促進 す る こ と が 分か っ て おり、 植物細 胞内 では核 に局在 する。 動 物 細 胞 内 で 働 く 転 写 因 子 で あ るIRF2BP2は 、 核 移 行 シ グ ナ ル(NLS)に 隣 接 す る セ リ ン(S)の り ン 酸 化 に よ っ て 核 に 局 在 す る こ と が 示 さ れ て い る 。CMVの2bが も つNLSの 近 傍 に も り ン 酸化 が 予 測 さ れる ア ミ ノ 酸 が 存在 す る こ と か ら、2bに おい て も りン酸 化が核 移行や それに 関連 する様 々な機 能に影 響す る可能 性 が あ る 。 そ こ で 、 大 腸 菌 で 十 分 量 発 現し 、CMV感 染 植 物 細 胞 内で 可 溶 性 画 分に 蓄 積 で き るY2b変 異 体 を 用 い てin vitroお よ び 加vivoのり ン 酸 化 修 飾解 析 を 行 っ た 。

  加vitroリ ン 酸 化assayの 結 果 、 大 腸 菌 で 最 も よ く 発 現 し たHL2bや 、CMV感 染 葉 で 可 溶 性 に な るml (N端 側 がY2bに 由 来 しC端 側 がHL2bに 由 来 す る2b変 異 体 ） は 加vitroで り ン 酸 化 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 さ らに 、1・ALONPMACPhosphoproteinEnnchmentKit（CIontech） を 用 いて り ン 酸 化 修 飾解 析 を 行 っ た と こ ろ 、m1はmWvoで も り ン 酸 化 さ れ る こ と が 示 さ れ た 。2b末 端 欠 失 変 具 体 を 用 い たmWm リ ン 酸 化assayの 結 果 、Y2bはN端 側46番 目 ま で の ア ミ ノ 酸 領 域 でり ン 酸 化 さ れ、 さ ら に ア ラ ニン 置 換 に よ る 比 較 実 験 か ら28番 目 のSが り ン 酸 化 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た 。2bの28番 目 のSは1つ 目 の NLSと 隣 接 し て2つ のNLSの 間 に 存 在 す る た め 、 そ の り ン 酸化 は ｜RF2BP2と 同様 に 核 移 行 に影 響 す る 可 能 性 が 高 い 。 そこ で 、2bとGFPの 融合 タ ン バ ク 質を 発 現 さ せ てり ン 酸 化 に よ る核 局 在 へ の 影響 を 調 べ た と こ ろ 、 通 常 のNLSを もつ2bで も 、28番 目 の アミ ノ 酸 が り ン酸 化 さ れ な い場 合 に は 核 移行 で き な い こ と が 明 ら か とな っ た 。RNAサ イレン シング はウ イルス 感染に 対する 宿主の 防御 機構で あり、shonlinterfering RNA（siRNA） の 発 生 やAG01、AG04の よ う な ス ラ イ サ ー タ ン パ ク 質 が 関 与 し て い る 。 ウ イ ル ス はRSS に よ っ て こ の 機 構 に 対 抗 し て お り 、CMVの2bはsiRNAやAGOと 結 合 す る こ と でRSSと し て 機 能 す る 。 CMV感 染 時に 大 部 分 の2bは 宿 主 細 胞の 核 内 や 核 上に 蓄 積 す る が、 そ の 役 割 は これ ま で 明 ら かに な っ て い な か っ た 。28番 目 のSにお け る り ン 酸化 ／ 脱 リ ン 酸 化に よ っ て2bが 核 へ 局 在 した り 、 あ る いは 細 胞 質 へ 局 在 し た りす る こ と か ら 、リ ン 酸 化 修 飾は2bの 細 胞内 局 在 （ 核 内や 核 上 ／ 細 胞質 ） を 通じて2bの様 々な 役 割 を 切 り替 え る ス イ ッ チの1っ と し て機 能 し て い る可 能 性 が 考 えら れ る 。

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学 位 論 文 審 査 の 要 旨

主 査    教 授    増 田    税 副 査    教 授    上 田 一 郎 副 査    助 教    志 村 華 子

学 位 論 文 題 名

キュウリモザイクウイルス 2b 夕ンノヾク質の大量発現系の      開発および機能解析

    本 研 究 で 用 い た キ ュ ウ リ モ ザ イ ク ウ イ ル ス(CMV) 2bタ ン パ ク 質(2b)は 、植 物 と ウ イ ルス の 相 互 作 用 に 様々 な 役 割 を も つ多 機 能 タ ン パク 質 で あ る が、 サ ブ グ ル ープ ｜ のCMVの2bは 大 腸菌 に 毒 性 を示 し て 大 量 発現 さ せ る こ と がで き ず 生化学 的解析 が困 難であ った。 そこで 、2bの 大腸菌 での大 量発現 系を 開発 し 、 そ の 機 能 に つ い て 分 子 レ ベ ル で の 解 析 を 行 っ た 。 以 下 に 主 要 な 研 究 成 果 に つ い て 要 約 す る 。

