PIPC CTM CFPM FMX CPDX A/BT AZT MEPM GM FM T Mck 35 3 微量液体希釈法腸内細菌科 I Mkp 75 > > > 3 > > Mmm 0 > > > 3 > 3 > I I 班により 管程度の違いがある薬剤もあります カテゴリーはブレイクポイント別表

T. Muratani T. Muratani T. Muratani

薬剤感受性測定について

福臨技 微生物部門研修会 Feb 4, 2017 美萩野臨床医学専門学校

村谷 哲郎

実習A：微量液体希釈法 実習B：ディスク拡散法 実習C：酵母様真菌薬剤感受性テストASTY®_＆Etest®

おまけ：CIM test, β-lactamase type推定ディスク

T. Muratani T. Muratani

実習A 微量液体希釈法

実習内容 あらかじめ前日に実施した黄色ブドウ球菌2株と腸内細菌科3株の計 5株のMICを判定し、カテゴリーをつける。 T. Muratani

実習Aの目的 （微量液体希釈法）

１．目視判定し、判定用紙に記入する。 ２．判定結果を数値として記入する。 ３．感受性カテゴリー記入する。 菌の発育を認めない最小濃度をMICとして記載する。 すべてのウェルに発育を認めない時は ≦ ● μg/ml と記載する。●は測定最小濃度 ≦とする理由を説明できること。 ＜は間違いである理由を説明できること。 すべてのウェルに発育を認めた時は ＞ ■ μg/ml と記載する。■は測定最大濃度 ＞とする理由を説明できること。 ≧を使用するときは、≧■×2とすること。 ＞■μg/ml と ≧■×2 μg/mlは同義であることを説明できること MRSAと判定された株は、β-lactamのカテゴリーをRとする。 T. Muratani

MIC表記 解説

MICとは最小発育阻止濃度。すなわち、（－）となった最も低い濃度となります。したがっ て、下記のFRPMは2, 4, 8, 16が（－）なので、一番低い値 2 μg/mlがMICとなる。 同様にCDTRは 4 μg/ml, MINOは16 μg/mlとなる。 ABPCは、測定最高能である16 μg/mlで発育しており、32 μg/mlを実施した場合、（－）ま たは＋の両方の可能性がある。したがって、（－）ならば32 μg/ml、＋ならそれ以上とな る。したがって、≧16μg/mlは不正解となる。通常は > 16 μg/mlと記載しますが、≧32 μg/mlと同義であり正解であるが、数学的には矛盾が生じる。 LVFXは、測定最小濃度 1 μg/mlで発育を認めていないので、0.5 μg/mlを実施した場合、 （－）または＋の両方の可能性がある。したがって、＋ならば1 μg/ml、（－）ならばそれ以 下となる。したがって、< 1 μg/mlは不正解。≦1 μg/mlと記載しなければならない。 MIC (μg/ml) 2 >16 4 ≦ 1 16 _{T. Muratani}

微量液体希釈法 Staphylococcus aureus

CFX MPIPC ABPC CEZ CMZ FMOX IPM GM ABK MINO EM CLDM VCM TEIC LZD FOM LVFX ST ISA1534 >16 2～4 16 16 16 8 ≦0.25 >8 1 MRSA ATCC 29212 ≦ 4 0.5 4 1 2 ≦ 0.5 ≦ 0.25 ≦ 0.25 0.5 MSSA ISA1534 ≦ 2 0.5 0.12 1 1 2 ≦ 32 0.5 ≦ 0.5 ATCC 29212 ≦ 2 0.5 0.25 ≦ 0.5 ≦ 0.5 2 ≦ 32 0.5 ≦ 0.5 MIC (μg/ml) MIC (μg/ml) R R R R R R S R S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S １, 2, 3班の違いにより、1管の差はあります。

T. Muratani

微量液体希釈法 腸内細菌科

PIPC CEZ CTM CTX CAZ CFPM FMOX CPDX A/SBT AZT IPM MEPM GM AMK MINO FOM LVFX ST Mck 6352 4 2 ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 2 8 ≦0.5 ≦0.25 ≦0.25 0.5 ≦1 2 ≦32 0.5 ≦0.5 Mkp 7456 >64 >16 8 ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 1 ≦1 >16 ≦0.5 1 0.5 ≦0.25 1 4 ≦32 >2 >4 Mmm 6420 >64 >16 >16 32 1 4 4 >4 16 2 2 ≦0.25 1 4 8 ≦ 32 ≦ 0.25 > 2 S S S S S S S I S S S S S S S S S S R R S S S S S S R S S S S S S S S S R R R R S S S R I S I S S S S S S S 班により１管程度の 違いがある薬剤もあ ります。 カテゴリーはブレイク ポイント別表に従っ て判定 T. Muratani

