249
カンキツのコルヒチン処理により作出した
2x-4x-4x 倍数性キメラの花粉
および果実組織の倍数性と三倍体育種親としての活用
柳本裕子
1*・金好純子
1・古田貴音
2 1広島県立総合技術研究所農業技術センター果樹研究部 739-2402 広島県東広島市安芸津町三津 2広島県立総合技術研究所農業技術センター栽培技術研究部 739-0151 広島県東広島市八本松町原Polyploidy of Pollen and Fruit Tissue, and Utilization for Triploid Breeding
in 2x-4x-4x Ploidy Chimera Obtained by Colchicine Treatment of Citrus
Yuko Yanagimoto
1*, Junko Kaneyoshi
1and Takane Furuta
21Hiroshima Prefectural Agricultural Research Center the Fruit Tree Research Division,
Mitsu, Akitsu, Higashi-Hiroshima, Hiroshima 739-2402
2Hiroshima Prefectural Agricultural Research Center the Cultivation Techniques Research Division,
Hara, Hachihonmatsu, Higashi-Hiroshima, Hiroshima 739-0151
Abstract
We investigated the characteristics and polyploidy of pollen and fruit tissue in 2x-4x-4x ploidy chimeras induced by colchicine treatment of citrus. The pollen size of 2x-4x-4x ploidy chimeras and tetraploids was larger than that of diploids in all cultivars and strains that we investigated. The peel of the tetraploid fruit was thicker than that of diploids in all cultivars and strains, but a constant tendency was not seen in 2x-4x-4x ploidy chimera fruits. The flavedo, segment membranes, and juice sac showed diploidy and tetraploidy, the albedo showed tetraploidy only, and the pollen showed diploidy and tetraploidy in all 2x-4x-4x ploidy chimeras cultivars and strains. All plants raised from a seed, which we crossbred with diploid pollens in these individuals, showed triploidy. These results indicate that the 2x-4x-4x ploidy chimeras would be useful parents for triploid breeding by crossing with diploids like tetraploids.
Key Words：flow cytometry, monoembryony, seedless, tetraploid
キーワード：フローサイトメトリー，無核，単胚性，四倍体
緒 言
カンキツ類において，無核性は重要な育種目標であり， 無核性品種の育成手法の一つに三倍体の利用がある．三倍 体は，幼苗期での判定が可能で無核率が高いうえ，受粉し ても種子が入りにくい形質を維持できるため，無核性品種 の育成に多く利用されている（Cuenca ら， 2010; 金好ら， 2014; 中島ら， 2015; Recupero ら， 2007, 2008; Soost・Cameron, 1980, 1985; 徳永ら， 2005; 吉田ら， 2003）．三倍体の育成は， 特に単胚性の四倍体を種子親として二倍体の花粉を交配す れば，得られる種子はすべて雑種実生となり，多数の三倍 体が獲得できることが報告されており（Aleza ら， 2012; 金 好ら， 2008），交配親として，多様な単胚性四倍体の作出 は重要である．単胚性四倍体の作出については，多胚性品 種で行われている珠心胚実生からの四倍体の選抜（Frost, 1925; 河瀬ら， 2005; Longley, 1926; 生山， 1992）が不可能で あることから，腋芽などへのコルヒチン処理による人為的 な作出が行われてきた（Aleza ら， 2009; 金好ら， 2008; 生 山，1992）． コルヒチン処理では，四倍体や，四倍性細胞と二倍性細 胞が混在する倍数性キメラが出現するが，この倍数性キメ ラのうち，組織起源第2 層が四倍性であるものは，三倍体 を育成するための交配親として活用できることが報告され ている（金好・山口，2002; 糠谷ら，2011）．コルヒチン処 理により作出された倍数体に関して，四倍体の形態的特性 については， 生山 （1992） が ‘福原オレンジ’ （Citrus sinensis（L.） Osbeck），ヒュウガナツ（C. tamurana hort.ex Tanaka） およびクレメンティン （C. clementina hort.ex Tanaka）など で，河瀬ら（2005），糠谷ら（2011）がニンポウキンカン
