HoneybeeScience(1994)
プ ロポ リスのマ クロフ ァー ジ活性化作用 と
癌転移抑制効果実験 につ いて
新井 成之 ･栗本 雅司
蜂 の巣由来の物質 プロポ リスは民間伝承薬 と して長 い歴史を有 し, さまざまの効果 も知 られ ている (Debiaggieta1.,1990;Schelleret alリ1989).我 々は,プ ロポ リスが持っ生物学的 作用について明 らかにすべ く, い くつかの方面 か ら研究を進 めている. プロポ リスを構成す る 成分, またそれ ぞれの持 っ薬理作用 につ いて は, これまでにかなり明かにな っているが, プ ロポ リスと して とらえてみた場合, その産地 に よって構成成分が異 な り,その生物学的な作用 も異 なることが考え られ る.林原生物化学研究 所では, ブラジル産のプ ロポ リスを用 い,で き るだけ民間で使われ るものに近 い状態で, プロ ポ リスの持つ生物学的作用を,特 に,生体 の免 疫機能 に関係す る面か ら明かに,強いていえば 作用を確認すべ くこれまでにい くつかの実験 を 行 な って きたので ここに紹介す る.Ⅰ
. プ E3ポ リスの マク ロフ ァー ジ 活性化作用 1.実験用プ ロポ リスの調製 ブラジル産 プロポ リス原塊 よりエチルアルコ ールと蒸留水 にてエキス成分 を抽出 し,無水結 晶マル トース (ファイ ン トース)を用 いて粉末 散剤化 した.本散剤 は, プロポ リス由来の成分 を固形分 として13.75%含 み, 培地 または蒸留 水 などに対 して分散性が良 い.i
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の実験 には, このプ ロポ リス散剤40mg を正確 に計 図 1 プロポリス散剤によるマクロファージ伸展機能の活性化(BALB/Cマウス) A.対照,B.プロポリス散剤濃度0.25mg/ml,3時間感作● ･ .,汲 Ja//A _ 図2 鶏赤血球会食マクロファージ (ギムザ染色)プロポリス散剤濃度0.25mg/汁ll り,注射用滅菌蒸留水1mlで分散す る.これに RPMI1640培地 (10%FCS加)9mlを加 え混 和 した後,膜孔径0.22pm で慮過滅菌 した もの を実 験 用 プ ロポ リス原 液 と した. 本 溶 液 は LPS (Lipopolysaccharide:発熱物質) テス ト 陰性で,試験 に際 しては散剤濃度でプロポ リス 用量 を表示 し,対照 には同様 に処理 した無水結 晶 マル トースを用 いた. 2.
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0 試験 に用いたマクEjファー ジ BALB/C および C3H/HeN マウスの8-9 週齢を 日本 チ ャールス リバ ーより導入,炭酸 ガ ス吸入致死せ しめた後, 脱血, 腹腔を RPMI 1640培地 で洗浄す ることによ り腹腔常在細胞 (マクロファー ジ)を回収 した. 3.マクロファージの機能測定 5 2 5 3 別 封 控 胡 軸 プロポ リスのマクロファー ジ機能 に及ぼす作用 は,伸展,赤血球合食能,遊走機能 とサイ トカ イ ン,窒素酸化物 (NO)の産生 に与え る影響 を 調べた.a.