実習B ディスク拡散法

200 mmシャーレを用いたKBディスク12薬剤の判定 腸内細菌科 7株、Acinetobacter 1株 T. Muratani

実習Bの目的 ディスク拡散法

１．実際にディスク阻止円径を判定してみる。 ２．判定基準と照合し、カテゴリーをつける。 ３．感受性パターンからβ-lactamaseタイプを推定する。 ノギスの扱い方 楕円の場合の判定方法 ムコイド部分を除外して測定

β-lactamase type推定のためのKey drug

T. Muratani

ディスクは必須アイテム

McFarland = 0.5 を綿棒で 60°3方向から塗布 判定はノギス使用 液体微量希釈法では困難な1薬剤追加ができる。 データ疑義の際の確認、相乗作用、誘導耐性を確認できる。 図はESBL＋IMP-1同時産生株 CAZ/CVA AZT LMOX SMA LMOX AZT SMA デジタルは便利 T. Muratani

ディスク拡散法の長所、短所

液体微量希釈法のパネルに搭載されていない薬剤 使用頻度は低いが特殊な耐性菌にのみ使用する薬剤 微量液体希釈法の疑わしい結果の確認 液体培地で発育しない株の感受性測定 相乗作用の確認 耐性機序の確認 誘導耐性、阻害剤を用いた確認試験 阻止円径は求められるが、MICに変換することはできない。 結果的にカテゴリーのみの報告となる。 通常は完全手作業、ノギスを用いた目視判定 結果は手入力 操作は簡単、薬剤の組み合わせ自由、ディスクは安価 ただし、特殊培地を常備することは事実上困難

5％羊脱繊維血液加CA-MHA、HTM agar、GC agar

T. Muratani 腸内細菌科 OFLX, LVFX

緑膿菌 CL, PL-B

その他グラム陰性桿菌 すべてなし ブドウ球菌 MPIPC, VCM, TEIC, DAP 腸球菌属 DAP

肺炎球菌 β-lactamのほとんど 嫌気性菌 すべて

M45Ed3

Abiotrophia & Granulicatella, Aerococcus, Bacillus, Corynebacterium & related coryneform bacteria, Erysipelothrix rhusiopathiae, Gemella, HACEK, Helicobacter pylori, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,

Listeria monocytogenes, Micrococcus, Pediococcus, Rothia mucilaginosa,

ディスク拡散法の判定基準がない（MICあり）

T. Muratani

ディスク拡散法 No.1

ABPC PIPC/TAZ CEZ CAZ CTX CPR CMZ IPM MINO LVFX ST AMK MIC (μg/ml) 8 2 1 0.25 0.12 0.06 1 0.12 2 0.03 0.12 2 阻止円径 (mm) 19±3 27±3 24±3 29±3 32±3 32 29±3 29±3 22±3 33±4 26±3 23±3 E. coli ATCC25922 S or I S S or I S S S S S S S S S ABPC LVFX 薬剤はABPCから時計回りに表 に示す順番で並んでいる。 すべて感受性 T. Muratani

ディスク拡散法 No. 2

ABPC PIPC/TAZ CEZ CAZ CTX CPR CMZ IPM MINO LVFX ST AMK MIC (μg/ml) >256 16 >128 64 64 16 128 0.25 >128 256 阻止円径 (mm) 6 22 6 20 10 12 18 30 20 6 30 23

Escherichia coli Mec 5404 CAZ, CMZの両方が高いことより、 Metallo-β-lactamaseまたは、ESBL＋ AmpC β-lactamase産生を疑う。 DHA-1（AmpC）およびSHV-12（ESBL)産 生株 R S R I R R S S S R S S ABPC LVFX T. Muratani

ディスク拡散法 No. 3

ABPC PIPC/TAZ CEZ CAZ CTX CPR CMZ IPM MINO LVFX ST AMK MIC (μg/ml) >256 256 32 0.5 1 2 4 1 4 4 >16 1 阻止円径 (mm) 7 11 11 24 24 22 22 20 16 16 7 22 K. pneumoniae Mkp 7456 CAZ, CTXとも低く、CMZも低いが、 PIPC/TAZは耐性。OXA-48を疑う。 OXA-48産生株 R R R S I S S S S R S S ABPC LVFX T. Muratani

ディスク拡散法 No. 4

ABPC PIPC/TAZ CEZ CAZ CTX CPR CMZ IPM MINO LVFX ST AMK MIC (μg/ml) 256 4 >128 0.25 0.12 0.12 >256 2 4 0.12 0.12 2 阻止円径 (mm) 7 30 7 29 31 32 6 19 17 33 27 24

