ナイトロオキサイドを用いたアトピー性皮膚炎モデルマウスにおける生体内酸化還元バランスの非侵襲的評価

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(1)Title. ナイトロオキサイドを用いたアトピー性皮膚炎モデルマウスにおける生体内酸化還元バランスの非侵襲的評価. Author(s). 神林, 勲; 沢村, 祥子; 塚本, 未来; 木本, 理可; 東郷, 将成; 秋月, 茜; 内田, 英二. Citation. 北海道教育大学紀要. 自然科学編, 67(2): 35-42. Issue Date. 2017-02. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/8213. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) 北海道教育大学紀要（自然科学編）第67巻第₂号 Journal of Hokkaido University of Education（Natural Sciences）Vol. 67, No.2. 平成 29 年 ₂ 月 February, 2017. ナイトロオキサイドを用いたアトピー性皮膚炎モデルマウスにおける生体内酸化還元バランスの非侵襲的評価神林勲・沢村祥子*・塚本未来**・木本理可***・東郷将成†・秋月茜††・内田英二††† 北海道教育大学札幌校 *. 北海道教育大学岩見沢校卒業生 **. 東海大学国際文化学部. ***. 旭川工業高等専門学校. †. 酪農学園大学大学院博士課程. ††. 北海道医療大学大学院博士課程 †††. 大正大学心理社会学部. Noninvasive Evaluation of in vivo Redox Balance in Atopic Inflammatory Model Mice by Nitroxide Spin Probe Method KAMBAYASHI Isao, SAWAMURA Shoko*, TSUKAMOTO Miku**, KIMOTO Rika***, TOGO Masanari†, AKIZUKI Akane†† and UCHIDA Eiji††† Sapporo Campus, Hokkaido University of Education *. A graduate of Sports Education Department, Iwamizawa Campus, Hokkaido University of Education **. School of International Culture Relations, Tokai University ***. Asahikawa National College of Technology. †. Graduate School of Dairy Sciences, Rakuno Gakuen University. ††. Graduate School of Rehabilitation Sciences, Health Sciences University of Hokkaido. †††. Department of Human Science, Faculty of Psychology and Sociology, Taisho University. Abstract Atopic dermatitis（AD）is a chronic relapsing inflammatory skin disorder in which reactive oxygen species（ROS）may be involved. We hypothesized that inflammatory response of AD does not only increase in dermis but also in vivo for AD. In this study, ADlike lesions were induced experimentally in NC/Nga mice using 2,4,6-trinitrochloro benzene （TNCB）.The in vivo electron paramagnetic resonance（EPR）/nitroxide spin probe method was used to analyze the redox status. A redox-sensitive nitroxide probe was 3-hydroxymethyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl（HMP）. The reduction reaction of. 35.