マクロファージ伸展能 に及 ぼす影響 回収 した細 胞 を ガ ラス チ ャ ンバ ー (Nunc 社,Labteckチ ャンバ ー) に播種, 1時間後 に,非付着細胞を洗浄 によ り除去 し,付着細胞 をマクロファー ジと して試験 に用 いた. また, これ らの細胞 はラテ ックス粒子貧食率98%以 上 であることを確認 した. これ らの細胞 に対 し て, プ ロポ リス散剤 の濃度 が0- 1.0mg/mlに なるように含調製 した培地 を添加 し,継時的に 顕微鏡下で形態を観察 した.対照 には無水結晶 マル トースを使用 した. i i 【【 liI【 ー∴+ il 】 i 輔 相 継lll【【 】E i l】】】 E 1】【l .E,隅 ElE【≡喜溝蔓榊 】I】【 i 】 /→十】
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500 400 召 300 liE! b♪ D. ∃ 200 100 0
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0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 プ ロポ リス散 剤 池 度(mg/ml) 図 6 プロポリス散剤のマクロファージ由来サイトカイン(IL-1)産生に及ぼす影響 問感作 した.膜の上面か ら下面 に移動 した細胞 を顕微鏡下で数え,遊走 した細胞の割合を算出 した.実験 は 2度行 った.図 4に示すように, 対照 (ファイン トース) はどの濃度 において も 10%以下の遊走率であるのに対 し,プロポ リス 散剤 は0.25mg/mlまで濃度依存的に遊走率 は 上昇 し, 0.25および 0.5mg/mlでは対照の約 3倍か ら4倍の値を示 した.d.
マクロファージか らのサイ トカイ ンおよ び窒素酸化物産生 に及ぼす影響 マウス腹腔マクロファージ (1.3Ⅹ105/well) に対 し, プロポ リス散剤 (1.0,0.5,0.25mg/ ml)およびLPS (0.l〟g/ml)を添加 し,プロ ポ リスまたはLPS単独刺激 (5,21時間),プ ロポ リスおよびLPS同時刺激 (5,21時間)の 条件で培養 した後,培養上清を回収 した. 培養上清中のサイ トカイ ンは,腫療壊死因子 (TNF-α),イ ンターロイキ ン-1(Ⅰし1α)をマ ウスTNF-αELISA KIT (Genzyme)および マウスIL-1α ELISA KIT (Genzyme)を用 いて測定 した.また,窒素酸化物 (NO)は,酸 化物である亜硝酸 イオ ンと して測定す るため, Griess試薬 (1%sulfanilamide,2.5% H｡PO｡,0.1% naphthylethylenediamine dihydr o-chloride) を培養上清に等量添加 し, 550nm の吸光度を測定 した. マクロファージをプロポ リス散剤単独で感作 したときは,TNF-α および Ⅰし1α の産生 は ほとんど認め られなか った. しか し,プロポ リ ス散剤存在下で LPS刺激す ると,両サイ トカ インはプロポ リス散剤の濃度 に依存 して増加 し た.図5に示すように TNF の産生 は,刺激後
5
時間までに終了 していた. プロポ リス散剤1
mg/mlの添加で約 900pg/ml,また,LPS0.1 mg/mlで約 600pg の TNF 産生が認め られ た.LPS と共にプロポ リス散剤を同時添加す ると,LPS単独 と比べて,相乗的にまたプロポ リス散剤濃度依存的に TNF 産生が促進 され た.さらに,プロポ リス散剤感作の後,LPS刺 激す ると,LPS 刺激 による TNF 産生量 は増 大 した.逆に,LPS刺激の後,プロポ リス刺激 して もTNF 産生量 は変わ らなか った. 図6には, IL-1 産生 に及ぼすプロポ リス散 剤の影響 を示 した.Ⅰし1は,刺激後 5時間目以 降,21時間 目までに産生 されていた.プロポ リ ス単独刺激では,IL-1産生 はほとんど認め られ なか った.LPS とプロポ リス散剤を同時に添 ∫ 加すると LPS単独 と比べて,相乗的にまたプ ロポ リス散剤の濃度 に依存 して IL-1の産生が 促進 された.図7に示すよ うに,NO もプロポ リス散剤単独で は産生 されなか ったが,逆 に LPS刺激で産生 される NO 量をプロポ リス散 剤 は濃度依存的に抑制 した. また, この抑制作 用 は LPS とプ ロポ リスが共存 して いな くて0 02 04 06 08 1.0 プ ロ ポリス散 剤 濃度(mg/ml) 図7 プロポリス散剤のマクロファージ由来細胞傷害性因子 (NO)産生に及ぼす影響 0.0 0.02 0.2 2.0 10.0 プロポ リス散剤(mg/マウス) 図
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プロポリス散剤のマウス血中サイ トカイン(TNF)産生に及ぼす影響 ら, あ らか じめプロポ リス散剤 にて感作 した後 に洗浄 したマクロファー ジで も認 め られ ること か ら,NO スカベ ンジャー作用ではな く,産生 抑制であることが明かにな った.4.
