大豆未発芽種子の酸性エキソ型プロテアーゼの精製

大豆未発芽種子の酸性エキソ型プロテアーゼの精製

著者 宇高 京子, 川名 広子

雑誌名 東京家政大学研究紀要 2 自然科学

巻 37

ページ 23‑26

発行年 1997

出版者 東京家政大学

URL http://id.nii.ac.jp/1653/00010594/

大豆未発芽種子の酸性エキソ型プロテアーゼの精製

宇高 京子，川名 広子

（平成8年10月7日受理）

Purification of the Acidic Exoproteases derived from       Ungermination Soybean Seed

Kyoko UDAKA and Hiroko KAwANA

   （Received October 7，1996）

1．緒  言

 大豆乾燥完熟種子は極度な脱水状態にある．非休眠種 子を発芽に好適な条件下に置くと「幼根が種皮を破る」

という形態的な現象を最終過程として，それに先立って 起こる一連の細胞内生理生化学的変化を一般に「発芽」

と言う．前報の通り，乾燥完熟大豆種子は本実験条件下 では，24時間後から発芽が始まり，発芽3日目から胚軸 の伸びが大きくなり，発芽6日目から根毛の発達が著し

く，発芽8日目から上胚軸の伸びが始まると言う形態的 な変化が著しいω．

 従来から宇高らは発芽過程での第一段階であるこの異 化作用（catabolism）に関与するプロテアーゼ（2〜3）と 大豆種子たんぱく質の生合成について検討してい

る〔4− 1°〉．そこで前報（3）では，発芽各時期より得た酸性

エキソ型プロテアーゼ活性は基質0．2％変性ヘモグロビ ンおよび0．4％大豆11Sたんぱく質を用いた場合も発芽 0日目が最大であり，その後，活性は減少していく傾向 が得られたので，本論文ではその発芽0日目（未発芽種 子）を用いて，その酸性エキソ型プロテアーゼの精製と その活性を検討したので報告する．

2．実験方法

（1）試料の調整

 大豆乾燥完熟種子（ボンミノリ種，遺伝子型a，早生）

は低温保存2年以内のものを用いた．種子を1％洗剤で 洗った後，70％エタノール中で30秒，次ぎに5％さらし 粉液に浸漬し，これを滅菌水で十分に洗い流した後，滅 菌シャーレーに滅菌水をしみこませたガーゼを敷き，発

芽さす（20℃）．試料採取は0，1，2，3，4，5，6，7，8および

9日目に行ったが，本実験では未発芽種子（発芽0日目）

を用い以下の実験に供した．

（2）未発芽種子からの粗酵素液の抽出

 未発芽大豆種子を40粒採取し，1．OM食塩を含む0．01 Mバルビタール緩衝液（pH8，0）を30m1加え， ultra−

turraxホモジナイザーで3分間（4℃）摩砕した，次ぎ に日立高速冷却遠心機（20PR−・52）でx15000 rpm，

20分間遠心し，その上澄液を粗酵素液とした．

（3）ゲル濾過法による粗酵素液の精製

 上記（2）の粗酵素液10mlをBio−gel A−1．5 M（Bio−

Rad社製）によるゲル濾過を行った．1．O M食塩を含 む0．01Mバルビタール緩衝液（pH8．0），カラムサイズ 30x950 nm，流速0．5ml／分で9．5m1ずっ集め，280nm でその吸光度を測定した．次ぎにプロテアーゼ活性の見 られるところを集め，O．8飽和硫酸アンモニウムで硫安 分画し（第一回プロテアーゼ活性区分），再度ゲル濾過 をおこない，分離精製した（第二回プロテアーゼ活性区 分）．また同様にこの内，プロテアーゼ活性のみうけら れるところを集め，0．8飽和硫酸アンモニュウムで硫安 分画し，Bio−gel P−100でゲル濾過をおこなった，

カラムサイズ15x200mm，流速0．5m1／分で4．8 m1ず つ集め，その吸光度を280nmで測定した（第三回およ び第四回プロテアーゼ活性区分）．

食品学第3研究室

（4）プロテアーぜ活性の測定

（4−1）第一回目プロテアーゼ活性区分を用いた場合0．2  ％変性ヘモグロビン（pH7．5）O．2m1と1M酢酸緩衝  液（pH5．0）0．5 m1に第一回目プロテアーゼ活性区

