機構 代 謝反応 キ ド キ 球 ト赤

金 沢大学十 全 医学 会稚 託 第9 6巻 第6 号 1 2 0 5冊^{12 1 8} く1 9 抑 ₁ 2 05

ヒト赤^血球^にお け る3 ⁻ ヒ ド^ロ キシキヌ ^{レ ニ} ン の代謝反 応機構

金沢 大学 医 学 部生化 学 第^一講座 _{く主 任}こ米山良昌 教 掛

山 口 順 退

く昭和^{6 2}年^{1 2}月1 5日受付う

ト リ プ ト^ファン代 謝 中 間 体であ る 3−^{ヒドロ キシキ ル ニ ン}を^ヒト赤 血 球 浮遊 液に加え， pH 7^．0，

3 7⁰C で インキエ ペ ^ー 卜 し た ところ， 赤 血球 中^{の メ}ト^ヘモグロ ビ ンが増加し た． この^ヘモグ^ロ ビンの酸 化 反 応に共役して，3^一ヒドロ キ^シキヌレ ニ ンは茶 褐色^の物 質に変 化し た．この物 質は 3^一ヒド^ロキシキ ヌレ^ニンが 2 分子縮 合し た キ サ^ント^マチンで あ ること が， 紫 外^．可視吸収ス ペク トル， 赤外^吸収^{ス ペ}ク ト^ル， 高速 液体 ク^{ロ マ}ト グ ラフ ィ ^ー t 薄 層クロ マ ト グ ラフ ィ ^ー な ど^によ る 分析^から同 定さ れ た． 精 製し た オ キ^シヘモグ^ロ ビンと 3^−ヒド^ロ キシキ ル ^ニ ンを反 応さ せ る と^ヘモグロ ビ ンはメトヘモ グ^ロ ビ ン に酸 化さ れ 3^．ヒドロ キ シキヌ レ^ニ ンは キ サ^ント^マチン に縮 合さ れ たこと^から， 3^．ヒド^ロ キシキ ル ニンの キ サント^マテ^ンへの 2 分子縮 合反応は^ヘモグロ ビン の酸 化反応と共 役^{し て}起^こること が 示 さ れ た． ま た メ トヘモグ^ロ ビンを含 有 す る赤血球 浮 遊 液に3⁻ヒド^ロ キ^シキヌ レ^ニ ンを加え て同様 条 件でインキュベ ^ー ト した と^ころ， 赤血 球 内^の メ ト^ヘモグ^ロ ビ ンは還元 さ れ，3^疇ヒド^ロキシキヌ レ^ニ ンは縮 合してキ サントマテン に変化^{し た．} 精製し たメ ト^ヘモグ^ロ ビ ンで も同じ く キ サントマチ^ンが生 成さ れ た− こ のよ う な キ サント^マテンの生成は嫌気 的条 件 下で は み ら れ な かっ た． 以 上^の結 果はヒト赤血球 内で の3⁻ヒド^ロキシキヌ レ ^ニン のキ サント^マテ^ンへの代 謝は^ヘモグ^ロ ビン の酸化 還元反応^に共 役して起^こる^こと， ま た そ の 反応には酸 素の存 在が必 要^であ ること を 示 して いる．

E ey ^w

ro rds ヒト赤血 球^{， ヘ モ}グ^ロビ ン， 3^．ヒド^ロキシキメ^レニ ン， キ サント^マテン

ヒト赤 血 球 中^{のヘ モ}グ^ロ ビン の生理的 役 割は酸 素の

運搬^であ る^{． ヘモ}グロ ビン の酸素 結 合 作用に つ い ては 多く の研 究が な さ れてお り その構 造と機 能^{に つ い}て は 詳し く わ かっている^1ト3j． しか し な が ら^ヘモグロ ビ ン が薬物あ る^いは生理的 化 合物を代 謝す る と^いうことに つ い ては， これ ま^でほ と ん ど報 告さ れ ていな^{か っ}た．