マウス血中サイ トカイ ンの産生誘導作用 C3H/HeN マ ウスに 0.02-10mg/マウスの プロポ リス散剤溶液を尾静脈 より投与 し, 3時 間後 に LPSをl.Opg/マ ウス,投与 (i.V.)す る. さ らに2時間後 に採血, 血清 を分離 し, TNF 活性 を Bioassayで求 めた. あわせて, プ ロポ リス単 独 投与 後 3お よ び5時 間 目の TNF活性 も測定 した.LPSを1〟g の用量で, 単独 マウスに静脈内投与す ると, 2時間後の血 清中に1
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の TNF 活性が認 め られた.図8に示すよ うにLPS投与3時間前 にプ ロポ リスを投与 してお くと,対照群 と比較 して有意 に血中 TNF 値 の上昇が認め られた. 血中TNF値 は,プロポ リス散剤 を 0.2および 2.0mg/マ ウス投与 した ときに特 に有意 に上昇 し,10mg/マウスでは上昇 の割合 は低下 した. 血中 TNF 値の上昇が認 め られた 0.2および 2 mg/マ ウスのプ ロポ リス散剤 を単独 で静脈投 与 し3および 5時間後 の血中 TNF 活性 を測 定 したところ,TNF活性 は検出されなか った. また, あわせて測定 した血中のイ ンターフェロ ン(IFN)活性 は,LPS投与3時間前 にプロポ リス散剤を投与 してお くと,対照群 と比較 して 用量依存的 に上昇す る傾 向があ り10mg/マ ウ氾度(mg/ml) 図9 プロポリス散剤のマウス結腸癌 Colon26の増殖に及ぼす影響 (m vitro) スで最 も高 い値を示 した. また, IFN 活性 は
LPS
やプロポ リス散剤 の単独投与 では検出さ れなか った. Ⅱ.プ ロポ リスの癌 転移 抑制作 用 マウス結腸癌細胞 Colon26を用 いた実験的 癌肺転移 モデルを使用 した. 1.in vitro増殖抑制試験 実験 に先立 ち,invitroにおける Colon 26 細胞 に対するプロポ リスの増殖抑制効果を調べた.Colon26細胞を RPMI1640 (10%FCS),
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℃, 5%CO 2存在下でプロポ リス散剤 0- 1.0 mg/mlと共 に 5日間培養 し,各プロポ リス濃 度 における腫癌細胞数 をカウントし,無処置対 照 に対す る増殖率 (%)で評価 した. 図9にマウス結腸癌細胞株 Colon 26の in vitro における増殖 に対す るプロポ リス散剤の 影響を示 した.5日間の培養条件下においてプ ロポ リス散剤 は濃度依存的に Colon 26細胞の 増殖を抑制 し,直接的な作用のあることが明か になった.2.
