岡 山 医 誌(1991) 103, 779∼789
気管支喘 息 にお ける
好酸球 動態 の調節 に関す る研究
第1編 喘 息 患 者 末 梢 血 単 核 球 由 来 の 好 酸 球 遊 走 因 子(ECF)の 解 析 岡 山 大 学 医 学 部 第 二 内科 学 教 室(指 導:木 村 郁 郎 教 授) 高 橋 寿 保 (平成3年3月20日 受 稿)Key words: Bronchial asthma, Candida antigen Eosinophil chemotactic factor, Interleukin-5
緒 言 気 管 支 喘 息 の 発 症 に は,心 因 性 や 物 理 化 学 的 要 因 も否 定 で きな い が,む し ろ吸 入 抗 原 に 起 因 す る種 々 の ア レル ギ ー 反 応 の 関 与 が 重 要 な要 因 と考 え ら れ て い る.か か る観 点 か ら喘 息 病 態 を 解 析 す る と,若 年 発 症 型 に 多 くみ られ る ア トピ ー 型 喘 息 で は,主 にhousedust,ダ ニ 抗 原 に 対 す るIgE抗 体 の 産 生 亢 進 に 基 づ く Ｉ型 ア レル ギ ー 反 応 に よ り即 時 型 の 発 作 が 惹 起 され る .一 方, 木 村 に よ り提 唱 さ れ た 中 高 年 発 症 型 難 治 性 喘 息 は1),非 ア ト ピー 型 で,通 年 性 に 発 作 を繰 り返 し 治 療 抵 抗 性 で あ り,真 菌 抗 原 のCandidaに 特 異 的 なIgG抗 体 を介 し たIn型 ア レ ル ギ ー 反 応 と リ ン パ 球 ・マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 に よ る1Ⅷ型 ア レル ギ ー 反 応 の 混 在 した 細 胞 反 応 型 ア レル ギー2)がその 病 態 に 深 く関 与 して い る と想 定 され,成 人 喘 息 の 特 徴 的 な病 態 を 代 表 す る と され て い る3) 4) 5) 6). 一 方,気 管 支 喘 息 の病 理 学 上 の 特 徴 的 な 所 見 の 一 つ に,気 管 支 壁 お よ び 気 管 支 腔 内 へ の好 酸 球 浸 潤 が あ り,喘 息 発 作 時 に は 非 発 作 時 よ り も 高 度 の 好 酸 球 浸 潤 が 認 め られ,喘 息 発 作 と気 道 好 酸 球 浸 潤 との 問 の 密 接 な 関 係 が 報 告 され て い る7).かか る 末 梢 気 道 の ア レ ル ギー 性 炎 症 の場 へ の 好 酸 球 集 積 に は,種 々 の 好 酸 球 遊 走 因 子 (Eosinophil chemotactic factor: ECF)が 関 与 し て お り,従 来 か ら肥 満 細 胞 ・好 塩 基 球 系 由 来 のECF-A等 以 外 に,リ ン パ 球 由 来 のECF-Lyが 重 視 され て い た8).近 年 の め ざ ま しいTリ ンパ 球 由 来 のサ イ トカ イ ンに 関 す る研 究 の結 果, Interleukin-5 (IL-5)にECF活 性 が 見 い だ さ れ て い る9).ま た,教 室 の 河 田102は,喘 息 患 者 末 梢 血 単 核 球 のCandida抗 原 刺 激 培 養 上 清 中 のECF活 性 を 測 定 し,気 管 支 喘 息 の な か で も 非 ア トピ ー群 や 重 症 例 の リ ンパ 球 はECF産 生 能 が 亢 進 して お り, Candida抗 原 に 感 作 され た リン パ 球 を介 す る Ⅳ型 ア レ ル ギー 反 応 が 気 管 支 喘 息 の 重 症 化 に重 要 な役 割 を果 た して い る こ と を報 告 し て い る.そ こ で 著 者 は,か か る 喘 息 患 者 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 中 のECFの 成 分 を, IL-5の 観 点 か ら, gel filtrationと 特 異 抗 体 に