(3) 神林・沢村・塚本・木本・東郷・秋月・内田. HMP in atopic mouse heads was remarkably accelerated compared to that in control mice. Average half-life times of HMP were 664 ± 114 sec and 297 ± 41 sec in control and atopic mice, respectively. The present results suggest that antioxidant capacity unusually increased in vivo owing to remarkable ROS generation in AD. キーワード：酸化ストレス，活性酸素種，電子常磁性体共鳴法，HMP，半減期. 緒言. 様々な生理学的・病理学的な皮膚のモデル実験では， NADPHオキシダーゼ（Nakamura et al., 1998），. 炎症性疾患において活性酸素種（reactive. キサンチンオキシダーゼ（XO）（Deliconstantinos. oxygen species，以下ROS）が，重要な役割を果. et al., 1996; Alam et al., 2002）および誘導型一酸. たしていることが指摘されている。炎症反応は生. 化窒素合成酵素（iNOS）（Iuvone et al., 1998;. 体防御における生理的な応答であるが，炎症が高. Fujii et al., 2000）等のROS生成酵素の活性化が. 進して慢性状態が長時間持続すると，一酸化窒素. 報告されている。また，アトピー性皮膚炎患者群. やスーパーオキシドなどのROSが生成される。. では尿中や血中の酸化ストレスマーカーの値が，. ROS生成が抗酸化能力を上回ると，種々の疾病の. 健康な対照群よりも高く（Omata et al, 2001;. 誘発・促進など，生体に負の影響がもたらされる。. Tsukahara et al., 2003a; Sivaranjami et al.,. 酸化ストレスとは，ROS生成高進や抗酸化能力. 2013），ステロイド等を用いた適切な入院治療に. の低下であり，生体内の恒常性維持には，ROS生. よって酸化ストレスマーカーが減少することが認. 成と抗酸化能力とのバランスが重要である。. められている（Tsukahara et al., 2003a; 2003b）。. アトピー性皮膚炎は，「増悪と寛解を繰り返す，. このようにアトピー性皮膚炎では生体内でも. 痒みのある湿疹を主病変とする疾患であり，患者. ROS生成による酸化ストレスが生じていると考. の多くはアトピー素因（アレルギー体質）を持つ」. えられる。. と定義される。アトピー素因は①気管支喘息，ア. 電子常磁性体共鳴法（electron paramagnetic. レルギー性鼻炎・結膜炎，アトピー性皮膚炎のう. resonance，以下EPR）は，不対電子を持つフリー. ちいずれか，あるいは複数の疾患の家族歴・既往. ラジカル（多くのROSが含まれる）を検出する唯. 歴， ②IgE抗体を産生し易い素因とされている（古. 一の方法である。フリーラジカルを生体内で非侵. 江ほか，2009）。厚生労働省の科学研究情報によ. 襲的に可視化することができるため，効果的な計. れば小学生の罹患率は約11 ％，成人全体では約. 測方法として生命科学研究における有用性が認め. 7 ％と報告され，近年，日本（Niwa et al., 2003）. られている（Sato-Akaba et al., 2009）。しかしな. のみならず世界の先進国（William et al., 1999）. がら，フリーラジカルは不安定で化学反応性が高. で罹患者数が急速に増加している。. く，半減期が短いため，EPRによる直接的な検出. アトピー性皮膚炎の発症には様々な原因がある. は困難である。スピンプローブ剤であるナイトロ. が，環境汚染や太陽放射などからのROS生成との. オキサイドは安定したフリーラジカルであり，生. 関連性も報告されている（Niwa et al., 2003）．先行. 体の持つ還元システムや，他のフリーラジカルと. 研究（Leveque et al., 2003）では，アトピー性皮膚. 急速に反応することによってそのEPR信号強度は. 炎の皮膚は健康な皮膚と比較して，ROS生成に関. 減衰する。そこで，ナイトロオキサイドを用いた. 与が高い鉄イオン濃度が高く，ROS消去に貢献す. EPR信号強度の減衰速度に着目することで，生体. るビタミンＣ濃度が低いことが認められている。. 内の酸化還元バランスの変化を間接的に評価する. 36.

(4) アトピー性皮膚炎モデルマウスの生体内酸化還元バランス. ことが可能となる。また，フリーラジカルの出現. 業株式会社から購入した。HMP（3-hydroxymethyl. や消失は血流量や代謝，他の生物学的因子の影響. -2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-yloxy）は. を受けるため，生きている動物に非侵襲的な方法. Toronto Research Chemicals社から購入し，ナイ. として用いることで，フリーラジカルの正確な実. トロオキサイドプローブとして使用した。オリー. 態を明らかにすることができると考えられる。こ. ブオイルは和光純薬工業株式会社から購入した。. れまでこの手法を用いて敗血症モデルマウスの生体内酸化還元バランスについては報告されている. ４．撮像器. ものの（Fujii et al., 2013），アトピー性皮膚炎を. イメージング撮像には，不対電子を検出する. モデルとした研究は見当たらない。. EPR法を使用して測定した。