（Fortunella crassifolia Swingle）で報告している．また，組
織起源第1 層（以下，L1）が二倍性，第 2 層（以下，L2） と 第3 層（以下，L3）が四倍性の倍数性キメラ（以下， 2x-4x-4x 倍数性キメラ）の形態的特性は，糠谷ら（2011）， 安田ら（2008）がニンポウキンカンで報告しているが，そ の研究事例は少ない． 2016 年 7 月 22 日 受付．2016 年 11 月 29 日 受理． 本研究の一部は第三回国際カンキツバイオテクノロジーシンポ ジウムで発表した．
一方，著者らは，1994～2003 年に生山（1992）の方法 を一部改変したコルヒチン処理法で，四倍体および倍数 性キメラを作出した（金好ら，2008）．倍数性キメラにつ いては，組織別の倍数性調査を行い，四倍体と同様に三倍 体を育成するための交配親に利用できると想定される 2x-4x-4x 倍数性キメラを選抜した．また，これらの四倍体 が二倍体と比較して有意に葉が厚く，気孔密度が低いこ と，2x-4x-4x 倍数性キメラは二倍体と比較して有意に葉が 厚いことを明らかにし，これらの特性を利用して倍数体候 補を粗選抜できることを報告した（柳本ら，2012）． 本研究では，コルヒチン処理により作出した2x-4x-4x 倍数性キメラ個体について，花粉の特性および花粉と果実 組織の倍数性を調査し，二倍体および四倍体との違いを明 らかにするとともに，これらを種子親として二倍体花粉を 交配し，得られた完全種子の倍数性を調査して，三倍体作 出の育種親としての有効性を明らかにすることを目的と した．
材料および方法
広島県立総合技術研究所農業技術センター（広島県東広 島市八本松町）にて，1994 ～ 2003 年にコルヒチン処理し た腋芽をカラタチに接木して育苗し，フローサイトメー ター（Ploidy Analyzer PA, Partec）で倍数性を確認した四倍 体および2x-4x-4x 倍数性キメラと推定した個体を供試し た．これらの倍数体は，各品種・系統の二倍体とともに， 広島県立総合技術研究所農業技術センター果樹研究部（東 広島市安芸津町）の無加温ガラス室にて45～60 L ポット で，1 品種・系統当たり 1 ～ 2 個体を育成した．各個体は， 品種・系統ごとの適正葉果比に基づいて摘果し，10 果未 満の着果を維持した．供試した品種・系統は第1 表に記し た．対照は，同ガラス温室内で育苗した各品種・系統の二 倍体とした． 1．2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体の花粉の特性 2013～2014 年に，第 1 表の 2x-4x-4x 倍数性キメラ 5 品 種・系統および四倍体9 品種・系統の花粉特性を調査し た．花粉量は，種苗特性分類調査報告書・カンキツ類（愛 媛県立果樹試験場，1994）の定義により，無，少，中，多 の四段階で評価した．花粉粒径と花粉稔性については，開 花直前の花蕾を4～5 月に各品種・系統とも 5 個以上採取 し，25°C 10 時間日長に設定した人工気象室内で開葯した 花粉を–30°C で冷凍保存し，3 か月後に解凍して 1％アセ トカーミン液で染色して観察した．花粉粒径は，花粉粒の 垂直に交わる2 つの直径の平均値とし，1 反復当たり 10 粒 を調査し，5 反復とした．花粉稔性は，1 反復当たり 500 粒を調査し，5 反復とした． 2．2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体の果実形質 2007～2013 年に，第 1 表の 2x-4x-4x 倍数性キメラ 7 品 種・系統および四倍体9 品種・系統について，完熟した 3～5 果の自然受粉による果実を採取し，果実重，果実縦 径，果実横径，果形指数，果皮厚，果皮重，果肉歩合，完 第1 表 供試品種一覧 品種・系統 交配組合せ 学名 胚数 供試個体の倍数性大橘 Citrus maxima （Burm.） Merr. 単胚 四倍体
水晶文旦 Citrus maxima （Burm.） Merr. 単胚 四倍体
土佐文旦 Citrus maxima （Burm.） Merr. 単胚 キメラz
農間紅八朔 Citrus hassak hort.ex Tanaka 単胚 四倍体， キメラ 西之香 清見 × トロビタオレンジ （Citrus unshiu Marcow. × Citrus sinensis （L.）
Osbeck） × Citrus sinensis （L.） Osbeck 単胚 四倍体 ありあけ 清家ネーブル × クレメン
ティン Citrus sinensis （L.） Osbeck × Citrus clementina hort.ex Tanaka 単胚 四倍体
清見 宮川早生 × トロビタオレンジ Citrus unshiu Marcow. × Citrus sinensis （L.） Osbeck 単胚 四倍体 広島果研11 号 清見 × サザンレッド （Citrus unshiu Marcow. × Citrus sinensis （L.）
Osbeck） × （（Citrus unshiu Marcow. × Citrus nobilis Loureiro） × Citrus reticulata Blanco）
単胚 四倍体， キメラ 安芸タンゴール 興津早生 × トロビタオレンジ Citrus unshiu Marcow. × Citrus sinensis （L.） Osbeck 単胚 四倍体， キメラ
はれひめ E-647（清見 × オセオラ）
× 宮川早生 （（Osbeck） × （Citrus clementina hort.ex Tanaka × Citrus unshiu Marcow. × Citrus sinensis （L.）
（Citrus paradisi Macfadyen × Citrus tangerina Tanaka）））
× Citrus unshiu Marcow.