従来よ り ア^ニ リン の よ う な薬 物は チ ト クロ ^ー ム P4 5 0

によって代 謝さ れ ること が知ら れて いる が^刷， ヒト赤 血 球に お い て も ア ^ニ リ^ンが水 酸 化さ れ る^こと を To m oda ら^6，は見^い出し た^． M ieyal ら^7，は^ヘモグ^ロ ビ ンが， この ア^ニ リ^ン水 酸化 活 性を持^っ て^いること を報 告し て^いる． 筆 者は， ヒト赤血球 内^{の ヘモ}グ^ロ ビンが 薬物の代 謝を行う という観 点から， 赤 血 球^{に お}け る ト リ プ トファン の代 謝 中 間 体で あ る 3^−ヒド^ロ キンキ^ヌ レニ ンく3⁻hydr o xykyn u r e nin e，3⁻H K Nl との反応を 詳_{し く}調^べた． その結 果，3 月 K N は赤 血 球 内^へモグ^ロ

ビンと反 応し， ヘモグロ ビンを酸 化 あ^るいは還元 す る と同 時^に自ら は 2 分子縮 合してキ サ^ント^マチンという 化 合物に変 換さ れ ること を見^い_{だ し た}． 3 月 K N はヒ ト体 内で は通 常 肝 臓お よ び腎 臓でキヌ レ ニ ナ ^ー ゼに よ^っ て代 謝さ れ， 3^−ヒド^ロ キシア^ント ラ^ニル酸 く3⁻ h_ydr o xya nthr anilic a cid，3⁻H A Al ^にな る か， ト ラン ス ア ミ ナ ^ー ゼ で 代 謝さ れ て キ サ ン ツ レ ン酸 くx a nthu r e nic a cidI ^にな る と考え ら れて いる^． 本 研 究 で は 3 月 K N と赤血球お よ び ^{ヘ モ}グ^ロ ビンとの反応 を， 種々 の条 件 下で調べその反応 機 構に つ いて検 討し た^．

材 料およ び方法

I ^． 材 料

1 ． 試薬

3 月 K N は和 光 純 薬 く東 京フ 製を用^いた． ビス^．ト リ A b bre viatio n s 二 A C D_， a Cid citr ate de xtr o s e ニde oxyH b de o xyhe m oglob ini3⁻H A A， 3⁻ h_ydr o xy^{a n}thr a nilic a cid _ニH b C O， C a rbo xyhe m ogl ^{ob in}3 3⁻H K N， 3⁻h_ydr o xyk_yn u r e nin e3 Ht，

he m ato c ri_{t i} H P L C， high p^{e r}fo r m a n c e li_quid chr o m atog^{r a}ph_{y ニ}m etH b， m ethe m oglob in i

1 20 6

ス亡^{b is} く2⁻hydr o xyethyll i mi n o⁻tris くh_ydr o xy⁻ m ethyllm etha n eコ^{はシグマ社 く米 国lよ り，Sephade x}

G⁻2 5 Cfin e gr ad^e ま た はc o a r s e gr adel と C M ⁻ Sephade x C⁻50 は， ファル マ シア社 く^スウ^{ェ ー} デン1

よ り購入 し た． 等 電 点電 気 泳 動用平板ゲルは アン フ ォ ラ イ ンポ リ ア ク リ ^ル ア ^ミ ド ゲル プ ^{レ ー} ト くpH 3^．5^旬9^．引くフ ァ ル^マ シア ^ーL K B 社， スウ^{ェ ー} デンつを

使 用し た． ス ^ー パ ^ー オ キ サ イ ド ジ^{ス ム} タ ^ー ゼ くs up^{e r o x}ide d is m uta s e，S O Dl はマイ^{ル ス}ラ ボ ラ ト リ ^ー 社 く米 国I， カ タ ラ^ー ゼ は^{ベ ー} リンガ^一 社 く西独1 よ り得た．