周波数は750 MHzで，. そこで本研究では，ナイトロオキサイドを用い. 中心磁場強度は26.9 ± 0.5 mTとした。撮像パラ. て，炎症疾患の１つであるアトピー性皮膚炎にお. メーターは，scan time 0.5 second，scan width 6. ける酸化還元バランスを，非侵襲的な方法である. mT，field modulation 0.2 mT，field gradient 0.6. in vivo EPRの手法を利用することで画像化し，. mT/cm，shift 0 ± 0.1 mTとした。特別な条件の. 定量的に評価することを目的とした。. ない限り，すべての測定において同じ設定とした。撮像中は，他の磁気の影響を受けないよう，細心. 方法. の注意を払った。. １．実験の概要. ５．実験プロトコル. マウスを用いてアトピー性皮膚炎症モデルを作. Ａ群においてアトピー性皮膚炎を発症させるた. 成した。マウスはコントロール群（Control. め，４週齢のときにマウスの胸腹部および後肢足. group，以下Ｃ群）とアトピー性皮膚炎群（Atopic. 蹠に，5 ％ TNCB ethanol：acetone（１：４）溶. dermatitis group，以下Ａ群）の２群に分け，各. 液を100μl/body塗布して感作をした。感作４日. 群４匹ずつとした。本研究では，EPRを使用して. 後からマウスの左右耳介およびシェーバーで除毛. 信号強度を測定した。また，生体内での酸化還元. した頚背部にTNCBのolive oil溶液（0.8 ％）を. バランスを半減期（Half-life）測定，および二次. 100μl/body塗布し，同様のことを１週間毎に測. 元画像を表示することによって評価した。. 定まで計６回行い，アトピー性皮膚炎を誘導した。誘導後，マウスにケタミン300μl/body腹腔内投. ２．実験動物. 与して麻酔をかけた後，HMPを100μl/body尾静. ８匹のオスのNC/Ngaマウス（測定時：９～10. 脈投与してEPRスペクトル測定を行った。測定中. 週齢，体重28 g）を使用した。マウスは，日本エ. は，1 ％のイソフルランを含む空気を160 ml/min. スエルシー株式会社から購入した。マウスは，室. マウスに吸入させることで，麻酔状態を保った。. 温（24 ± 2 ℃）と湿度（50 ± 5 ％）の調節され. スペクトル測定は，どちらの群においても１分15. た部屋に１檻４匹ずつ飼育され，飼料と水は，実. 秒毎に行った。スペクトルの経時変化（3.5分後，. 験開始まで市販のものを自由摂取させた。明暗サ. 6.0分後および8.5分後）の典型例をFig.１に示した。. イクルは7：00-19：00であった。なお，本実験のプロトコルは，札幌医科大学動物実験委員会の承認を得て実施された。３．試薬 TNCB（2,4,6-trinitrochlirobenzene）は東京化成工. 37.

(5) 神林・沢村・塚本・木本・東郷・秋月・内田. ７．画像処理画像取得と機械コントロールは，LabVIEW 8.6を使用した。画像再構成は，Fortran言語のプログラムを用いた。二次元画像は，Matlab（Math Work社製）を使用して表示した。８．統計処理測定結果は，全て平均値±標準誤差（mean ± SE）で表した。２群間の平均値の比較には，対応のないｔ検定を行った。危険率は，すべて 5 ％ Fig.１ Serve as a prime example of time-dependent in vivo EPR spectrum of HMP injected into atopic mice.. 未満で有意とした。. 結果. ６．半減期測定. 皮膚炎誘導において，感作前と誘導６回目後に. 測定はLabVIEW 8.6を使用した。マウスの頭部. 皮膚観察を行った。皮膚炎誘導部位である左右耳. から得られたEPRスペクトルの信号強度を自然対. 介，および頚背部の各部位において，乾燥，発赤，. 数で規格化し，経時的に表示することで一次速度. 掻爬痕または亀裂，出血，浮腫，痂皮，落屑が観. 反応式を求めた。半減期は，２の自然対数（0.693）. 察されたため，皮膚炎を発症していると判断し実. を一次速度反応式の速度定数（a）で除すこと［半. 験を行った（Photo.１）。. ＝0.693/a］で算出した。減期（t1/2）. 両群における片対数プロットおよび二次元画像による１分15秒毎の信号強度の経時的な変化は，信号強度が最大限に達した３分30秒からとして Fig.２に，それらに対応する二次元画像の変化を Fig.３に示した。. Photo.１ Atopic dermatitis-like lesions induced by TNCB olive oil solution（0.8 ％） . Upper and bottom panels show after the first and the sixth induction, respectively.. 38. Fig.２ Serve as a prime example of time course of the EPR signal intensity of HMP in control （○）and atopic（●）mice..