よ るblocking testを 応 用 し て解 析 した. 対 象 と 方 法 対 象 に は,岡 山大 学 第2内 科 外 来 通 院 中 の 気 管 支 喘 息 患 者 で,末 梢 血 単 核 球 のCandida抗 原 刺 激 培 養 上 清 中 のECF活 性 が,河 田 の 報 告10) し た健 常 人(7例)のECF活 性29±12Cells/10 hpfに 比 し71±31Cells/10hpfと 有 意 に高 値 で あ っ た 喘 息 群(20例)の 中 で も,著 し く高 値 を 示 し た4例 を 対 象 と し た.か か る4症 例 は い ず れ も非 ア トピ ー 型 重 症 例 で, Candida抗 原 吸 入 誘 発 試 験 に て遅 発 型 気 道 反 応(Late asthmatic response: LAR)を 呈 し, Candida抗 原 に 対 す
る末 梢 血 リンパ 球 幼 若 化 反 応 が 亢 進 して い た(表 1). 表1 対 象 症 例 の 背 景 因 子 病 型 は,① 発 症 年 齢40歳 未 満,② 他 の ア レ ル ギー 性 疾 患 の 合 併,③IgE (RIST)高 値(> 500U/ml),④IgE (RAST)陽 性,⑤ 即 時 型 皮 内 反 応 陽 性(真 菌 類 の み 陽 性 の 場 合 を 除 く),の5項 目の う ち, 3項 目 以 上 を 満 た す も の を ア ト ピ ー 型 と し,そ れ 以 外 を非 ア ト ピー 型 と し た.重 症 度 は,日 本 ア レ ル ギ ー 学 会 の 分 類 に 従 っ た.プ レ ドニ ゾ ロ ン換 算5mg/day× 1年 間 以 上 を ス テ ロ イ ド依 存 群 と し た. I: immediate, L: late, MNCS:単 核 球 培 養 上 清. 1) 末 梢 血 好 酸 球 の 分 離
Boyden chamber法 に よ るECF活 性 測 定 に 必 要 な 好 酸 球 の 分 離 法 は,教 室 の 河 田 の 方 法11)に 準 じ た.す な わ ち,好 酸 球 増 多 の な い 健 常 人 よ
り 末 梢 血5mlを ヘ パ リ ン 加 で 採 血 し, 6%デ キ ス ト ラ ン1mlを 加 え て 室 温 で30分 間 静 置 し た 後 にbuffy coatを 回 収 し た.混 入 す る 赤 血 球 を 除
く た め に,ま ずPhosphate buffer saline(PBS) 10mlを 加 え て4℃, 250gで5分 間 洗 條 し,そ の
沈 渣 に 蒸 留 水1mlを 加 え て30秒 間 ピ ペ ッ テ ィ ン グ し て 溶 血 さ せ た 後, 1.8%食 塩 水1mlを 加 え て 等 張 に 戻 し た.さ ら にPBSを 加 え て4℃, 250
gで5分 間 洗 條 し た 後 に, Flow cytometry (Becton Dickinson社: FACStar)を 利 用 し た 方 法11) 12)で 好 酸 球 を 分 離 し た.得 ら れ た 好 酸 球 を, Hanks' balanced salt solution (HBSS: GIBCO)で2×104個/100μlの 濃 度 に 調 整 し,
好 塩 基 球 ・好 酸 球 同 時 直 接 算 定 液 に て90%以 上
の純 度 を, trypan blue染 色 に て90%以 上 の viabilityを 確 認 した 検 体 を 用 い た.