単胚 四倍体， キメラ
はるか 日向夏の自然交雑実生 Citrus tamurana hort.ex Tanaka 多胚 四倍体， キメラ 不知火 清見 × 中野 3 号ポンカン （Citrus unshiu Marcow. × Citrus sinensis （L.）
Osbeck） × Citrus reticulata Blanco 多胚 キメラ はるみ 清見 × ポンカン F-2432 （Citrus unshiu Marcow. × Citrus sinensis （L.）
Osbeck） × Citrus reticulata Blanco 多胚 キメラ
石地 Citrus unshiu Marcow. 多胚 四倍体， キメラ
道谷系ビラフランカ Citrus limon （L.） Burn.f. 多胚 四倍体
全種子数，不完全種子（縦径8 mm 以上）数および完全種 子重を調査した． 3．2x-4x-4x 倍数性キメラの組織別倍数性 第1 表の 2x-4x-4x 倍数性キメラ 7 品種・系統および四倍 体7 品種・系統の果実について，フラベド，アルベド， じょうのう膜および砂じょうを，それぞれ5 mm 角で取り 出 し，4’,6-Diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride（以 下， DAPI）を 2 mg・L–1添加した核単離液（Tris 塩酸：10 mM，
Sodium Citrate：50 mM，MgCl2：2 mM，Poly vinyl
pyr-rolidone K-30：1％，Triton X-100：0.1％，pH 7.5 の混合液） を1 mL 加え，シャーレ上にてカミソリで 10～20 回粗く 刻み，30 μm メッシュのフィルターでろ過してフローサイ トメーターにより倍数性を判定した．花粉は，粒径および 稔性を調査したものと同じものを解凍し，フロストスライ ドグラスのスリ面上に3～5 個の葯を置き，DAPI 添加核 単離液0.1 mL を加えて葯から花粉を取り出し，他のフロ ストスライドグラスのスリ面で花粉をすり潰した．さらに DAPI 添加核単離液 1 mL を加えて 30 μm メッシュのフィル ターでろ過し，フローサイトメーターにより倍数性を測定 した． 4．2x-4x-4x 倍数性キメラを種子親とした二倍体との交雑 による三倍体の作出 単胚性の2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体，多胚性 である‘道谷系ビラフランカ’の四倍体を種子親とし，二 倍体の‘大橘’を花粉親として交配を行った．なお，四倍 体の‘道谷系ビラフランカ’は，これまでの調査で単胚率 が94％であり，得られた実生はすべて雑種であることを 確認している．また，対照として，同一品種の二倍体にも 二倍体の‘大橘’の花粉を交配した．交配で得られた果実 は，完全種子数および不完全種子数を測定し，完全種子に ついては種子重を測定した．完全種子はバーミキュライト に播種し，得られた実生について，葉の倍数性をフローサ イトメーターにより判定した．
結 果
1．2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体の花粉の特性 2x-4x-4x 倍数性キメラ個体の花粉は，供試したすべての 品種・系統において，二倍体と比較して花粉粒径が有意に 大きく，二倍体の1.2～1.3 倍であった（第 2 表，第 1 図）． また，花粉稔性は， ‘土佐文旦’，‘広島果研11 号’，‘安芸タ ンゴール’が二倍体と比較して有意に低く，‘はるか’ と ‘不知火’は有意差がなかった．四倍体の花粉は，供試し たすべての品種・系統において，二倍体と比較して花粉粒 径が有意に大きく，二倍体の1.1～1.4 倍であった（第 3 表，第2 図）．また，‘道谷系ビラフランカ’を除く 8 品 種・系統において花粉稔性が二倍体と比較して有意に低 かった． 2．2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体の果実形質 2x-4x-4x 倍数性キメラ個体の果実は，供試した 7 品種の うち3 品種で二倍体と比較して果皮が有意に厚く，5 品種 で二倍体と比較して果肉歩合が有意に低かったが，その他 の果実形質においては品種・系統によって傾向が異なった （第4 表，第 3 図）．四倍体の果実は，供試したすべての品 種・系統で，二倍体と比較して果皮が有意に厚かった（第 第2 表 コルヒチン処理により得られた 2x-4x-4x 倍数性キメ ラの花粉特性 品種・系統 個体の倍数性 花粉量z 花粉 y 粒径 （μm） 稔性 （％） 土佐文旦 2x 多 33.5 93.2 キメラx 多 41.9 **w 78.9 ** 広島果研11 号 2x 中 30.3 96.4 キメラ 中 38.2 ** 17.8 ** 安芸タンゴール 2x 中 31.7 69.9 キメラ 中 42.3 ** 17.3 ** はるか 2x 多 31.8 94.0 キメラ 多 40.2 ** 91.2 不知火 2x 少 29.6 80.5 キメラ 少 34.6 * 82.1 z 種苗特性分類調査報告書（カンキツ類）の定義による無， 少， 中， 多の四段階評価 y 1％アセトカーミンによる染色 x 茎 頂 分 裂 組 織 第 1 層 が 2x， 第 2 層 が 4x， 第 3 層 が 4x の 2x-4x-4x 周縁キメラと推定した個体 w ** および * はステューデントの t 検定により同一品種・系 統内でそれぞれ1％および 5％水準で有意差があることを 示す 第1 図 ‘土佐文旦’における （A） 二倍体，（B） 2x-4x-4x 倍数性キメラの 1％アセトカーミンで染色した花粉5 表，第 3 図）．