(6) アトピー性皮膚炎モデルマウスの生体内酸化還元バランス. Fig.３ Temporal changes in EPR images of HMP in control（A）and atopic（B）mouse heads after tail vein infusion HMP.. Fig.４ Comparison of half-life times in control （C, □）and atopic（A, ■）mice. * （p ＜ 0.05） vs control groups.. Fig.４は両群の半減期の平均時間を表している。Ａ群は297 ± 41 sec，Ｃ群は664 ± 114 secで. Fig.５ Half-lives mapping of HMP in control（A） and atopic（B）mouse heads.. 考察. あった。Ｃ群と比較して，Ａ群の値は有意に低値. 炎症反応は，生体防御の機能を担う反面，炎症. であった（p ＜ 0.05）。Fig.５には両群の半減期に. 状態が持続すると種々のROS生成を引き起こ. 相当する二次元画像を示した。. す。ROS生成が抗酸化能力を上回ると，癌や老化などの発症や促進をもたらすため，生体内の酸化. 39.

(7) 神林・沢村・塚本・木本・東郷・秋月・内田. 還元バランスの変化を観察することは重要であ. た。しかしながら，Sivaranjami et al.（2013）は，. る。そこで本研究では，炎症性疾患であるアトピー. 25名のアトピー性皮膚炎患者（平均年齢35歳）の. 性皮膚炎における生体内の酸化還元バランスを，. 血液を採取し，同年齢の25名の健常者群と比較し. 非侵襲的な方法であるEPR画像化手法とナイトロ. たところ，酸化ストレスマーカーであるマロンジ. オキサイドを利用することで定量的に評価した。. アルデヒド（MDA）が有意に高いことと，３つ. 利用したHMPは脂溶性であり脳血管関門（BBB）. の主要な抗酸化酵素や還元型グルタチオン濃度，. を通過することが明らかなため（Fujii et al.,. ビタミンＡ，ＥおよびＣ濃度などの抗酸化物質は. 2009），マウスの頭部測定への応用には問題がない。. 有意に低いことを認めている。また，アスコルビ. NC/Ngaマウスは，ヒトのアトピー性皮膚炎に. ン酸（ビタミンＣ）の投与はアトピー性皮膚炎の. 類似した皮膚症状を発症するアレルギーのモデル. 症状を改善させるという報告（Krowchuk et al.,. 動物である。薬物誘導でのみ発症するため，皮膚. 1992）もある。これらの報告と本研究の結果は一. 炎誘導をせずに，コントロールとしても正確な測. 致するものではない。原因としては測定対象や方. 定を行うことができる。本研究のＣ群では，先行. 法の違い，アトピー性皮膚炎の発症から測定まで. 研究（Fujii et al., 2013）における敗血症モデル. の期間等の可能性が考えられる。今後は条件を統. 実験の対照群と同等の半減期が得られた。ナイト. 一するなどし，より詳細な検討を行っていきたい。. ロオキサイドの二次元画像による経時的変化. アトピー性皮膚炎の発症には，様々な原因があ. （Fig.３），および半減期の二次元画像（Fig.５）. り，環境汚染や生活習慣などからのROS生成との. は，Ｃ群と比較してＡ群において顕著な違いが認. 関連性も指摘されている（Niwa et al.，2003）。. められた。半減期測定（Fig.４）では，Ｃ群と比. しかしながら，発症によるROS生成物の識別にま. 較して，Ａ群において有意に短い値であった. では至っていない。敗血症モデルマウスの実験に. （p ＜ 0.05）。この結果は，炎症によって過剰に. おいては，LPSに誘導型一酸化窒素合成酵素. 生成されたROSに対して，生体内の酸化還元バラ. （iNOS）を阻害するアミノグアノジンを投与し. ンスを保とうと，抗酸化能力が活性化したためで. たマウスの半減期は，敗血症群よりも有意に半減. はないかと考えられる。Kuppusamy et al.（2002）. 期が長く，対照群とほぼ同程度まで回復している. も，繊維肉腫担癌マウスにおける腫瘍組織と正常. ものの，キサンチンオキシダーゼ（XO）阻害剤. 組織を比較して，腫瘍組織で還元型グルタチオン. であるアルプリノールを投与しても影響がなかっ. （GSH）レベルが上昇し，ナイトロオキサイドの. たことが報告されている（Fujii et al., 2013）。アト. 還元速度が増進したことを報告している。また，. ピー性皮膚炎に対しては効果的な治療方法はな. Fujii et al.（2013）は，リポ多糖体（LPS）によ. く，痛みや痒みの軽減や症状を安定させる薬物治. る敗血症モデルマウスを対象に，EPRとナイトロ. 療のみとなっている現状がある。本研究において. オキサイドを用いて生体内の酸化還元状態を報告. は，炎症による酸化還元バランスの変化の定量化. している。それによれば，敗血症モデルマウスの. のみに留まっているため，今後アトピー性皮膚炎. ナイトロオキサイドのEPR信号減衰速度は対照群. 症によるROS生成物の識別や，抗酸化物質投与に. と比較して有意に速いことが認められている。以. よる効果の検討が重要になるだろう。また，さら. 上のことから，炎症が蔓延し，フリーラジカルで. なるEPR画像化技術の進歩により，炎症による損. あるROS生成が過剰に高進されると，生体の抗酸. 傷部位の特定や，損傷の程度の観察が可能となり，. 化能力が活性化するのではないかと推察される。. 治療への応用が期待される。. 本研究では，アトピー性皮膚炎モデルマウスの生体では酸化還元バランスを維持するために，抗酸化能力が異常に高進している可能性が示唆され. 40.