Enterobacter aerogenes Mea 7491

CMZのみ耐性。 誘導型Class C β-lactamase 菌種より、染色体性AmpCと考える。 R S R S S S R R S S S S ABPC LVFX T. Muratani

ディスク拡散法 No. 5

ABPC PIPC/TAZ CEZ CAZ CTX CPR CMZ IPM MINO LVFX ST AMK MIC (μg/ml) >256 4 >128 1 32 8 64 2 128 >128 >16 4 阻止円径 (mm) 6 29 6 28 16 13 13 22 6 6 6 21 Proteus mirabilis Mpm 4039 CAZ感受性、CTX耐性、CMZ耐性、IPM 低感受性 感染症法の基準を満たすため CREとなる。CTX-M型ESBLと誘導型 AmpC β-lactamase産生株と考えられる。 CTX-M-2, DHA-1産生株 R S R S R R I I R R R S ABPC LVFX T. Muratani

ディスク拡散法 No. 6

ABPC PIPC/TAZ CEZ CAZ CTX CPR CMZ IPM MINO LVFX ST AMK MIC (μg/ml) >256 >256 >128 >256 >256 >128 >256 32 8 64 > 16 2 阻止円径 (mm) 6 6 6 6 6 6 6 7 15 6 6 18

Escherichia coli Mec 7189

PIPC/TAZ, セファロスポリン、セファマイシン、 カルバペネムがすべて高度耐性。Metallo-β-lactamase、KPC type β-lactamaseなどCPE と推測 NDM-1産生株 R R R R R R R R I R R S ABPC LVFX

T. Muratani

ディスク拡散法 No. 7

ABPC PIPC/TAZ CEZ CAZ CTX CPR CMZ IPM MINO LVFX ST AMK MIC (μg/ml) >256 >256 >128 >128 128 >128 >256 32 16 16 >16 8 阻止円径 (mm) 6 8 6 6 7 6 6 8 13 6 6 19

Escherichia coli Mel 7333

PIPC/TAZ, セファロスポリン、セファマイシン、 カルバペネムがすべて高度耐性。Metallo-β-lactamase、KPC type β-lactamaseなどCPE と推測 KPC-2産生株 R R R R R R R R I R R S ABPC LVFX T. Muratani

ディスク拡散法 No. 8

ABPC PIPC/TAZ CEZ CAZ CTX CPR CMZ IPM MINO LVFX ST AMK MIC (μg/ml) >256 >256 >128 64 >128 >128 >128 32 8 8 16 >256 阻止円径 (mm) 6 12 6 6 6 7 6 12 18 11 6 6 Acinetobacter baumannii Mab 6035 R R R R R S R R R ABPC LVFX T. Muratani

β-lactamase typeを

推定するために必要なKey drug

PIPC, PIPC/TAZ TAZにより阻害を受けるβ-lactamase OXA-48の推定 CAZ

TEMおよびSHV type ESBLの好基質 Class B1 metallo-β-lactamaseの好基質 CPR CTX-M type β-lactamaseの好基質 AmpC β-lactamaseに比較的安定 CMZ ESBLに安定 AmpC β-lactamaseの好誘導基質 AmpC β-lactamaseの好基質 AZT Metallo-β-lactamaseに安定 MEPM CPEの好基質 β-lactamase阻害剤 キレート剤 CVA クロキサシリン 3アミノフェニルボロン酸 アビバクタム 今回ディスク拡散法に選択され た薬剤以外に、AZT, CAZ/CVA, CPR/CVAを入れれば、分離頻 度の高い広域β-lactamaseの推 定は可能となる。 T. Muratani