また，‘水晶文旦’を除く 8 品種・系統で， 二倍体と比較して果肉歩合が低かった．その他の果実形質 においては品種・系統によって傾向が異なった． 3．2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体の組織別倍数性 フローサイトメトリー分析では，二倍体花粉の相対蛍光 強度が半数性と二倍性のピークを示すのに対し，2x-4x-4x 倍数性キメラの‘土佐文旦’，‘はるか’および四倍体の ‘大橘’，‘農間紅八朔’の花粉は，いずれも二倍性と四倍 性のピークを示した（第6 表，第 4 図）． 果実組織の倍数性において，二倍体の果実は，フラベ ド，アルベド，じょうのう膜，砂じょうのいずれも二倍 性，四倍体の果実はいずれの組織も四倍性，2x-4x-4x 倍数 性キメラ個体の果実は，フラベド，じょうのう膜および砂 じょうで二倍性と四倍性，アルベドは四倍性のみを示した （第6 表，第 5 図）． 4．2x-4x-4x 倍数性キメラを種子親とした二倍体との交雑 による三倍体の作出 4 品種・系統の 2x-4x-4x 倍数性キメラ個体および 8 品 種・系統の四倍体を種子親とした二倍体‘大橘’との交雑 において， ‘農間紅八朔’， ‘清見’， ‘西之香’ および‘はれ ひめ’は，二倍体を種子親とした場合と比較して有意に完 全種子数が少なく，完全種子重が軽かった（第7 表）．ま た，得られた種子を播種して育成した実生において，二倍 体を種子親とした実生の調査個体はすべて二倍体であり， 第3 表 コルヒチン処理により得られた四倍体の花粉特性 品種・系統 個体の倍数性 花粉量z 花粉 y 粒径 （μm） 稔性 （％） 大橘 2x 多 34.7 93.9 4x 多 41.9 **w 84.2 ** 水晶文旦 2x 多 34.4 94.7 4x 多 45.0 ** 67.0 ** 農間紅八朔 2x 多 32.6 94.1 4x 多 40.4 ** 87.1 * 西之香 2x 中 30.2 87.0 4x –x 41.5 * 33.3 ** ありあけ 2x 中 32.4 68.7 4x – 43.1 ** 37.7 ** 広島果研11 号 2x 中 31.1 95.3 4x 中 44.2 ** 11.2 ** 安芸タンゴール 2x 中 30.5 80.6 4x 中 39.7 ** 18.6 ** はるか 2x 多 32.2 93.8 4x 多 41.3 ** 87.0 * 道谷系 ビラフランカ 2x 多 35.5 53.8 4x 多 40.8 * 62.0 z 種苗特性分類調査報告書（カンキツ類）の定義による無， 少， 中， 多の四段階評価 y 1％アセトカーミンによる染色 x – はデータがないことを示す w ** および * はステューデントの t 検定により同一品種・系 統内でそれぞれ1％および 5％水準で有意差があることを 示す 第2 図 ‘大橘’における （A） 二倍体，（B） 四倍体の 1％アセトカーミンで染色した花粉 第3 図 ‘広島果研 11 号’ における （A） 二倍体，（B）四倍体，（C） 2x-4x-4x 倍数性キメラの果実
2x-4x-4x 倍数性キメラ個体を種子親とした実生の調査個体 は，四倍体を種子親とした実生と同様に，すべてが三倍体 であった．
考 察
カンキツ類では，これまでにコルヒチン処理などにより 第4 表 コルヒチン処理により得られた 2x-4x-4x 倍数性キメラの自然受粉による果実特性 品種・系統 個体の倍数性 果実数 収穫時期 果実重（ g） 果実径（mm） 果形 指数z （果皮厚mm） 果皮重（g） 果肉 歩合y （％） 1 果当たり種子数 完全 種子重 （g） 縦径 横径 完全 不完全x 土佐文旦 2x 5 2 月上旬 372.4 83.3 104.9 126.1 8.4 122.4 67.1 18.0 38.2 0.27 キメラw 5 403.9 *v 86.7 106.2 122.6 9.3 * 140.8 ** 65.1 19.0 26.8 0.25 広島果研11 号 2x 5 12 月上旬 167.9 61.1 72.0 117.9 3.7 35.3 78.9 3.8 10.8 0.23 キメラ 5 142.2 56.3 69.1 122.8 4.8 * 53.4 70.0 ** 4.2 1.2 ** 0.27 安芸タンゴール 2x 5 12 月上旬 183.1 62.5 75.7 121.3 3.1 30.6 83.4 9.4 18.4 0.23 キメラ 5 126.6 ** 58.6 64.5 ** 110.2 ** 3.6 28.1 77.8 ** 7.0 7.6 ** 0.10 ** はれひめ 2x 5 12 月上旬 111.0 53.3 66.6 125.3 4.4 34.3 68.9 12.6 5.2 0.18 キメラ 5 146.4 * 60.2 ** 71.9 119.4 5.5 ** 54.9 ** 62.8 * 3.2 * 0.4 * 0.08 ** はるか 2x 5 2 月上旬 221.4 74.7 81.9 109.6 5.9 75.1 66.1 12.6 25.4 0.12 キメラ 5 146.6 ** 64.0 ** 70.4 ** 110.0 6.5 58.4 * 60.4 * 4.0 9.0 ** 0.06 不知火 2x 5 12 月上旬 176.2 69.7 72.0 103.5 3.9 43.2 75.5 0.0 0.0 –u キメラ 5 228.1 ** 79.6 80.4 * 102.4 4.0 60.9 * 73.5 3.8 * 0.0 0.20 はるみ 2x 5 12 月上旬 162.4 62.8 75.9 120.9 3.4 34.3 78.9 3.6 0.6 0.10 キメラ 5 141.2 62.0 71.8 115.9 4.1 36.8 74.2 * 0.4 0.0 0.04 z （横径／縦径） × 