プ田ポ リスの癌転移抑制作用 スクリーニングBALB/
Cマウス,雌,7週齢を用 い,Colon 26細胞 を尾静脈か ら移植す る実験的肺転移 モ デルを使用 した. 移植細胞数を 3×103および 1×104に設定 した実験的肺転移 モデルに対 し て,プロポ リス散剤量が 40〝g/マウスになるよ うに尾静脈 よ り注射 した.実験 スケ ジュール は, プ ロポ リスを3日間連 日投写 した後, Colon26を移植,その後,1日おきに 3回投与 した. 移植後 12日目に肺 の転移巣 コロニーを カウントした . 表 1にプロポ リス散剤0.4mg の用量を用い 蓑 1 プロポリス散剤 (0.4mg)のマウスColon26肺転移抑制作用スクリーニング 用 量 肺 転 移 巣 数 i.V./マウス 3×103a) 1×104b) プロポリス散剤 0.4mg/0.2ml ファイントース 0.4mg/0.2ml 生 理 食 塩 水 02ml 54.3±4.1(∩-13)*
*
84.3±10.5(n-20)*
81.7±7,5(n-13) 117.8±13.3(n-16) 819±8.3(∩-15) 127.5±13.0(n-19) a),b):移植 したColon26腫癌細胞数 平均値 ±標準誤差*
*;
p≦0.01 *;p≦0.05表2 プロポリス散剤のマウスColon26肺転移抑制作用 群 i.V誓 ス 動物数 平農 芸誤 差 プロポリス散剤 0.1mg/0.2m1 0.2mg/0.2m1 0.4mg/0.2ml ファイントース 0.4mg/0.2ml 生 理 食 塩 水 0.2ml 13 94.7±13.7 13 66.1*± 9.6 13 81.0±13.3 13 134.0± 6.1 13 115.9±15.4 移植Colon26細胞数:5×103個/マウス *;p≦0.05 て行な った癌転移抑制作用のスク リーニ ングの 結果 を示 した.移植細胞数 を3×103および1 ×104個で設定 したマウス Colon 26実験的肺 転移 モデルに対 して,プ ロポ リス散剤 の 0.4mg を Colon 26細胞移植前後 に計 6回投与す る ことで,肺転移 は対照 よ りも有意 に減少 した. 3.プ ロポ リス散剤投与量の検討 スク リーニ ングと同様 に BALB/C マウス, 雌,7週齢 を使用 した. プロポ リス散剤 0,0.1, 0.2,0.4mg/マウスの群 を設定 した. 3日間プ ロポ リス散剤溶液を静脈 内投与 した後, Colon 26細胞5×103を尾静脈 か ら移植 した. その 後,さらに3日間プロポ リス散剤溶液を投与 し た.Colon26細胞か ら 14日目に肺 の転移巣数 をカウン トした. 表 2は Colon 26細胞 を 5×103で移植す る 実験的肺転移 モデルにおいてプロポ リス散剤 の 至適用量 を求 めた結果である. プロポ リス散剤 0.1,0.2および0.4mg を移植前 3日より 6日 間静脈内投与す ることで,肺転移 はプ ロポ リス 散剤0.1mg 群で 80%に,0.2mg 群 では 57% に,0.4mg群では 70%に抑制 された. Ⅲ.
ま と め
プロポ リスは古来 よ り天然物質 として様 々の 作用や,ある種 の疾患 に対 し効果を示す民間療 法薬 と して知 られて きた. プ ロポ リスは, その 産生 され る地域 によって,含有成分が異 なるこ とは既 に知 られ,最近 では,各種のプロポ リス を構成す る成分が単離 され効果を試験 されてい るが,既知物質 を含め単独では大量 でないと作 用の認 め られない もの も多 い. プ ロポ リスの成 分や様 々な作用 などにつ いては,松 田 (1994a, b) の総説があるのでそれを参照 していただ き たい.我 々は,プロポ リスの生物学的作用 に興 味を持 ち,各種方面か ら実験 を進 めて きたが, 実験 に際 してプロポ リスを使 いやすい形 にす る ため無水結晶マル トースを用 いてプ ロポ リス抽 出エキスを散剤化 した (守安 ら,1993,1994). ワックス成分 は含 まず,水 に対 して分散性 の良 いものを調製 し,既知のマクロファー ジ活性化 物質であるエ ン ドトキ シンを測定 し, その影響 のない.ことを確認 した.最終的にはその日的 と なる作用 を示す物質 を単離,同定で されば と考 えるが, これまで現象の確認を中心 に進めて き た. そのなかで生体の免疫機能 に関係す るマク ロファージの活性化現象 に気がついた. この現 象 に は, プ ロポ リス散 剤 の至 適 用 量 が あ り BRM (BiologicalResponseModifiers)的な 用量反応関係 を示 した.i
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o試験管内にお けるマクロファー ジの活性化が生体内でどの現 象 につ なが るか は, 直接 的 には言 及 で きない が,i
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試験 において,注射投与ではある がある種 のサイ トカイ ンの産生 を促進 した りす る現象が確認 されたことは興味深 い. さらに, 生体内においてプロポ リス単独の作用では,サ イ トカイ ンの産生 は認 め られなか ったが,LPS
刺激 によって相乗,相加的に産生が促進 されて いることか ら, これ らサイ トカイ ンを産生す る 免疫担 当細胞 の賦活化作用 の一端 が うかがえ る. また, プロポ リスの癌転移抑制作用につい ては,今回, モデルとして用 いたマウス結腸癌 細胞株 Colon 26に対 してプロポ リス散剤 は inv