実習C ASTY

®

_{& Etest}

®

T. Muratani

実習Cの目的 ASTY

®

_＆Etest

® １．酵母様真菌薬剤感受性検査 ASTY®_{を判定してみる。} ２．Etest®_{を判定してみる。} 完全発育阻止と50%発育阻止の薬剤の判定を把握する。 トレーリング発育株のMIC決定法とその理由を習得する。 CLSIの判定法とASTY®_{の判定法の違いを理解する。} Etest®_{の判定方法を理解する。} 左右の値が異なる場合。 薄い部分がある場合。 T. Muratani 抗真菌薬 Amphotericin B Flucytosine Miconazole Fluconazole Itraconazole Micafungin Voriconazole Caspofungin Ketoconazole Terbinafine Efinaconazole 略号 AMPH-B L-AMB 5-FC MCZ FLCZ （F-FLCZ） ITCZ MCFG VRCZ CPFG KCZ EFCZ 和名 アムホテリシンB フルシトシン ミコナゾール フルコナゾール ホスフルコナゾール イトラコナゾール ミカファンギン ボリコナゾール カスポファンギン ケトコナゾール テルビナフィン エフィナコナゾール 商品名 ファンギゾン注射用／DS アムビゾーム点滴静注用 アンコチル錠 フロリードF注／ゲル／膣錠 ジフルカンカプセル／静注液 プロジフ静注液 イトリゾールカプセル／注 ファンガード点滴用 ブイフェンド錠／静注用 カンサイダス点滴静注用 ニゾラールクリーム ラミシール錠 クレナフィン爪外用液

主な抗真菌薬

T. Muratani

測定方法および判定方法の比較

ASTY（極東） DP（栄研） 菌量・培養温度 培地 AMPH-B MCFG CPFG 5-FC FLCZ ITCZ VRCZ MCZ 48時間 完全発育阻止 48時間 完全発育阻止 ― 24又は48時間 完全発育阻止 24時間 50%発育阻止 EUCAST CLSI 18～24時間 完全発育阻止 18～24時間 50%発育阻止 24および48時間 50%発育阻止 48時間 50%発育阻止 約103 _{cfu/ml ・ 35℃} RPMI1640 約105_cfu/ml ＋レサズリン +2% glucose 設定なし 設定なし T. Muratani T. Muratani T. Muratani

抗真菌薬のブレイクポイントとカテゴリー

M27-S3 2008年

S-DD* 16-32 0.25～0.5 2 I（中間） 8～16 R（耐性） ≧2 ≧64 ≧1 ≧4 ≧4 ≧32 抗菌薬 Amphotericin B Fluconazole Itraconazole Miconazole Voriconazole Micafungin Flucytosine S（感受性） ≦1 ≦8 ≦0.125 ≦1 ≦2 ≦4 赤字はEUCAST、その他はCLSI（M27-S3）のブレイクポイント *SDD:用量依存的感受性 ブレイクポイント （μg/ml) T. Muratani T. Muratani T. Muratani

CLSI M27-S4(2012年12月)で改訂された

Fluconazoleのブレイクポイントとカテゴリー

S-DD* 4 ≦32 ― 4 4 16-32 I（中間） R（耐性） ≧8 ≧64 ― ≧8 ≧8 ≧64 菌種 C. albicans C. glabrata C. krusei C. parapsilosis C. tropicalis M27-S3 S（感受性） ≦2 ― ― ≦2 ≦2 ≦8 *SDD:用量依存的感受性 ブレイクポイント （μg/ml) T. Muratani T. Muratani T. Muratani

CLSI M27-S4(2012年12月)で改訂された

Voriconazoleのブレイクポイントとカテゴリー

S-DD* 0.25-0.5 ― 1 0.25-0.5 0.25-0.5 2 I（中間） R（耐性） ≧1 ― ≧2 ≧1 ≧1 ≧4 菌種 C. albicans C. glabrata C. krusei C. parapsilosis C. tropicalis M27-S3 S（感受性） ≦0.12 ― ≦0.5 ≦0.12 ≦0.12 ≦1 *SDD:用量依存的感受性 ブレイクポイント （μg/ml) T. Muratani T. Muratani T. Muratani

CLSI M27-S4(2012年12月)で改訂された

Micafunginのブレイクポイントとカテゴリー

S-DD* I（中間） 0.5 0.12 0.5 4 0.5 4 R（耐性） ≧1 ≧0.25 ≧1 ≧8 ≧1 ≧8 ≧4 菌種 C. albicans C. glabrata C. krusei C. parapsilosis C. tropicalis C. guilliermondii M27-S3 S（感受性） ≦0.25 ≦0.06 ≦0.25 ≦2 ≦0.25 ≦2 ≦2 *SDD:用量依存的感受性 ブレイクポイント （μg/ml) T. Muratani

ASTY

®

_最終判定

AMPH-B 5-FC FLCZ MCZ MCFG ITCZ VRCZ Candida parapsilosis 0.5 0.5 2 2 0.5 0.25 0.03 Candida glabrata 0.5 ≦ 0.125 4 0.25 ≦ 0.03 0.5 0.12 MIC (μg/ml)