100 y （果実重－果皮重）／果実重 × 100 x 不完全種子のうち縦径 8 mm 以上の種子数 w 茎頂分裂組織第 1 層が 2x， 第 2 層が 4x， 第 3 層が 4x の 2x-4x-4x 周縁キメラと推定した個体 v ** および * はステューデントの t 検定により同一品種・系統内でそれぞれ 1％および 5％水準で有意差があることを示す u – はデータがないことを示す 第5 表 コルヒチン処理により得られた四倍体の自然受粉による果実特性 品種・系統 個体の 倍数性 果実 数 収穫時期 果実重 （g） 果実径（mm） 果形 指数z 果皮厚 （mm） 果皮重（g） 果肉 歩合y （％） 1 果当たり種子数 完全 種子重 （g） 縦径 横径 完全 不完全x 大橘 2x 5 2 月上旬 294.5 79.7 95.4 119.9 8.4 102.1 65.3 23.4 52.6 0.17 4x 5 454.6 **w 95.9 ** 114.7 ** 119.7 12.2 ** 187.8 ** 58.7 ** 15.6 29.6 0.24 ** 水晶文旦 2x 5 2 月上旬 365.2 83.6 111.2 132.9 11.3 149.6 58.7 14.4 5.6 0.39 4x 5 486.1 * 91.1 117.3 128.9 13.0 * 198.3 59.4 13.4 23.6 ** 0.29 * 農間紅八朔 2x 4 2 月上旬 361.8 96.0 78.6 122.4 6.6 89.8 75.2 1.3 1.0 –v 4x 3 442.9 104.4 85.2 123.0 10.2 * 169.8 * 61.9 * 7.3 ** 2.7 – 西之香 2x 5 12 月上旬 166.9 69.4 70.3 101.3 3.2 30.3 82.0 2.0 2.4 0.17 4x 5 122.2 ** 61.5 ** 63.3 * 103.1 4.4 ** 34.0 72.3 ** 1.0 2.4 0.14 ありあけ 2x 4 12 月上旬 81.4 54.3 55.1 101.6 4.1 24.4 70.4 3.3 2.5 0.14 4x 4 82.5 56.5 54.6 96.5 4.8 * 30.5 62.8 * 0.5 * 1.3 0.17 広島果研11 号 2x 5 12 月上旬 167.9 61.1 72.0 117.9 3.7 35.3 78.9 3.8 10.8 0.23 4x 5 175.8 60.6 74.3 122.5 5.0 ** 43.4 70.4 ** 4.0 7.0 0.19 安芸タンゴール 2x 5 12 月上旬 183.1 62.5 75.7 121.3 3.1 30.6 83.4 9.4 18.4 0.23 4x 5 234.4 * 69.6 83.6 * 120.7 5.6 ** 74.6 ** 68.3 ** 3.4 * 14.2 0.10 ** はれひめ 2x 5 12 月上旬 111.0 53.3 66.6 125.3 4.4 34.3 68.9 12.6 5.2 0.18 4x 5 133.8 56.4 70.4 125.3 6.1 ** 57.4 ** 57.2 ** 2.8 * 0.4 * 0.14 道谷系 ビラフランカ 2x4x 53 2 月上旬 125.9193.3 93.377.7 60.168.7 74.277.5 10.3 ** 122.1 ** 37.0 ** 18.35.0 43.2 65.7 14.0 4.32.4 –– z （横径／縦径） × 100 y （果実重－果皮重）／果実重 × 100 x 不完全種子のうち縦径 8 mm 以上の種子数 w ** および * はステューデントの t 検定により同一品種・系統内でそれぞれ 1％および 5％水準で有意差があることを示す v – はデータがないことを示す多くの品種で四倍体や2x-4x-4x 倍数性キメラ個体が得ら れ，その特性調査が行われている．四倍体の花粉について は，コルヒチン処理によって作出された四倍体の‘福原オ レンジ’，ヒュウガナツ，クレメンティン（生山，1992）， ニンポウキンカン（河瀬ら，2005; 糠谷ら，2011）におい て，2x-4x-4x 倍数性キメラの花粉については，ニンポウ キンカン（糠谷ら，2011; 安田ら，2008）において，花粉 粒径が二倍体と比較して有意に大きいことが報告されてい る．本報告では，供試した2x-4x-4x 倍数性キメラおよび 四倍体のすべての品種・系統において花粉粒径が二倍体と 比較して有意に大きく，カンキツ属の2x-4x-4x 倍数性キ メラでも，四倍体と同様に花粉が大きくなることが明らか になった．これらのことから，花粉粒径は，四倍体および 2x-4x-4x 倍数性キメラと二倍体とを明確に識別できる基準 の一つと考えられた． カンキツの同質四倍体では，花粉形成における減数分裂 の過程で異常が起こるため，花粉稔性が低下することが知 ら れ て い る（Frost・Soost, 1968）．本報告では，2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体のいずれにおいても，花粉量が 多い‘大橘’， ‘水晶文旦’， ‘農間紅八朔’， ‘はるか’および ‘道谷系ビラフランカ’ の花粉稔性の低下程度は小さい， あるいは低下しなかった．一方で，花粉量が中の‘西之 香’， ‘ありあけ’， ‘広島果研11 号’ および‘安芸タンゴー ル’の花粉稔性は大幅に低下した．このように，‘不知火’ を除く10 品種は，花粉量によって花粉稔性の低下程度が 異なることが示唆された． 花粉の倍数性においては，フローサイトメーターによる 分析で，二倍体の花粉が半数性と二倍性の2 つのピーク， 2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体の花粉が二倍性と四倍 性の2 つのピークを示した．