2 ． 赤血 球お よ び^ヘモグ^ロ ビン の調 製

日本赤 十字^{セ ン}タ ^ー 金 沢 支 部よ り得た採血後2 ^へ 3 日 を経た^ヒト A C D く^{a c}id citr atede xtr o s el 保 存血液 を実 験^に用^いた． これ を遠心分 離 く3，00 0 ^rp^{m ，}15分1 し た の ち血 祭と額 粒 球 層を減 圧 吸 引^にて除去し た． そ こへ約4 倍 容 量の水 冷0^．9％塩 化ナ ト リ ウム溶 液を加 え て洗浄し たのち， 遠 心 分 離 ほ，0 0 0 rpm ， 15 分I ^に ょ^って上 浦を除^いた^． この操 作を⁴ 回繰り返し て洗 浄

ヒト赤 血 球を得た． こ のよ う^にし て得た赤血球を ク^レ ブ^{ス ．}リ^ンガ ^ー液 亡1 0m M リン酸 緩 衝 液 くp王1 7^．4つ，

0^．8％NaC l，10 m M K C l，2m M M gCl2j ^に浮 遊し^て 実 験^に用^いた．

赤 血 球 中の^{ヘ モ}グロ ビン の酸 化は井田の方 法^別に従

い亜硝 酸ナ ト リ ウ^ムを用^いた^．

精製^ヘモグ^ロ ビンは次の方 法で得た^引． 洗 浄 赤血球

にイ オ^ン交換 水を約5 倍 容 量 加え て溶 血し， 遠心分離 く1 0，00 0 ^rp^m ，3 0則 しゴ ^ー スト を除き粗^{ヘ モ}グロ ビン

溶 液を得た． 得ら れ た^ヘモグ^ロ ビン溶 液を S^ephade x

G⁻25 ほ^{n e} gr ade， 1 0^m M リ^ン酸緩 衝 液， pH 6．3 で 平 衡 化1 カ ラムで ゲルろ過し た． つ づ ^い て C M ⁻ Sephade x C⁻5 0 カ ラム く1 0 m M リ^ン酸 緩 衝 液， pH 6^．3 で平 衡化うを用^いて精 製し た^gl． メ ト^ヘモグ^ロ ビン

は精 製^ヘモグ^ロ ビン に ヘム濃 度^の4 倍 量のフ ェリシア ン化カ リ ウ^ムを加え て得た^{9I． ヘモ}グ^ロ ビンの実 験で は緩衝 液は 0^．1 M N aC l を含む 0^．05 M ビス^■ ト リス

塩 酸 くpH 7．01 溶液を 用^いた．

3 ^．3^．H 壬くN お よ び キ サ^ント^マ チン の調 製 3 月 K N を小 童^の1 N 塩酸 溶 液で溶^か し， つ い で 0．1^へ0．5 N 水 酸 化^{ナ ト リ ウム}溶 液でpH を中 性に戻 した^． ク^レブ^ス．リ^ンガ^ー液ま た は 0^．0 5 M ビス^． ト リ ス塩酸緩 衝 液 くpH 7^．0うで希 釈し て 1 5 ^m M に調 整し た． キ サント^マテンは Bute n a ndt ら の方法^{1 01}に従って

合 成し た． ま た 3 月 E N ^{の モ ル}吸光 係 数は， ど3 7 0 n m^こ

4，2 4 0 く0．0 2 M リン酸 緩 衝 液，pH 7．31 ^川 を， キ サント

マ テ^{ン につい}て はど4 4 0nm

ニ1 3，2 0 0 く0^．15 M リ^ン酸 緩 衝 液， pH 7^．0^{1 2I}を用^いた．

I工^． 赤血球と 3^一正 E N との反応 条 件^およ び 反応生 成 物^の分離

1 ． 赤血球と 3 月 K N と^の反応

洗 浄 赤 血 球はヘ マ ト ク リッ トくhe m ato c ritJ 川 を 1 5 ^へ2 0％と な る よ う^にク^レ ブス^． リ^ンガ ^ー 液に浮遊し た． 3⁻H K N 溶 液 く最終 濃 度^{3 m M l を}加え た^のちpH 7^．0， 3 7⁰C で反 応さ せ た^．