2) ECF活 性 の 測 定
Multiwell microchemotaxis chamber (Neuroprobe)と,孔 径5μmのfilter (Nu cleopore)を 用 い た, modified Boyden chamber 法13)に て 測 定 した.す な わ ち,後 述 の 培 養 上 清 や そ の 分 画 液 の50μlをchamber下 室 に 入 れ て filterで 仕 切 り, chamber上 室 に1)で 得 られ た 好 酸 球2×104個 を入 れ て, 37℃ のCO2イ ン キ ュ ベ ー ター 内 で30分 間 反 応 させ た.そ の 後, filter を取 り出 して メ タ ノー ル で5秒 間 固 定 し,好 酸 球 の 染 色 を エ オ ジ ノ ス テ イ ン(鳥 居 薬 品)を 用 い て2分 間行 い,キ シ レ ン に1分 間 浸 して ス ラ イ ドグ ラスに 固定 後400倍 拡 大 で鏡 検 し, filterの 下 室 側 ま で 遊 走 した 好 酸 球 数 を無 作 為 に10視 野 数 え てECF活 性(遊 走 細 胞 数/10hpf)と した. ECF活 性 の 測 定 はtriplicateま た はduplicate
で 行 い,好 酸 球 は 同 一 健 常 人 の もの を用 い た. 3) Candida抗 原 刺 激 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 の 作 成 Candida抗 原 刺 激 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 の作 成 は 河 田 の 方 法10)に準 じて 行 っ た.す な わ ち,気 管 支 喘 息 患 者 の 末 梢 血10mlを ヘ パ リ ン加 で 採 血 し,等 量 の 生 理 食 塩 水 と混 和 した 後 にHistopa que 1077 (Sigma)に 重 層 して,室 温, 450gで 30分 遠 心 分 離 した,得 られ た単 核 球 層 にRPMI 1640 (GIBCO)を 加 え て4℃, 250gで5分 間 の 洗 滌 を2回 繰 り返 し, RPMI 1640で1×106個/ 500μlに 再 調 整 して, trypan blue染 色 に て95 %以 上 のviabilityを 確 認 した 検 体 を用 い た.こ の単.核球 を24 well tissue culture cluster (Co star)に1×106個/wellず つ 分 注 して,添 加 抗 原 と し てCandida抗 原 凍 乾 末(鳥 居 薬 品)を RPMI 1640に て 溶 解 し た もの150μgを 添 加 し, 37℃ のCO2イ ン キ ュ ベ イ ター 内 で2日 間 培 養 し た後 に,そ の 上 清 を室 温, 1400gで30秒 間 遠 沈 して 回収 し た. 4) Candida抗 原 刺 激 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 中ECF活 性 の 分 子 量 の 検 討 得 られ た 培 養 上 清 の分 子 量 測 定 は以 下 の 方 法 で行 っ た.ま ず,分 子 量1万 以 下cut offの 限 外 濾 過 フ ィル タ ー(Ultrafilter: TOYO)を 用 い
末梢 血単核 球 由来好 酸球 遊走 因子 の解析
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て10倍 の 濃 度 に 濃 縮 し,つ い で 分 子 量: 10kD以 上 の 物 質 を 含 む 濃 縮 液 を,ベ ッ ド径16mm,高 さ 70cmのSephacryl S 200HRカ ラ ム(Phar macia)を 用 い, pH 7.4のHBSSで4℃,流 速4.5ml/hrに てgel filtrationを 行 い,各 分 画 を1.5mlず つ シ リ コ ン 化 ガ ラ ス 試 験 管 に 分 取 し た. カ ラ ム の キ ャ リブ レ ー シ ョ ン に は, Thyroglobulin (670kD), Gamma globulin (158kD), Ovalbumine (44kD), Myoglobin (17kD),Cyanocobalamin (1.35kD) (Gel filtration standard: BIO-RAD)を 用 い た.分 取 し た 各 分 画 お よ び 限 外 濾 過 の 際 に 得 られ た 分 子 量10 kD以 下 の 濾 液 のECF活 性 を 測 定 し た. 5) Candida抗 原 刺 激 単 核 球 培 養 上 清 中 のIL-5の 同 定-ECF活 性 の 抗 マ ウ スIL-5抗 体 に よ る 中 和 試 験-単 核 球 培 養 上 清 のgel filtration後 の 各 分 画 中 のIL-5の 存 在 を 検 討 す る 目 的 で,種 々 の 濃 度 の リ コ ン ビ ナ ン ト ヒ トInterleukin-5 (rhIL -5:サ ン ト リー)14)と 培 養 上 清 の 各 分 画 液 に, リコ ン ビナ ン ト抗 マ ウ ス(m)IL-5抗 体(オ リ ンパ ス)15)を添 加 し37℃ で2時 間 イ ン キ ュベ ー ト の 後,そ のECF活 性 を 測 定 し,抗 体 非 添 加 時 のECF活 性 との 比 か ら抑 制 率(%)を 算 出 し た. 成 績