一般に，カンキツ類などの二 核性花粉は，開葯した時点は2 細胞であるが，受粉して花 粉が発芽すると花粉管中で生殖核が2 つの精核になり，こ の開葯直後における生殖核が精核に分裂する直前の段階で は，生殖核のDNA 量は二倍になることが知られている （岩波， 1980）．二核性花粉であるユリ（van Tuyl ら， 1989） やシクラメン（高村・吉村，2007）では，フローサイト メーターによる分析で，栄養核（後の花粉管核）のピーク と二倍量となった生殖核のピークが現れることが明らかに なっており，本報告でも同様の分析結果が得られた．ま た，2x-4x-4x 倍数性キメラの花粉が四倍体と同様に二倍性 と四倍性の2 つのピークを示したことから，三倍体育成の 花粉親として活用できることが示唆された．これまでに， 第6 表 コルヒチン処理により得られた 2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体の果実組織および花粉の倍数性 品種・系統 個体の倍数性 果実組織の倍数性 花粉 フラベド アルベド じょうのう膜 砂じょう 大橘 2x 2x 2x 2x 2x x， 2x 4x 4x 4x 4x 4x 2x， 4x 土佐文旦 2x 2x 2x 2x 2x x， 2x キメラz 2x， 4x 4x 2x， 4x 2x， 4x 2x， 4x 農間紅八朔 2x 2x 2x 2x 2x x， 2x 4x 4x 4x 4x 4x 2x， 4x 広島果研11 号 2x 2x 2x 2x 2x –y 4x 4x 4x 4x 4x キメラ 2x， 4x 4x 2x， 4x 2x， 4x 安芸タンゴール 2x 2x 2x 2x 2x – 4x 4x 4x 4x 4x キメラ 2x， 4x 4x 2x， 4x 2x， 4x はれひめ 2x 2x 2x 2x 2x – 4x 4x 4x 4x 4x キメラ 2x， 4x 4x 2x， 4x 2x， 4x はるか 2x 2x 2x 2x 2x x， 2x キメラ 2x， 4x 4x 2x， 4x 2x， 4x 2x， 4x 不知火 2x 2x 2x 2x 2x – キメラ 2x， 4x 4x 2x， 4x 2x， 4x 石地 2x 2x 2x 2x 2x – 4x 4x 4x 4x 4x キメラ 2x， 4x 4x 2x， 4x 2x， 4x 道谷系ビラフランカ 2x 2x 2x 2x 2x – 4x 4x 4x 4x 4x z 茎頂分裂組織第 1 層が 2x， 第 2 層が 4x， 第 3 層が 4x の 2x-4x-4x 周縁キメラと推定した個体 y – はピークが検出されなかったことを示す
花粉のフローサイトメーターによる倍数性分析は，ユリ （van Tuyl ら， 1989）やシクラメン（高村・吉村， 2007）な どで報告されているが，上記のとおりカンキツにおいても 分析が可能であることが明らかとなった． 四倍体および2x-4x-4x 倍数性キメラ個体の果実では， 河瀬ら（2005），糠谷ら（2011），安田ら（2008）が，ニン ポウキンカンの果実が二倍体と比較して有意に重く，果皮 が 厚 く， 果 皮 歩 合 が 高 い こ と を 報 告 し て い る． ま た， Cameron・Frost（1968）は，カンキツの四倍体果実が二倍 体と比較して果皮が厚く，果汁割合が低いことを報告して いる．本報告においては，四倍体は二倍体と比較して有意 に果皮が厚いが，その他の形質は品種・系統によって異 なった．また，2x-4x-4x 倍数性キメラ個体でも，品種・系 統によって傾向が異なっていた． カンキツにおいては，各組織のDNA 分析により，L1 由 来の組織は表皮系，じょうのう膜および砂じょうであるこ と，L2 由来の組織は表皮を除いた葉の大部分，花粉など の生殖器官，じょうのう膜および砂じょうの一部であるこ と，L3 由来の組織は茎や葉のずいと果心の一部であるこ とが示唆されている（Sugawara ら，2002）．一方で，ニン ポウキンカンの倍数性周縁キメラ‘勇紅’においては，砂 じょうはL1 のみから由来した組織であることが報告され ている（安田ら，2008）．本報告で供試した品種・系統で は，2x-4x-4x 倍数性キメラ個体の果実は，いずれもフラベ ド，じょうのう膜および砂じょうが二倍性と四倍性を示 し，フラベド，じょうのう膜および砂じょう組織がL1 と L2 由来であることが裏付けられた． 単胚性の2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体を種子親 とし，二倍体‘大橘’を花粉親とした交配で得られた完全 種子数は，‘農間紅八朔’， ‘西之香’， ‘清見’および‘はれ ひめ’で同一品種の二倍体を種子親とした交配で得られた 完全種子数と比較して有意に少なかった．これは，ニンポ ウキンカンにおける安田ら（2008）の報告と同様の結果で あった．完全種子数が減少した要因は，交配に使用した二 第4 図 ‘はるか’における花粉の倍数性 （A）二倍体，（B）四倍体，（C） 2x-4x-4x 倍数性キメラ （A） のピーク 1 は半数性， ピーク 2 は二倍性， （B） およ び（C） のピーク 2 は二倍性，ピーク 3 は四倍性を示す 第5 図 2x-4x-4x 倍数性キメラ‘広島果研 11 号’における果 実の組織別倍数性 （A） フラベド，（B） アルベド，（C） じょうのう膜，（D） 砂じょう （A）， （C）， （D） のピーク 1 は二倍性，ピーク 2 は四倍 性，（B） のピーク 2 は四倍性を示す