2 ^． 反応 生 成 物^の分離 ^．分 析

一定 時 間毎^に反応 溶液^{の 一}部 く0^．5^へ1 ^．O mりを取り 凍 結 融 解で溶 血し たのち， 遠心 く1 0，0 00 rp^m ，5分1し 赤 血 球 膜を除^いた． 上清 く0^．2 ^旬0^．5 mlう を 20^へ100

m M リ^ン酸 緩 衝 液 くpH 7．01 で平 衡化し た Sephade x

G ⁻2 5 Uin e gr ade，0^．5X lOc ml カ ラム に かけ てヘモ グ^ロ ビン分画と 3 月 K N お よ び 反応生成 物 分 画を分取 し た^． 得ら れ た^ヘモグ^ロ ビン溶 液を等電 点 電 気 泳動し，

そ れ を^二波長T L C スキャ ナ^ー く島津G S⁻9 0 01 ^でゲ^ル スキャ ン^ニ ング く6 3 0n mうし て オ キ^{シ ヘモ}グ^ロ ビン，

部 分 酸 化型^{ヘ モ}グ^{ロ ビ ン}， メ ト^ヘモグ^ロ ビ ン の割合を 求め た⁸¹．

3^．H K N の反 応 生 成 物に つい て は可 視 吸 収^スペク ト ルく3 60 ^ル5 0 0 n mう を測 定し経 時 的^にその変 化を追跡 し た． ま た そ^の分画^に1 ％アスコ ル ビ ン酸を加え^て還 元し同 様^に可 視 吸 収^スペ ク ト^ル く3 6 0^へ55 0 n mうを調

べた．

上記の反応を ア ザ イ ド く^{a z}ide， NaN ，， 最終濃 度5

m Ml ま た は ^一 酸化 炭素 くc a rbo n m o n o xide，C OI ガ ス存 在 下で行^{い こ}れ らの反応^への影 響を調^べた．

H L 赤血球^による3⁻H K N の代謝 産物^の同定方法 1 ^． 反応 生 成 物^の精製

前 述と同様の方 法で得ら れ た 反応 生成 物を含む溶液

に最 終 濃 度が1 ％にな る よ う^にアスコル ビ ン酸ナ ト リ ウ^ムを加え る と赤紫 色^の結 晶が析 出し た． こ の溶 液を 遠心分 離 く軋 0 00^rpm ，1 5分う し結 晶を沈澱 さ^せ回収 し た． 0．1 N 塩酸溶 液^で洗^い再び遠 心 分 離で 回収す る 洗 浄 操 作を数回繰り返し た． これによ り未反応^の3^． H K N と リ^ン酸を除くこと が出 来る^． 得ら れ た 還 元物 質を メ タ^{ノ ー ル}塩 酸^から再結 晶^州し て 反応 生成 物を得

た．

2 ^． 赤 外 吸収^{ス ペ}ク トル

o xyH b o r H b O2，O Xyhe m oglobin3 Q ，q^uin o n efo r m of 3⁻h_ydr o xyk_yn u r e nin e三R B C ，r ed bl^{o o}d

c ell_ニSQ ， S e mi_quin o n e fo r m of 3⁻h_ydr o xyk_yn u r e nin eニS O D_， S up^{e r O X}ide dis m uta s eニT L C，

th inlay^{e r c}hr o m atog^{r a}ph_{y ニ}U V _，ultr avi 01et ニ^{V，V O}lu m eニX T ， X a ntho m m atin．