1) 単 核 球 培 養 上 清 中ECF活 性 のgel filtra tionに よ る分 子 量 の検 討 対 象 症 例 全 例 のECF活 性 は,図1に 示 す ご と く,す べ て 約20∼65 kDの 分 画 の 範 囲 に 認 め られ, 40∼50kD付 近 に ピー クが 認 め られ た. な お, 10kD以 下 の 分 画 に はECF活 性 は 認 め られ な か っ た. 2) rhlL-5のECF活 性 に及 ぼ す 抗mIL-5抗 体 の 抑 制 効 果
図1 Candida抗 原 刺 激 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 のgel filtrationに よ る各 分 画 中ECF活 性 の 検 討
ECF活 性 は 約20∼65kDに 認 め られ, 40-50kD付 近 に ピー ク が 認 め ら れ た. 10kD以 下 の分 画 に は 認 め ら れ な か っ た. rhIL-5 (5ng/ml)のECF活 性 を 中和 す る の に至 適 な抗mlL-5抗 体 濃 度 の検 討 を行 った と こ ろ,図2に 示 す ご と く抗 体 濃 度 が5μg/ml以 上 でrhlL-5 (5ng/ml)のECF活 性 に 対 し て 約
50%の 抑 制 効 果 が 認 め られ た.一 方 対 照 と し て, 抗mlL-5抗 体 と同 じ くmouseのIgG 1抗 体 で あ る抗 ヒ トGM-CSF抗 体(Genzyme)で は 抑 制 さ れ な い こ とか ら, mouse IgG 1抗 体 自体 に は 抑 制 効 果 が な い と考 え られ た.し た が っ て, 抗mIL-5抗 体 の 濃 度 は,抗 体 過 剰 と考 え られ る 50μg/mlで 充 分 量 と考 え られ,以 下 の 検 討 に は こ の 濃 度 の 抗 体 を用 い た. 図2 各 濃 度 の 抗mlL-5抗 体 のrhlL-5(5ng/ ml)のECF活 性 に 及 ぼ す 抑 制 効 果 抗mIL-5抗 体5μg/ml以 上 で 約50%の 抑 制 が 認 め られ, 50μg/mlで 充 分 量 と考 え られ た. 図3 各 濃 度 のrhIL-5のECF活 性 に 及 ぼ す 抗 mIL-5抗 体(50μg/ml)の 抑 制 効 果 ほ ぼ 濃 度 依 存 性 に 低 下 し, IL-5 50ng/mlで 約50%の 抑 制 が 認 め ら れ た. 逆 に,抗mIL-5抗 体 が50kg/mlの 場 合 に は, rhIL-5の 各 濃 度 に お け るECF活 性 は,図3の ご と く そ の 濃 度 が 上 昇 す る に 従 い 抑 制 率 が 低 下 す る 傾 向 が 認 め ら れ, 5ng/ml以 上 で 約50%の 抑 制 率 で あ っ た.な お,リ コ ン ビ ナ ン ト ヒ ト Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rhGM-CSF)は,図4のcheckerboard assayに 示 す ご と く, IL-5よ り は 弱 い な が ら chemokineticお よ びchemotactic effectを 示
し た が,そ れ は 抗mlL-5抗 体 で は 抑 制 さ れ な か っ た.即 ち,抗mIL-5抗 体 に よ る 抑 制 は, IL -5に 特 異 的 な も の と考 え ら れ た . 図4 rhGM-CSFのECF活 性 上 図:各 濃 度 のGM-CSFに 対 す るECF活 性. 20ng/mlで 活 性 の ピー ク が 認 め ら れ た. 下 図: checkerboard assay. chemokinetic お よ びchemotactic effectが 認 め ら れ た. 3) 単 核 球 培 養 上 清 のgel filtration各 分 画 に 含 ま れ るECF活 性 の抗mIL-5抗 体 に よ る 抑 制 症 例1に つ き約25か ら55 kDま で の 各 分 画 の ECF活 性 に 及 ぼ す 抗mIL-5抗 体 の50μg/mlで の 抑 制 効 果 を検 討 し た と こ ろ,図5の ご と く, お よ そ40∼55kDの 範 囲 で 全 活 性 の 半 分 程 度 の 抑 制 が 認 め られ た. そ こ で,単 核 球 培 養 上 清 中 のECF活 性 が 最
末梢 血単核 球 由来好 酸球 遊 走因子 の解析
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も強 く,抗mIL-5抗 体 で の 抑 制 が 顕 著 と考 え ら れ た40-50kDの 分 画 に つ い て,各 症 例 のECF 活 性 の 抑 制 効 果 を検 討 した と こ ろ,図6に 示 す ご と く50μg/m1の 抗mIL-5抗 体 に よ って76.1% か ら51.9%の 抑 制 が 認 め られ た.し た が っ て, こ の分 画 の 大 部 分 のECF活 性 物 質 はIL-5で あ る と考 え ら れ た.図5 症 例1の 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 のgel filtrationに よ る各 分 画ECF活 性 に 及 ぼ す 抗mIL-5抗 体 の 抑 制 効 果
約40∼55kDで 抑 制 さ れ た.