倍体‘大橘’の花粉稔性が十分に高いため，2x-4x-4x 倍数 性キメラおよび四倍体の雌性器官の稔性低下に起因すると 推 察 さ れ た． ま た， こ の4 品 種 で は， 完 全 種 子 は， 2x-4x-4x 倍数性キメラ × 二倍体および四倍体 × 二倍体が二 倍体 × 二倍体と比較して有意に軽く，交配で得られた完全 種子を播種して育成した実生は三倍体であった．カンキツ の四倍体 × 二倍体，二倍体 × 二倍体で生じる三倍体が小粒 となるのは，胚と胚乳の倍数性比によるものと考えられて おり（Esen・Soost, 1973），本報告で供試した品種・系統 においても同様の要因により，三倍体である完全種子が小 粒 に な っ た と 推 察 さ れ た． さ ら に， 上 記4 品種を含む 2x-4x-4x 倍数性キメラ × 二倍体および四倍体 × 二倍体で得 られた実生は，すべて三倍体であった．これらの交配結果 から，2x-4x-4x 倍数性キメラは四倍体と同様に，三倍体作 出の種子親として有用であることが示唆された．なお，本 報告で供試した2x-4x-4x 倍数性キメラは，作出から 13 ～ 22 年経過しており，この間は倍数性構造を維持している と考えられるが，今後の栽培過程で構造が変化する可能性 もあるため，継続的な倍数性の確認が必要である． 以上より，コルヒチン処理によって得られた四倍体9 品 種・系統および2x-4x-4x 倍数性キメラ個体 5 品種・系統の 花粉粒は，二倍体と比較して有意に大きいことが明らかと なり，花粉粒の大きさは，前報（柳本ら，2012）で述べた 葉の厚さと同様に，二倍体と識別する特性であることを多 数の品種で確認することができた．また，2x-4x-4x 倍数性 キメラ個体の花粉は，フローサイトメーターにより四倍体 と同様の相対蛍光強度を示し，種子親として二倍体との交 配により得られた実生が三倍体であったことから，四倍体 と同様に，三倍体育成の育種親として利用できることが明 らかとなった．
摘 要
コルヒチン処理により得られた5 品種・系統の 2x-4x-4x 倍数性キメラおよび9 品種・系統の四倍体について，花粉 の形態的特性と倍数性を調査した．供試した2x-4x-4x 倍 数性キメラおよび四倍体のすべての品種・系統で，花粉粒 が二倍体よりも有意に大きく，11 品種・系統で花粉稔性 が低かった．このことより，花粉粒の大きさは，二倍体と 明確に識別できる特性であることが示唆された．また，7 品種・系統の2x-4x-4x 倍数性キメラおよび 9 品種・系統の 四倍体について，果実形質と組織別倍数性の調査を行っ た．調査したすべての四倍体で果皮が二倍体よりも厚かっ たが，2x-4x-4x 倍数性キメラでは，品種・系統によって傾 向は異なった．フローサイトメーターによる倍数性の分析 では，2x-4x-4x 倍数性キメラ果実の組織別倍数性は，供試 した7 品種・系統とも，フラベド，じょうのう膜，砂じょ うで二倍性と四倍性の2 つのピークを，アルベドでは四倍 性のピークのみを示した．花粉は，2x-4x-4x 倍数性キメラ と四倍体はいずれも二倍性と四倍性の2 つのピークを示し た．2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体を種子親とし，二 第7 表 コルヒチン処理により得られた 2x-4x-4x 倍数性キメラおよび四倍体を種子親とした二倍体‘大橘’との交 雑による種子形成と実生の倍数性 品種・系統 個体の倍数性 個体数 果実数調査 1 果当たり種子数 完全 種子重 （g） 調査 実生数 出現数 完全 不完全z 2x 3x 大橘 4x 2 4 9.5 8.0 0.23 12 0 12 水晶文旦 4x 3 15 4.4 2.7 0.19 44 0 44 農間紅八朔 2x 1 3 21.0 15.0 0.15 9 9 0 4x 1 7 2.1 **x 3.4 ** 0.06 ** 8 0 8 キメラy 1 5 4.6 ** 2.0 ** 0.04 ** –w – – 西之香 2x 1 14 7.2 0.2 0.13 32 32 0 4x 1 5 0.5 * 0.3 0.07 * 3 0 3 清見 2x 1 16 28.0 1.6 0.25 48 48 0 4x 5 37 7.8 ** 0.4 * 0.07 ** 105 0 105 広島果研11 号 4x 2 5 2.7 20.7 0.16 10 0 10 キメラ 2 4 2.8 23.5 0.12 9 0 9 安芸タンゴール 4x 3 22 3.5 3.6 0.08 66 0 66 キメラ 4 31 3.9 3.1 0.09 49 0 49 はれひめ 2x 1 2 6.5 0.0 0.25 6 6 0 キメラ 1 14 4.6 * 0.1 0.06 ** 29 0 29 道谷系ビラフランカ 4x 1 3 11.7 5.3 0.08 9 0 9 z 不完全種子のうち縦径 8 mm 以上の種子数 y 茎頂分裂組織第 1 層が 2x， 第 2 層が 4x， 第 3 層が 4x の 2x-4x-4x 周縁キメラと推定した個体 x ** および * はステューデントの t 検定により同一品種・系統内で二倍体と倍数体の間にそれぞれ 1％および 5％水 準で有意差があることを示す w – はデータがないことを示す倍体‘大橘’を花粉親とした交配によって得られた実生は 三倍体であり，四倍体と同様に，2x-4x-4x 倍数性キメラは 三倍体を作出する育種親として有効であることを明らかに した． 謝 辞 本研究を行うに当たり，懇切なご指導，ご校閲 を賜った京都大学大学院農学研究科教授 北島 宣博士に 厚くお礼申し上げる．
引用文献
Aleza, P., J. Juarez, P. Ollitrault and L. Navarro. 2009. Produc-tion of tetraploid plants of non-apomictic citrus genotypes. Plant Cell Rep. 28: 1837–1846.