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で直接的な増殖抑制作用 も示すが,マい.我々は,プロポ リス散剤を投与 してお くこ とによって,マクロファー ジを主体 とす る免疫 担当細胞の活性化が起 こり,肺組織 にとって異 物である転移癌細胞の着生 の阻害,除去が起 こ った結果,転移巣の減少が見 られたと考えてい る.現在,プロポ リス散剤の投与 は注射投与で あるが,生体に休 し､invitro と同様 に至適用 量があると推察 している. プロポ リスは色々な 作用を持っが,その成分が多種多様で,効果 と その作用発現に関係す る物質を一つ一つ明かに す るのは,極めて餌難 なことと考えている.辛 い,多 くの民間療法薬 と同様 にプロポ リスも, その作用の歴史 と共に安全性 に関す る情報 も知 られている (金枝 ･仁科,1994).現在,我々の 実験 はin vitro の試験や in vivo の場合で も 注射投与であるが,プロポ リスの経 口投与 によ るこれ らの作用の確認を今後行ないたいと考え ている. (〒702 岡山市藤崎675-1 (樵)林原生物化学研究所 藤崎研究所) 参 考 文 献
Debiaggi,M.etal.1990.MicrobiologlCa13:207 -214.
金枝 純,仁科 保.1994.ミツバチ科学15:29-33 松田 忍. 1994a.Foodsand Food Ingredients
JournalofJapan 160:64-73
松田 忍.1994b.ミツバチ科学15:145-154. 守安純子 ら.1993.Biotherapy7:364-365. 守安純子 ら.1994.Biotherapy8:346-347. Scheller,S.etal.1989.Z.Naturforsch.44:1063
-1065.
tion and tumormetastasis.HoneybeeScience
(1994) 15(4): 155-162 Fujisaki lnstltute. Hayashibara Biochem. Labs., Inc., 675-1,
Fujisaki,Okayama,702Japan.
Propolis,beeglueobtainedfrom beehives,is knownasahomeremedy becauseofitsanti一 microbialand antiviraleffects. We prepared propolispowderwithanhydrousmaltosetof a-cilitateitssolubility(propoliscontent:approxi -mately 13.7%). Murinemacrophagefunctions. such as cell adhesion and the subsequent spreading ofthecytoplasm,and the motility and phagocytosis of macrophages were significantlyactivatedinvitrowith propolisat concentrations of 0.03-1.0 mg/ml. Further -more,invitroTumorNecrosisFactor(TNF)and lnterleukin 1production ofmacrophagessti m-ulated with Lipopolysaccharide (LPS) Were significantly enhanced by the propolis treat -ment.PropolisinhibitedNOproducti onofLPS-stimulated macrophages in a dose-dependent manner. Micei.V.Injected withpropolisprior to LPS administration showed significanti n-creaseofserum TNF and Interferon levelsas compared tothecontrolgroup.InviErodose -dependentgrowth inhibition ofmurineColon 26tumorcelllineswasobserved in thepres -enceof0.03to1.0mg/mlofpropolis.
Usinganexperimentalmetastasismodelwith theColon26adenocarcinomacellline,BALB/c miceweregiven3i.V,injectionsof0.ト0.4mg propolis per mouse before and after the transplantation of tumor cells. The results showedthatonlythegrouppretreatedwith0.2 mg ofpropolisdemonstrated a slgnificantre -duction (35%) in lung metastasis compared withthatofthecontrolgroup.
Theseobservationsindicatethatpropolishas BiologlCalResponseModifierslikeantitumorac -tivities.