図6 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 に お け るgel filtration fraction No. 17 (40-50kD)のECF活 性 に
及 ぼ す 抗mIL-5抗 体 の 抑 制 効 果 76.1%∼51.9%の 抑 制 が 認 め ら れ た. 考 察 気 管 支 喘 息 の う ち,特 に 非 ア トピー 群,重 症 群 で は,リ ンパ 球 が そ の 病 態 の 重 要 な役 割 を 担 っ て い る と考 え られ て い る2) 6).一 方,喘 息 病 態 上 の特 徴 の 一 つ で あ る 肺 局 所 へ の 好 酸 球 集 積 に 関 して も,非 ア トピー 群 や 重 症 群 で はCandida 抗 原 刺 激 に よ る末 梢 血 一単核 球 か らのECF産 生 能 の 亢 進 を 認 め て お り, Candida抗 原 に 感 作 さ れ た リンパ 球 を介 す る 細 胞 反 応 型 ア レ ル ギー が 局 所 好 酸 球 浸 潤 を介 して,喘 息 の 重 症 化 に 深 く 関 わ っ て い る も の と思 わ れ る10).そ こ で今 回 は, 喘 息 患 者 末 梢 血 単 核 球 にCandida抗 原 を添 加 し た 際 に 産 生 され るECFの 解 析 を試 み た .そ の 結
果, ECFの 分 子 量 は お よ そ20∼65kDに わ た っ て お り,活 性 の ピー クは40∼50kDで あ っ た. さ ら に, rhIL-5のECF活 性 が 抗mIL-5抗 体 に よ り不 完 全 な が ら 中和 さ れ る こ と を利 用 して, IL-5の 分 子 量 に 当 た る40∼50kDの 分 画 中 に 認 め ら れ たECF活 性 の 中 和 試 験 を行 っ た と こ ろ, 抗mIL-5抗 体 に よ り76.1∼51.9%の 抑 制 が 認 め ら れ,こ の 分 画 に はIL-5が 存 在 す る こ とが 判 明 した. 気 管 支 喘 息 の 発 症 機 序 は 従 来.単一 的 な もの と 考 え ら れ て い た が,種 々 の 検 索 の 結 果 か ら,最 近 で は 喘 息 とい う同 一 の 症 候 で あ り なが ら異 な っ た 疾 患 病 態 が 混 在 して い る と考 え ら れ つ つ あ る.即 ち気 管 支 喘 息 は,そ の 発 症 年 齢 に よ り若 年 発 症 型 と中 高 年 発 症 型 に大 別 さ れ,そ れ ぞ れ 関 与 す る抗 原 お よ び ア レ ル ギ ー 反 応 に相 違 が 指 摘 さ れ て お り,特 に 中 高 年 発 症 型 は 通 年 性 ・非 ア トピ ー 型 の 喘 息 で,そ の 病 態 に はCandidaを 主 要 抗 原 とす る Ⅲ 型 ア レ ル ギ ー 反 応 お よ び Ⅳ 型 ア レ ル ギー 反 応 が 混 在 し た細 胞 反 応 型 ア レ ル ギ ー の 関 与 が 想 定 さ れ て い る1) 2) 3) 4) 6).今 回検 討 した 4症 例 は, IL-5を 主 体 と したCandida抗 原 刺 激 単 核 球 由 来ECFの 産 生 亢 進 を 認 め た.こ れ らの 症 例 の よ うに, Candida抗 原 に 対 す る リ ン パ 球 幼 若 化 反 応 の 亢 進 やCandida抗 原 吸 入誘 発 試 験 で 遅 発 型 気 道 反 応(LAR)が 認 め ら れ る 場 合, IL-5が 重 症 化 ・難 治 化 に 深 く関 与 して い る もの と思 わ れ る. 気 管 支 喘 息 発 作 と肺 の 好 酸 球 浸 潤 との 問 に は 密 接 な 関 係 が 想 定 さ れ て お り,例 え ば抗 原 吸 入 誘 発 試 験 で は,即 時 型 気 道 反 応(Immediate asthmatic response: IAR)発 現 の 前 後 で 気 管