(8) アトピー性皮膚炎モデルマウスの生体内酸化還元バランス. induced by lipopolysaccharide. Br. J. Pharmacol.,. まとめ. 130:90-94.. 本研究では，ナイトロオキサイド（HMP）を用いて，炎症性疾患の１つであるアトピー性皮膚. Fujii, H., Kawanishi, K. and Itoh, K.（2009）Redox-mapping MRI in rodent brain with nitroxide contrast agents. In. 炎における生体内の酸化還元バランスを，非侵襲. Proceedings of the 18th Annual Meeting of ISMRM,. 的な方法であるEPR画像化の手法を利用すること. Hawaii, USA, 3306.. で定量的に評価することを目的とした。モデル実験では，アトピー性皮膚炎を発症していない群（Ｃ群），アトピー性皮膚炎を発症している群（Ａ群）の２群に分けた。その結果，両群のHMP半減期を比較したところ，Ｃ群と比較して，Ａ群の値は有意に短い値を示した。. Fujii, H.G., Sato-Akaba, H., Emoto, M.C., Itoh, K., Ishihara, Y. and Hirata, H.（2013）Noninvasive mapping of the redox status in septic mouse by in vivo electron paramagnetic resonance imaging. Magn.Reson.Med., 31:130-138. 古江増隆・佐伯秀久・古川福実・秀道広・大槻マミ太. 以上のことから，アトピー性皮膚炎においては. 郎・片山一朗・佐々木りか子・須藤一・竹原和彦. 炎症によって過剰に生成されたROSに対して，生. （2009）アトピー性皮膚炎治療ガイドライン（日本皮. 体内の酸化還元バランスを保とうと，抗酸化能力が活性化した可能性が示唆された。. 膚科学会ガイドライン）．日本皮膚科学会，119：15151534． Iuvone, T., D’Acquisto, F., Van Osselaer, N., Di Rosa, M.,. 謝辞本実験の実施に当たり多くのご助言とご指導を頂きました札幌医科大学医療人育成センターの藤井博匡教授，また江本美穂氏，桑原洋子氏，北海道大学獣医学部の山崎洋祐氏の皆様に心より感謝致します。. Carnuccio, R. and Herman, A.G.（1998）Evidence that inducible nitric oxide synthase is involved in LPSinduced plasma leakage in rat skin through the activation of nuclear factor-kappaB. Br. J. Pharmacol., 123:1325-1330. Krowchuk, D.P., Tunnessen, Jr,W.W. and Hurwitz, S. （1992）Pediatric dermatology update. Pediatrics, 90:125-129.. 参考文献 Alam, A., Khan, N., Sharma, S., Saleem, M. and Sultana, S. （2002） Chemopreventive effect of Vitis vinifera extract on 12-O-tetradecanoyl-13-phorbol acetateinduced cutaneous oxidative stress and tumor promotion in murine skin. Pharmacol. Res., 46:557-564. Deliconstantinos, G., Villiotou, V. and Stavrides, J.C. （1996）Alterations of nitric oxide synthase and xanthine oxidase activities of human keratinocytes by ultraviolet B radiation. Potential role for peroxynitrite in skin inflammation. Biochem. Pharmacol., 51:17271738. Fujii, E., Yoshioka, T., Ishida, H., Irie, K. and Muraki, T. （2000）Evaluation of iNOS-dependent and independent. Kuppusamy, P., Li, H., Ilangovan, G., Cardounel, A. J., Zweier, J.L., Yamada, K., Krishna, M.C. and Mitchell, J.B. （2002） Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res., 62:307-312. Leveque, N., Robin, S., Muret, P., Mary, M.S., Makki, S. and Humbert, P.（2003）High iron and low ascorbic acid concentrations in the dermis of atopic dermatitis patients., Dermatology, 207:261-264. Nakamura, Y., Murakami, A., Ohto, Y., Torikai, K., Tanaka, T. and Ohigashi, H.（1998）Suppression of tumor promoter-induced oxidative stress and inflammatory responses in mouse skin by a superoxide generation inhibitor 1’-acetoxy chavicol acetate. Cancer Res.,58:4832-4839.. mechanisms of the microvascular permeability change. 41.