Aleza, P., J. Juarez, M. Hernandez, P. Ollitrault and L. Navarro. 2012. Implementation of extensive citrus triploid breeding programs based on 4x × 2x sexual hybridisations. Tree Genet. Genomes 8: 1293–1306.
Cameron, J. W. and H. B. Frost. 1968. Genetics, breeding, and nucellar embryony. p. 325–370. In: Reuther, W., L. D. Batchelor and H. J. Webber (eds.). The Citrus Industry vol II. University of California, Division of Agricultural Sciences, California.
Cuenca, J., P. Aleza, J. Juarez, J. A. Pina and L. Navarro. 2010. ‘Safor’mandarin: a new citrus mid-late triploid hybrid. HortScience 45: 977–980.
愛 媛 県 立 果 樹 試 験 場．1994．種苗特性分類調査報告書 （カンキツ類）．p. 4．
Esen, A. and R. K. Soost. 1973. Seed development in citrus with special reference to 2x × 4x crosses. Amer. J. Bot. 60: 448– 462.
Frost, H. B. 1925. Tetraploidy in citrus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 11: 535–537.
Frost, H. B. and R. K. Soost. 1968. Seed reproduction: Development of gametes and embryos. p. 290–324. In: Reuther, W., L. D. Batchelor and H. J. Webber, (eds.). The Citrus Industry vol II. University of California, Division of Agricultural Sciences, California.
岩波洋造．1980．花粉学．p. 5–18．講談社．東京． 金好純子・古田貴音・蔵尾公紀・山口 聡．2008．単胚性 カンキツにおけるコルヒチン処理による四倍体の作出 とその種子親としての利用による三倍体の獲得．園学 研．7: 5–10. 金好純子・古田貴音・塩田 俊・赤阪信二・柳本裕子・栗 久宏昭．2014．レモン自然交雑実生における三倍体の 出現と新品種‘イエローベル’の育成．園学研．13: 19–26. 金好純子・山口 聡．2002．コルヒチン処理により得られ たカンキツキメラ個体の倍数性構造と交配親としての 活用．園学雑．71（別 2）: 229. 河瀬憲次・八幡昌紀・中川匠子・原口加奈・國武久登． 2005．ニンポウキンカンにおける同質四倍体の選抜と その特性．園学研．4: 141–146.
Longley, A. E. 1926. Triploid citrus. J. Wash. Acad. Sci. 16: 543–545. 中島光廣・徳永忠士・新居美香・津村哲宏・山本浩史・坂 口 優・山尾正実．2015．三倍体香酸カンキツ新品種 ‘阿波すず香’の育成．徳島農林水総技支援セ農研報． 2: 9–12. 糠谷綱希・太田知宏・安田喜一・八幡昌紀・國武久登・小 松春喜・新居直祐・向井啓雄・原田 久・高木俊彦． 2011．ニンポウキンカン珠心胚へのコルヒチン処理に よって得た倍数体の特性とそれらの三倍体育種への利 用．園学研．10: 1–8. 生山 巌．1992．カンキツ類の倍数性育種に関する研究― 主として四倍性育種素材の作出について―．果樹試特 報．3: 1–68.
Recupero, G. R., G. Russo and S. Recupero. 2007. ‘Yellow Star Seedless’. US PP17,520 P3.
Recupero, G. R., G. Russo and S. Recupero. 2008. ‘Top Mandarin Seedless’. US PP18,568 P3.
Soost, R. K. and J. W. Cameron. 1980. ‘Oroblanco’ a triploid pummelo-grapefruit hybrid. HortScience 15: 667–669. Soost, R. K. and J. W. Cameron. 1985. ‘Melogold’ a triploid
pummelo-grapefruit hybrid. HortScience 20: 1134–1135. Sugawara, K., T. Wakizuka and A. Oowada. 2002. Histogenic
identification by RAPD analysis of leaves and fruit of newly synthesized chimeric citrus. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 127: 104–107. 高村武二郎・吉村奈津紀．2007．フローサイトメトリーを 用いたシクラメン植物体および花粉の倍数性検定．香 川大農学報．59: 49–53. 徳永忠士・新居美香・津村哲宏・山尾正実．2005．スダチ における四倍体と二倍体との交雑による三倍体雑種の 作出および無核品種‘徳島3X1 号’の育成．園学研． 4: 11–15.
van Tuyl, J. M., J. N. de Vries, R. J. Bino and T. A. M. Kwakkenbos. 1989. Identification of 2n-pollen producing interspecific hybrids of Lilium using flow cytometry. Cytologia 54: 737–745. 柳本裕子・金好純子・古田貴音・北野剛志．2012．カンキ ツのコルヒチン処理により作出した四倍体および倍数 性キメラの形態的特性．園学研．11: 449–457. 安田喜一・國武久登・中川匠子・黒木宏憲・八幡昌紀・平 田力也・吉倉幸博・川上郁夫・杉本安寛．2008．ニン ポウキンカン‘勇紅’の倍数性キメラの証明とその形 態的特性．園学研．7: 165–171. 吉田俊雄・根角博久・吉岡照高・家城洋之・伊藤祐司・中 野睦子・上野 勇・山田彬雄・村瀬昭治・瀧下文孝． 2003．キンカン新品種‘ぷちまる’．果樹研報．2: 9–16.