支 肺 胞 洗 浄 液(BALF)中 の 細 胞 成分 に 変 化 は 認 め られ な か っ た が,遅 発 型 気 道 反 応(Late asth matic response: LAR)発 現 時 に は 著 明 な好 酸 球 の増 加 が認 め られ て い る16).また 喘 息 発 作 に よ る窒 息 死 の例 で は,気 管 支 壁 お よび 気 管 支 腔 内 等 肺 局 所 に著 明 な好 酸 球 浸 潤 が 認 め られ る17).か か る好 酸 球 の 顆 粒 中 に 含 まれ るMajor basic protein (MBP)18), Eosinophil cationic protein (ECP)19), Eosinophil peroxidase (EPO)20), Eosinophil derived neurotoxin (EDN)21)な ど
に は 強 い 組 織 傷 害 性 が あ り,喘 息 発 作 死 症 例 の
気 管 支 粘 膜 上 皮 組 織 中 の 好 酸 球 周 囲 に 多 量 の MBPが み ら れ て い る22).ま た,好 酸 球 か ら産 生 され るnewly formed mediatorで あ るLeu kotriene (LT)C423)やplatelet activating fac tor (PAF)24)は 強 い 平 滑 筋 収 縮 作 用 を 有 して い る こ と等 の 報 告 か ら,好 酸 球 は 気 管 支 喘 息 発 作 の 病 態 に お い て 組 織 傷 害 的 に 働 い て い る と考 え られ る. か か る気 管 支 喘 息 に お け る肺 局 所 へ の 好 酸 球 の 浸 潤 は,原 因抗 原 に 対 す る各 ア レ ル ギー 反 応 に 連 動 し て 誘 導 され る もの と考 え ら れ,す な わ ち,Ｉ 型 ア レ ル ギ ー 反 応 に 関 し て は,好 塩 基 球 ・ 肥 満 細 胞 系 が 抗 原 刺 激 を 受 け る と, Hista mine25), Eosinophil chemotactic factor of anaphylaxis (ECF-A)26), PAF27) 28),ア ラ キ
ドン酸 代 謝 産 物29)などのECF活 性 を もつmedia torか 放 出 さ れ,肺 局 所 へ と好 酸球 が 動 員 され る. 一 方 Ⅲ 型 ア レ ル ギ ー 反 応 の 場 合 に は,木 村 は 好 塩 基 球 ・肥 満 細 胞 系 のIgG receptor刺 激 を 介 す る反 応 を想 定 して お り1) 2) 3) 4),そ の 他 に 抗 原 抗 体 複 合 体 に よ る補 体 活 性 化 に よ り産 生 され るC5a に もECF活 性 が 認 め ら れ て い る30).さ ら に Ⅳ 型 ア レ ル ギ ー 反 応 の 場 合 に は,前 述 の ご と く, 非 ア トピ ー 群 ・重 症 群 で はCandida抗 原 に 対 す る末 梢 血 単 核 球 のECF産 生 能 が 亢 進 し て お り, 重 症 化.難 治 化 に 深 く関 与 して い る こ とが 想 定 さ れ る10). 寄 生 虫疾 患 を は じめ とす るア レル ギ ー 疾 患 の 組 織 好 酸 球 浸 潤,あ るい は 好 酸 球 活 性 化 に お け る単核 球 の 関 与 につ い て は数 多 くの 報 告 が あ る. ECFに 関 して は,抗 原 刺 激 され た 住 血 吸 虫 症 患 者 リンパ 球 か ら分 子 量23∼56kDのECFが 産 生 さ れ る31)とか,木 村 氏 病 で はgranuloma中 のT リン パ 球 が 分 子 量45∼70kDと12.5kDの2種 類 のECFを 産 生 す る32)等の 報 告 が あ る.好 酸 球 の 脱 顆 粒 や 補 体receptor発 現, LTC4,活 性 酸 素 産 生,細 胞 傷 害 作 用 な どの 各 種 機 能 を 活 性 化 す る物 質 と して は,中 等 度 の 好 酸 球 増 多症 例 の単 核 球 か ら非 刺 激 下 で も産 生 され る約40kDの Eosinophil activating factor (EAF)33)や,住 血 吸 虫 感 染 マ ウ スの 脾 リン パ 球 を抗 原 刺 激 し た 際 に 産 生 さ れ るEosinophil stimulation promotor (ESP)が 報 告 さ れ て お り, ESPの 主
末梢 血単 核球 由 来好酸 球遊 走 因子の解 析