T. Muratani

酵母様真菌薬剤感受性試験

Candida glabrata 24 hr 48 hr AMPH-B 5-FC FLCZ MCZ MCFG ITCZ VRCZ 24 hr 0.5 ≦ 0.125 2 0.125 ≦ 0.03 0.25 0.06 48 hr 0.5 ≦ 0.125 4 0.25 ≦ 0.03 0.5 0.12 MIC (μg/ml) 班によりやや異なります。 _{T. Muratani} Etest®_{は、抗菌剤が連続15段階の濃度勾} 配にコーティングされているプラスチックの ストリップです。 独自の革新的なドライケミ ストリー技術を用いて、抗菌剤および抗真 菌剤の最少発育阻止濃度(MIC)を正確に 測定します。 Etest®_{は、15倍希釈系列のMICを測定する、} 作業効率の高い製品として認められていま す。 Etest®では、多数の抗菌剤をライン アップしており、好気性菌だけでなく、栄養 要求の厳しい菌である、肺炎球菌、ピロリ 菌、髄膜炎菌、淋菌、嫌気性菌、酵母様真 菌、などの検査が可能です。 シスメックスHPより

Etest

® T. Muratani 一般細菌 5年間有効 72種類（同一薬剤で異なる濃度設定あり） TGC, DAP, MPC, CL, SPCM, MNZ, QPR/DPR, MUP, MFLX, RFP, TOB 酵母様真菌 5年間有効 AMPH-B, FLCZ, ITCZ, 5-FC, MCFG, VCZ, KCZ, CPFG RPMI1640培地（L-グルタミン添加、重炭酸無添加）＋ MOPS（0.165ｍｏｌ/L）＋2%グルコース＋ 1.5% Bactoagar （pH7.0±0.1） 抗結核薬 5年間有効

INH, EB, ETH, 7H11寒天培地

有効期間は、パックや薬剤により多少異なる。

特殊なラインナップ Etest

® T. Muratani

Etest

®

_の結果

左 2 μg/ml 右 1.5 μg/ml 左 4 μg/ml 右 3 μg/ml No. 1 No. 2 2 μg/ml 4 μg/ml 班によっては若干の違いがありました。 T. Muratani

Etest

®

の結果

No. 3 No. 4 4 μg/ml 左 3_{右 2} 4 μg/ml 左 3 右 4 Enterococcus faecalis/vanB Enterococcus faecium/vanB No.4は班によっては、8 μg/mlでした。 T. Muratani

CIM test

今回は時間が余った場合のために用意したのみです。 2月15日（水）の北九州地区の勉強会で詳細をお話します。 被検菌をTSBで一夜培養菌液に MEPMディスクを入れ、4時間インキュ ベート エーゼでMEPMディスクを引き出す 管壁で余分な液体培地を除去する ディスポエーゼでもよいが、ピンセット の方が普段慣れているはず E. coli ATCC25922を塗布したMHAに 載せる 通常のディスク拡散法と同様35℃で培 養する

T. Muratani

CIM test

E. coli Mec 7189 NDM-1, MEPM 32 μg/ml C. koseri Mck 6352 IMP-1, MEPM 1μg/ml K. pneumoniae Mkp 4811 KPC-2, MEPM 2μg/ml E. coli ATCC 25922 non-producer MEPM 0.016μg/ml 23 mm 8. 35℃で、18-24時間培養後判定する。 判定 9. 阻止円径を測定する。 1. カルバペネマーゼ陽性： < 15mmまたは 16–18mmの阻止円中にコロニー形成のみ。 「Carbapenemase検出」と報告する。 2. カルバペネマーゼ陰性： ≥ 19mm 「Carbapenemase非検出」と報告する。 3. 判定保留： 16～18mm PCRなど別法で確認 T. Muratani H COO N O S C H N H C OCH₃ O S HOOC

β-lactamase typte推定ディスク（関東化学）

ディスクA：ファロペネム ディスクB：ファロペネム＋MBL阻害剤 ディスクC：ファロペネム＋KPC阻害剤 ディスクD：ファロペネム＋AmpC阻害剤 ディスクE：テモシリン＋MBL阻害剤 H COO N O S HO O ファロペネム テモシリン 6-methoxy penicillin ESBLを含むClass A β-lactamaseに安定 ESBLに安定 T. Muratani

β-lactamase type推定ディスク （関東化学）

K. pneumoniae Mkp 4811 KPC-2, FRPM 128 µg/ml E. coli ATCC 25922 FRPM μg/ml E. coli Mec 7189 NDM-5, FRPM > 128 µg/ml E. coli Mec 4612 IMP-1, FRPM 64 µg/ml E. cloacae Mel 5787 CTX-M-15, FRPM 1 μg/ml E. cloacae Mel 4786 DHA-1, SHV-12, FRPM 16 µg/ml A B E D C T. Muratani

参加者の皆さん お疲れ様でした！