宇高 京子・川名 広子

分0．2m1を加え，撹搾混和する．全て盲験は純水を用 いた．次ぎに38℃恒温槽で0分と120分反応させ，終 了後ただちに50％TCA（トリクロロ酢酸）0．2ml加 え，撹絆混和し，氷水中に15分放置，次ぎに卓上遠心 機（x2800rpm，10分）で遠心し，その上澄液0．7ml に純水0，8mlを加え撹搾混和し，その吸光度を280nm で測定した．その結果をFig．1に示した．

2．5

20

εζOo9創 PO     O     5      1︒  0︒

彰可 OO＝05﹄﹂Oの﹄︽

0．0

  m！ ^／

／

！〆

／ ／

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0     10    20    30    40    50    60

     Fract i on nuldber

  o怨①も﹂Ωox四

ハU    n◎    ハ0     0    00    0    0 ﹂b診〜一ぢ0_{4T    2 0    0}

 0     0 〇二卜

0 0 0

Fig．1 Gel Filtration Pattern on Bio−gel A−

    1．5M and the Activity of Acidic Exop     rotease derived from Ungermination     Soybean Seed

   ＊Fraction Number 25〜32 is precipitated

    by 80％Ammonium Sulfate

（4−2）第二回目プロテアーゼ活性区分を用いた場合0．2  ％変性ヘモグロビン（pH7．5）0．2m1と1M酢酸緩

衝液（pH5．0）0．5 mlおよび第二回目プロテアーゼ 活性区分0．5m1を加え，撹絆混和する．次ぎに38℃

恒温槽で0分と120分反応させ，終了後ただちに50％

TCAO．2ml加え，撹搾混和し，氷水中に15分放置，

次ぎに卓上遠心機（x2800rpm，10分）で遠心し，

その上澄液0．3mlを分取し，280nmでその吸光度を測 定した．その結果をFig．2に示した．

（4−3）第三回目プロテアーゼ活性区分を用いた場合0．2  ％変性ヘモグロビン（pH7．5）0．2m1と1M酢酸緩

衝液（pH5．0）0．5 mlおよび第三回目プロテアーゼ 活性区分0．8m1を加え，撹絆混和する．次ぎに38℃

恒温槽で0分と120分反応させ，終了後ただちに50％

TCAO．2ml加え，撹絆混和し，氷水中に15分放置，

次ぎに卓上遠心機（x2800rpm，10分）で遠心し，

その上澄液1．6m1を分取し，280nmでその吸光度を測 定した．その結果をFig．3に示した．

2．0

  5

∈⊆Oo9創胴⑩ 0        5t      a

OO＝o臨﹄﹂O切﹄＜

0

280m 500nm

∈50・4

十 一●一

oo

だo．3

oo

⊆口0．2

』Lo

ω

．◎0．1

＜

0 10      20 30 40

Fract ion number

o怨βo﹂直×山

4    2    0

0    0    0 ↑0

08 0

﹀と≧ぢ02ト

 6    4    2 0    0    0 0   α   0   0

Fig．2 ●Gel Filtration Pattern on Bio−Gel      A−1．5M

    ．Quantity of ungermination Soybean      Protein

    ，The Activity of Acidic Exoproteases      at 280nm Absorbance

    ＊Fraction Number 27〜34 is Precipitat      ed by 80％Ammonium Sulfate

2．0

  5

ε⊆Oo9尉翌唱 む      t    9αOOにO﹄﹂Oω﹄︽

0

Fract i on number

oω8ぢa×国

4可   9﹂   0α  q  α 甲oo8

q

﹀ご≧ぢ煽o↑

0  α  q  O 06@ 04  02

Fig．3 ●Gel Filtration Pattern on Bio 一 Gel

     P−100

    ．Quantity of Ungermination Soybean      Protein

    JThe Activity of Acidic Exoproteases      at 280nm Absorbance

    ＊Fraction Number 13〜16 is Precipitat      ed by 80％Ammonium Sulfate

（4−4）精製したプロテアーゼ活性の検討

0．2％変性ヘモグロビン（pH7．5）0．2mlと1M酢酸 緩衝液（pH5．0）0．5mlおよび第四回目プロテアー ゼ活性区分酵素液0．5m1を加え，撹梓混和する．次ぎ に38℃恒温槽で0分，90分および120分反応させ，終 了後ただちに50％TCAO．2m1加え，撹搾混和し，氷 水中に15分放置，次ぎに卓上遠心機（x2800rprn，