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た る 活 性 は 最 近 に な っ てIL-5お よびGM-CSF で あ る と報 告 され て い る34).今 回 著 者 が 検 討 した Candida抗 原 刺 激 単 核 球 培 養 上 清 中 のECF活 性 は20∼65kDに 認 め ら れ, IL-5が そ の 主 た る 活 性 で あ る こ とが 判 明 し た.な お,今 回 成 績 と して 示 し て い な い が, GM-CSFの 混 在 を証 明 す る た め, IL-5の 場 合 と 同 様 抗GM-CSF抗 体 を 用 い た 中和 試 験 を試 み た が, GM-CSFの 分 子 量 に 相 当 す る23kD付 近 のECF活 性 は 弱 く検 討 で きな か っ た.そ の 点 に 関 し て は,他 の 報 告 に み られ る よ うに 培 養 上 清 中 に はGM-CSFも 含 ま れ て い る こ とが 想 像 さ れ るが,今 回 の 条 件 下 で はECF活 性 と して は そ の 影 響 は 少 な い と考 え られ た.ま た, 40∼5okDの 主 た る ピ ー ク 以 外 に30kD付 近 に も弱 い ピー クが 認 め られ,未 知 のECFの 存 在 が 想 定 され た が,こ の 点 に つ い て は今 後 の 詳 細 な 検 討 が 必 要 と思 わ れ た. ヒ ト とマ ウ ス のIL-5は,そ の ヌ ク レ オ チ ドお よび ア ミ ノ酸 配 列 に お い て7割 程 度 が 同 じで あ り,こ の た め 抗 マ ウ スIL-5抗 体 で も ヒ トIL-5のECF活 性 が 抑 制 可 能 で あ る と考 え られ た35). 一 方,相 当 量 の 抗mIL-5抗 体 で もrhIL-5の ECF活 性 を完 全 に は 抑 制 で き なか っ た 点 に つ い て は,第1に ヒ トとマ ウ ス 間 で のIL-5の 構 造 の 若 干 の 相 違 に よ る抗 体 のaffinityの 問 題 が 考 え られ た.第2点 と して は,今 回 の 実 験 系 で は, IL-5と 抗mIL-5抗 体 を反 応 させ た 溶 液 を免 疫 複 合 体 を除 去 す る こ と な くそ の ま まECF活 性 の 測 定 に 用 い て お り,抗 体 が 結 合 した と して も IL-5のECF活 性 発 現 部 位 の 残 存 して い る可 能 性 も想 定 さ れ る.し た が っ て,か か る抗mlL-5 抗 体 を 用 い たECF活 性 の 中 和 試 験 で は, IL-5 の 定 性 は 可 能 で あ る が,厳 密 な 定 量 に は不 適 当 と思 わ れ た. 骨 髄 幹 細 胞 に 対 し好 酸 球 の 分 化 増 殖 因 子 と し て 作 用 す る物 質 に は, IL-5, GM-CSF, IL-3 が 知 ら れ て お り36),これ らは 同 時 に 成 熟 好 酸 球 に 対 し て の 活 性 化 能 も有 して い る.即 ち,抗 体 依 存 性 殺 寄 生 虫 作 用 や 貪 食 能,活 性 酸 素 ・LTC4産 生 能 な ど の 亢 進 や,好 酸 球 寿 命 の 延 長,好 酸 球 の低 比 重 化 の 促 進,表 面receptorの 発 現 お よ び 脱 顆 粒 の 増 強 な どが 認 め られて い る37) 38) 39) 40) 41) 42). そ の な か で も,主 に ヘ ル パ ーT細 胞 か ら産 生 さ れ るIL-5は,好 酸 球 に 選 択 的 に 作 用 し,そ れ 自 体 好 酸 球 に 対 す るchemokineticお よ び chemotactic effectを 有 す る9) 43)他, PAFな ど に よ るchemotaxisを 増 強 す る作 用 が 報 告 され て い る44).著 者 の 検 討 で は, IL-5単 独 の chemotactic effectがPAFの そ れ と同 等 と な る濃 度 は100ng/mlと 生 体 内 で は 考 え難 い 高 濃 度 で あ り,実 際 の ア レル ギ ー 性 炎 症 の 場 で は, IL -5が 単 核 球 由 来 の 他 のECFやPAF等 の サ イ トカ イ ン との 相 乗 効 果 を発 揮 す る こ とに よ っ て 好 酸 球 の 局 所 へ の 遊 走 が 起 こ っ て い る と想 像 さ れ る.