1） キ ュ ウ リ モ ザ イ ク ウ イ ル ス (CMV) 2bタ ン パ ク 質 (2b)の 大 量 発 現 系 の 開 発     黄 斑 系 統 で あ るCMV‑Yの2b(Y2b)はMaltose Binding Protein (MBP)と の融 合 タ ン パ ク 質(MBP‑Y2b) と し て大 腸 菌 で 発 現を 誘 導 す る と、 大腸菌 の増殖 を抑 制して ほとん ど発現 しなか った 。―方 、日本 の食用 ユ り か ら 単 離 さ れ たHL‑CMVの2b (HL2b)はMBP‑HL2bと し て 発 現 を 誘 導 し て も 大 腸 菌 の 増 殖 を 抑 制 せ ず 、 よ く 発 現 し た 。2つ の2bの アミ ノ 酸 配 列 は94％ と 高 い相 同 性 を 示 し、 異 な る ア ミノ 酸 は7つ しか 存 在 しな か っ た 。 そこ で 、Y2bとHL2bの キ メ ラ 変 異体 を 作 製 し 、 大腸 菌 毒 性 や 大腸 薗 発 現 レ ベル を 比 較 し た と こ ろ 、Y2bの 大 腸 菌 毒 性 は104番 目 の ア ミ ノ 酸 に よ り 決 定 さ れ てい た 。Y2bとHL2bの104番目 の ア ミ ノ酸 は 大 き く 電荷 が 異 な っ て いた た め 、2bの104番目 の ア ミ ノ 酸の 電 荷 と 大 腸菌 毒 性 の 関 係 を調 べ た 。 こ の 結 果 、104番 目 の ア ミ ノ 酸 の 負 電 荷 が2bの 大 腸 菌 毒 性 を 決 定 する こ と が 分 かっ た 。2bはCMV の 病 徽 誘 導 に 影 響 しRNAサ イ レ ン シ ン グ サ プ レ ッサ − （RSS） と し て も 働く た め 、CMVの 病 原 性 に対 す る 影 響 を 綱 べ た が 、2bの 大 腸 菌 毒 性 の 有 無 は タ バ コで の 病 徴 、CPや2bの蓄 積 、RSS活 性 に は 影 響し な か っ た。

2） CMVの2bの 機能 解 析

【2bのDNA結 合 能 】

    Y2bの 大 腸 菌 毒 性 を 決 定 す る領 域 と 酵 母 での 転 写 活 性 部位 が 同 じ で あっ た た め 、2bが 大 腸 菌 のDNA と 直 接 結 合 する 可 ・ 能 性 が 考え ら れた。 そこで 、Dynabeads M‑280 Streptavidinを用い たDNAP assayを行 い 、2bのDNA結 合 能 を 翻 ぺ た 。 こ の 結 果 、 大 腸 菌 毒 性 を 示 し た2bはDNA結 合 能 を 示 し 、104番目 の ア ミ ノ 酸 の 電 荷 は2bのDNA結 合 能 に も 重 要 で あ る こ と 、 お よ び 、 こ のDNA結 合 ド メ イ ン はN末 端 領 域 に

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存 在 し 、C端 側 の104番目 の ア ミ ノ 酸の 電 荷 に 影 響 され る こ と も 明ら か と な っ た。 さ ら に 、2bが 配 列 選 択 性 を 持 っ てDNAに 結 合 す る の か を 明 ら か と す る た め 、DNAP assayを 応 用 し たSELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)を行 ったと ころ、2bが結 合しや すい複 数の 配列を 得た が、CMV感 染と の 関 係 が 推測 で き る よ うな 遺 伝 子 は 特 定さ れ て い な い。

【2bの りン 酸 化 修 飾 】

    Y2bは 醇 母で 転 写 を 活 性化 さ せ 、 植 物細 胞 内 で は 核に 局在 するタ ンパク 質であ る。 動物細 胞内で 働く 転 写 因 子 で あ るIRF2BP2は 、 核 移 行 シ グ ナ ル(NLS)に 隣 接 す る セ リ ン(S)の り ン 酸 化 に よ っ て 核 に 局 在 す る こ と が 示 さ れ て い る 。CMVの2bで も28番 目 のSがNLSに 隣 接 し て い る こ と か ら 、 リ ン 酸 化 が 2bの 核 移行 に 影 響 す る可 能 性 が 考 えら れ た 。 そ こで 、 大 腸 菌 で 十分 量 発 現 し 、CMV感 染植 物 細 胞 内 で可 溶 性 画 分 に蓄 積 で き るY2b変 異 体 を用 い て り ン 酸化 修 飾 解 析 を行 っ た 。

  In vitr0リ ン 酸 化aSSayおよ びTALONPMACPhOSphoproteinEnriChmentKjt（CIOnteCh）を 用いた ´nゾんo で の り ン 酸 化 修 飾 解 析 の 結 果 、Y2b変 異 体 はmmmで もmWvoで も り ン 酸 化 さ れ た 。 さ ら に 、2b末 端 欠 失 変 異 体 や ア ラ ニ ン 置 換 変 異 体 を 用 い た 加 鮒roリ ン 酸 化assayの 結 果 、Y2bの28番目 のSが り ン酸 化 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た 。IRF2BP2同 様 、2bの28番 目 のSの り ン 酸 化 は 核 移 行に 影 響 す る 可能 性 が 高 い た め 、2bとGFPの 融 合 タ ン パ ク質 を 発 現 さ せ て細 胞 内 局 在 を調 べ た 。 こ の結 果 、 通 常 のNLSを も つ 2bで あ っ て も28番 目 を ア ラ ニ ン に 置 換 す る と 核 に 移 行 で き な く な っ た 。CMVの2bは 細 胞 質 で はRSS と し て 働 き 、 核 内 で はTGSを 誘 導 す る と考 え ら れ て いる 。 従 っ て 、28番 目 のSに お け る り ン酸 化 修 飾 に は 、2bの細 胞 内 局 在 の変 化 （ 核 内 や核 上 と 細 胞 質） を 通 じ て2bの 役 割 を 切り 替 える機 能があ ると 考えら れ る 。

  よ っ て 、 審 査員 一 同 は 、末田 香恵 氏が博 士（農 学）の 学位 を受け るのに 十分な 資格を 有す るもの と認め た 。

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