10分）で遠心し，その上澄液1．3m1を分取し，280nm

でその吸光度を測定した．その結果をFig．

た．

0．07

0．06

 5 0 α

∈⊆OcoN

4 α 0

ρ0   3    n∠  ︵U    O  α   α

①O＝口﹄﹂Oのコ＜

0．Ol

0

0     30    60    90    120

 1ncubation time （min．）

4に示し

Fig。4 The Activity of Acidic Exoprotease     from the Purified Ungermination     Soybean Seed

    ＊Substrate（O．2％Denatured Hemoglobin      （pH7．5）0．2ml，1M Acetic Acid Buffer      （pH5．0）0．5ml， Engyme Solution O．5ml

5．Folin一フェノール試薬法によるたんぱく質量の   定量

 酵素液0．1m1と純水0．1m1およびアルカリ性銅溶液1m l加え，良く混和し，室温で10分放置し，フェノール試 薬0．1m1を加え，30分以上経過してから500 nmでその 吸光度を測定した．盲験は純水を用い，たんぱく質標準

溶液は牛血清アルブミンを用い，その検量線をFig．5 に示した，またその結果をFig．2およびFig．3に示

した．

3．実験結果と考察

Fig．1は未発芽大豆種子（発芽o日目）からの粗酵素 液をBio−gel A−1．5 Mを用いてのゲル濾過図とその プロテアーゼ活性図である．フラクションNo．25〜32 にその活性が強く見られたので，その区分を集め，0．8 飽和硫酸アンモニウムで硫安分画した．Fig．2は上記 の硫安分画したプロテアーゼ活性区分をBio 一 gel A−

1．5Mを用いての再ゲル濾過図とそのプロテアーゼ活性 図とたんぱく質量を示した．

フラクションNo．27〜34にその活性が強く見られたの で，その区分を集め，80％硫酸アンモニュムで硫安分画

し，以下の実験に供した。

Fig．3は硫安分画したプロテアーゼ活性区分をBio−

gel P−100を用いてのゲル濾過図とそのプロテアーゼ 活性図とたんぱく質量を示した．

フラクションNo．13〜16にその活性が強く見られたの で，その区分を集め，80％硫酸アンモニウムで硫安分画

し，透析，遠心し，それを0．5mlと基質O．2％変性ヘモ グロビン0．2mlと1M酢酸緩衝液0．5m1とでのプロテアー ゼ活性を検討したのがFig．4である．すなわちプロテ アーゼ活性は保温90分で0，045と保温120分で0．062 と活性が認められた．

1．5

0 1

 5︵α

目自OOゆ 邸 OO唱吋O﹂Oωρ＜

0．0

 0

Fig．5 Protein Standard Curve by Cu・Folin s Method

宇高 京子・川名 広子

4，要  約

前報（3）で大豆発芽各時期より得た酸性エキソ型プロテ アーゼ活性は基質0．2％変性ヘモグロビンおよび基質0．

4％大豆11Sたんぱく質を用いた場合も発芽0日目が最 大であり，その後，活性が減少していく傾向が得られた ので，発芽0日目（未発芽大豆）を用いて酸性エキソ型 プロテアーゼを分離・精製し，その確認実験をおこなっ た．その結果は前報と同様に，基質0．2％ヘモグロビン で酸性エキソ型プロテアーゼ活性が認められた．

1）宇高

2）宇高 3）宇高

5．文  献

京子：東京家政大学生活科学研究所研究報告，

   13 （1990）

京子：東京家政大学研究紀要第35集（1995）

京子：東京家政大学研究紀要第36集（1996）

4）C，Fukazawa， K．Udaka， et a1：Kulturflance，

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5）C．Fukazawa， K．Udaka et al：J．Biol． Che   m．，260，6234−6239（1985）

6）T．Momma K．Udaka et a1：Eur． J．Biochem．，

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7）T．Momma K．Udaka et al：FEBS Lett．，118，

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8）C．Fukaxawa K．Udaka et al：Nucleic Acids   Res．，15，8117−8119（1987）

9）C．Fukaxawa KUdaka et al：FEBS Lett．，

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10）N．A．Yeboah K．Udaka et a1：Protein Expre   ssion Purif．，7，309−314 （1996）