さ らにIL-5は, CD11/18 receptor com plexを 介 す る好 酸 球 の粘 着 能 を亢 進 させ る との 報 告 もあ り45),アレル ギー 反 応 局 所 へ 好 酸 球 を持 続 的 に 集 積 させ,か つ 活 性 化 させ て 組 織 傷 害 を 増 強 し,喘 息 発 作 を遷 延 化 させ,さ らに 非 可 逆 的 ・器 質 的 な変 化 を誘 導 させ る と考 え られ る. 以 上 の ご と くIL-5,す な わ ち気 道 局 所 の リン パ 球 は ,気 管支 喘息 の重症 化 ・難 治化 要 因 とし て 重 要 な役 割 を演 じて い る と考 え ら れ る. 結 論 Candidaを 主 要 抗 原 とす る気 管 支 喘 息 患 者 の 末 梢 血 単 核 球 をCandida抗 原 で 刺 激 した際 に 産 生 さ れ るECFの 分 析 を 試 み,以 下 の 結 果 を得 た.(1) 単 核 球 培 養 上 清 中 のECFは, gel filtration に て20∼65kDに 認 め られ, 40∼50kDに 活 性 の ピー クが 認 め られ た. (2) rhIL-5のECF活 性 は,抗mIL-5抗 体 に よ り抑 制 さ れ た. (3) 培 養 上 清40∼50kDの 分 画 中 のECF活 性 は,抗mlL-5抗 体 に よ っ て 抑 制 さ れ, IL-5の 存 在 が 示 さ れ た. 以 上,カ ン ジ ダ 喘 息 患 者 で は,抗 原 刺 激 に よ り産 生 さ れ た 単 核 球 由 来 のECFにIL-5が 含 ま れ て お り, Candida抗 原 に 感 作 さ れ た リ ン パ 球 を介 す る Ⅳ 型 ア レル ギ ー 反 応 が 好 酸 球 の 局 所 集 積 を介 す る重 症 化,難 治 化 に 重 要 な役 割 を 担 っ て い る こ とが 想 定 さ れ た. 稿 を終 え るにあ た り,終 始御 指 導御 校 閲 を賜 った 恩 師 木村 郁 郎教 授 に深 甚 の謝 意 を表す と共 に,直 接
御 指 導 頂 い た高 橋 清 講 師に 深 謝致 し ます. (本論 文 の要 旨は 第40回 日本 ア レル ギー 学 会 総会 に て 発 表 し た 。) 文 献 1) 木 村 郁 郎:喘 息 の 病 型 とそ の 本 質 論-中 高 年 発 症 型 難 治 性 喘 息 の 独 立 性.日 本 胸 部 疾 患 学 会 雑 誌(1983) 21, 181-182. 2) 木 村 郁 郎:気 管 支 肺 病 変 に お け る ア レ ル ギー と リ ンパ 球.ア レ ル ギ ア(1990) 19, 12-16. 3) 木 村 郁 郎:遅 発 型 ア レ ル ギ ー の 発 症 機 序 一 細 胞 反 応 を 中 心 に:第3回 免 疫 薬 理 シ ン ポ ジ ウ ム 議 事 録,デ ー ・ エ ム ・べ ー ・ジ ャ パ ン,東 京(1985) pp 23-40 . 4) 木 村 郁 郎:気 管 支 喘 息-そ の 病 態 と 好 塩 基 球-.ア レ ル ギー 診 療(1986) 5, 119-131. 5) 月 岡 一 治:カ ン ジ ダ 喘 息 の 発 症 機 序 に 関 す る研 究-第3報,吸 入 誘 発 型 と Ｉ型 及 び Ⅲ 型 ア レ ル ギ ー の 関 連 に つ い て.ア レ ル ギ ー(1985) 34, 289-296 . 6) 宮 川 秀 文,難 波 一 弘,白 石 高 昌,名 部 誠,槇 本 晃,佐 藤 恭,武 田 昌,多 田 慎 也,高 橋 清,木 村 郁 郎:重 症 難 治 性 喘 息 に お け る Ⅳ 型 ア レ ル ギ ー の 関 与 に つ い て-Candida抗 原 に よ るIL-2産 生 能 と好 中球 遊 走 活 性-.ア レ ル ギ ー(1988) 37, 12-18. 7) 福 田 健,沼 尾 利 郎,阿 久 津 郁 夫,本 島新 司,牧 野 荘 平:1型 ア レ ル ギ ー 反 応 に お け る 好 酸 球 遊 走 活 性 メ デ ィ エ ー タ ー の 解 析;第5回 免 疫 薬 理 シ ン ポ ジ ウ ム 議 事 録,デ ー ・エ ム ・べ ー ・ジ ャ パ ン.東 京(1987) pp 59-72.
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