(9) 神林・沢村・塚本・木本・東郷・秋月・内田. Niwa, Y., Sumi, H., Kawahira, K., Terashima, T.,. （神林勲札幌校教授） . Nakamura, T. and Akamatsu, H. （2003） Protein. （沢村祥子北海道教育大学岩見沢校卒業生）. oxidative damage in the stratum corneum: evidence for a link between environmental oxidants and the. （塚本未来東海大学国際文化学部助教） . changing prevalence and nature of atopic dermatitis. （木本理可旭川工業高等専門学校准教授） . in Japan., Br. J. Dermatology, 149:248-254.. （東郷将成酪農学園大学大学院博士課程 . Omata, N., Tsukahara, H., Ito, S., Ohshima, Y., Yasutomi, M., Yamada, A., Jiang, M., Hiraoka, M., Nambu, M.,. 大学院生）（秋月茜北海道医療大学大学院博士課程 . Deguchi, Y. and Mayumi, M. （2001） Increased. 大学院生） . oxidative stress in childhood atopic dermatitis. Life. （内田英二大正大学心理社会学部教授） . Sci., 69:223-228. Sato-Akaba, H., Kuwahara, Y., Fujii, H. and Hirata, H. （2009）Half-Life mapping of nitroxyl radicals with three-dimensional electron paramagnetic resonance imaging at an interval of 3.6 seconds., Anal.Chem., 81: 7501-7506. Sivaranjani, N., Venkata Rao, S. and Rajeev, G.（2013） Role of reactive oxygen species and antioxidants in atopic dermatitis. J.Clin.Diag.Res., 7:2683-2685. Tsukahara, H., Shibata, R., Ohta, N., Sato, S., Hiraoka, M., Ito, S., Noiri, E. and and Mayumi, M.（2003a）High level of urinary pentosidine, an advanced glycation end product, in children with acute exacerbation of atopic dermatitis: relationship with oxidative stress. Metabolism, 52:1601-1605. Tsukahara, H., Shibata, R., Ohsima, Y., Todoroki, Y., Sato, S., Ohta, N., Hiraoka, M., Yoshida, A., Nishima, S. and Mayumi, M.（2003b）Oxidative stress and altered antioxidant defenses in children with acute exacerbation of atopic dermatitis. Life Sci., 72:25092516. William, H., Robertson, C., Stewart, A., Aït-Khaled, N., Anabwani, G., Andersen, R., Asher, I., Beasley, R., Björkstén, B., Burr, M., Clayton, T., Grane, J., Ellwood, P., Keil, U., Lai, C., Mallol, J., Martinez, F., Mitchell, E., Montefort, S., Pearce, N., Shah, J., Sibbald, B., Strachan, D., von Mutius, E. and Weiland,S.K.（1999）Worldwide variations in the prevalence of symptoms of atopic eczema in the international study of asthma and allergies in childfood. J.Allergy Clin.Immunol., 103（1 Pt 1）: 125-138.. 42.

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