検 法 法 胞 ヤ 疫組織化学 作 神経 布

金沢 大 学 十 全 医 学 会 雑 誌 第

1 0 6

巻 第

4

^･

5

号

4 4 5

^‑

4 6 4

(

1 9 9 7

)

ヒト脳 ^におけ^{る コ} リ^ン作動 性神経^の分布^:

コ リ^ン アヤ^{チル トラ ン ス フ}

^エ

^{ラ ー ゼ に村 する免疫組織化学,}

細胞内^ハ イ_{プ リ ダ イ} ゼ ^ー シ ョ ン法,

ラ ジ オ^{エ ン}ザイ^ム ア ツ セイ法^による検討

金 沢 大 学 医 学 部 医 学 科 第^一 病 理 学 講 座 ( 主 任: 中西 功 夫 教 授)

笠 島 里 美

4 4 5

コ ¹

)

^ン

ア セ チ

ル

ト ラ

ン ス フエ

ラ

^ー

ゼ

(^c

^h

^o

^li

^{n e a c e}t y

l

tr a n s

f

_{e r a s e}

,

C h A T

)

は

, 神 経 伝 達物 質^{の 一 つ}

で

あ

る ア セ チ

ルコ

リ

ンを

生

合 成 す

る

酵 素

で

あ

る

^.

C h A T は ア セ チ

ルコ

リ

ン

を

伝 達 物 質

と し て

機 能す

る

コ

リ

^ン作 動 性ニ ュ ^ー ロ ン の特 異 的 な^{マ ー}

^カ

^ー

で

あり,

そ

^の機 能 動 態 を 知

^{る た め}

^の最 も

^よ

^い指 標

^と

考^え

^{ら れ て}

^い

^る

^. 本研 究

で は

, 非 神 経 疾 患 患 者

1 0

症 例^の剖 検 脳 を 対 象

^と し て

,

1

)

^{コ ン}

ビ ナ

ン

ト

^ヒ

ト C I

I

A T

蛋 白

に

対 す

る ポ リ ク

^{ロ ー}

ナ

ル抗 体 を 用^い

た

免疫 組 織 化 学, ヒ

ト C b A T リ ボ

^ヌ

ク レ オ チ ド プ

^ロ

ー

ブ

を 用^い

た

細 胞 内^ハ

イ プ リ ダ イ ゼ

^ー

シ

ョン (

ⁱ

^{n s}

ⁱ

^tu

^h

y

b

r

id i

z at

i

o n,

IS H

) 法,

お よ び ラ ジ オ

エ ン

ザ イ

ム ア ッ

セ イ

法

に よ る C h A T

活 性^の測 定 を 行^っ

て

, ヒ

ト

脳

に お

け

る C h A T

の発 現

と

局 在 を 形 態 学 的

お よ び 生

化 学 的

に

検 討

し た

^. 免 疫 組 織 化 学 的

に

陽 性

で

あ り,

か

つ,

I S H

法

で

陽 性

シ グ ナ

^ルを 有 す

る

神 経 細 胞

^は

前 脳 基 底 部 (^マイ ネ^ル

ト

基 底司乳

^ブ

^{ロ ー}

^カ

対 角 帯), 新 線 条 体 ( 尾 状司乳 被 殻, 側 座 核), 大 脳 皮 質, 中脳 橋 ( 脚 橋 被 蒙 核, 外 側 背 側 被 蓋 核, 傍

二 丘

体 核), 脳 神 経 核 ( 動 眼神経 核, 滑 車 神 経 核,

≡

叉神 経 運 動 核, 外 転 神 経 核, 顔 面 神 経 核, 舌咽 神経 前 位 核, 迷 走 神 経 背 側司乳 副 神経 核, 舌

^下

神 経 核)

^に

認

^{め ら れ た}

^. 内 側 中 隔核

^と

内側 手 綱 核

^は

免 疫 組 織 化 学

^で

陽 性

^で

あ^っ

た が

,

I S H

法

^{で は}

陽 性

シ グ ナ

ル

を

確 認

で

き な

か

っ

た

^. 本 研 究

で は

特

に

,

ヒ

ト

大 脳 皮質

^に

^コ

^リ

^ン作 動性^{ニ ュ ー} ロ ン

が

存 在 す

る

こ

と

,

そ し て

,

そ

^の分 布 密 度

が

皮 質 領 野

と

層

に よ

^っ

て か

な り 異 な

る こ と

を

は じ め て

明

ら か に し た

. 大 脳 皮 質

^{に お}

^い

^{て C b A T}

発 現 を 示 す神 経 細 胞

^は

,

ほ と ん ど が

錐 体 細 胞

^で

あ り, 陽 性 非錐 体 剛 包

は

辺 緑 葉^{の 一} 部

に

限 局

し て

^い

た

^. 陽性 錐 体 細 胞

^は

運 動 野

^に

高 密 度

で

,

そ れ

以 外^の領 野

で は

運 動 前 軌 ^二次 感 覚 野, 辺 緑 葉

に

若 干 多く,

連 合 野

で は ご

く

わ

ず

か で

あ^っ

た

.

一 次 感 覚

野 お よ び

側 頭葉^の大 部 分

^{に は}

認

^{め ら れ な か}

^っ

^た

^. 層 間

^で

比 較 す

^{る と}

, 第

^V

層^の陽性 細 胞

^は

運 動 野

に

高 率

^で

あ り, 第

Ⅲ

層^の陽 性 細 胞

は 二

次 感覚

^{野 に}

比 較 的 多

^か

^っ

^た

^. 連 合

野 お よ び 辺

緑 葉^{の 一} 部

で は

第

Ⅲ

層,

Ⅴ

層 共

に

陽 性 率

は

低

か

^っ

た

.

一 方, 免 疫 組 織 化 学

とI S Il

法

で C l

l

A T

陽性 神 経 細 胞

^を

認

め

な

か

っ

た

領 域

に

も, 多く^の免疫 染色 陽 性 線 維

^が

確 認

さ れ た

^. 大 脳 白 質

に は

,

び

慢 性

に

陽 性 線 維 を 認

め

, 特

に

, 側 頭 葉 自 質

に

多

^か

^っ

^た

^. 海 馬

^{で は C A 2}

区 域

か ら C A 3

区 域

に か

け

て

, 扁 桃

で は

基 底 外側 核

に

密

で

あ^っ

た

. 視床

で は

, 全

て

^の領 域

に

陽性 線 維

が み ら れ

, 特

^に

視 床 内 側 髄 板, 外側 髄 板, 外 側 膝 状 体

^に

高 密 度

^{に み ら れ た}

^. 黒 質, 腹 側 被 蓋 野, 赤 接

お よ び

視 床

下

核 を 取 り 囲

む

領 域 も 陽性 線 維 を 含

^{ん で}

^い

^た

^{. ノ}J^､脳

に は

陽 性 線 維

^が

粗斗削^こ

^{み ら れ た}

^. 脳 組 織^の

C h A T

活 性

を

測 定

し た と

こ

ろ

, 免疫 組織 化学^で陽性 神 経 細 胞

が

確 認

^{さ れ た}

り 陽性 神 経 線 維

が

豊 富

^に

分布

^し

^{て い}

^る

領 域

^に

高^い

^{C h A T}

活 性

^が

検 出

^{さ れ る}

傾 向

^に

あ り, 免 疫 組 織 化 学

とI S H

法^の所 見

を

裏 付

け た

^. す

な わ

ち,

前 脳 基 底 部

^と

新 線 条 体

^で

高値 (

50 0

^‑

30 0 0

pm o

l

/ 分/ m g蛋白 量)

で

, つい

で

淡 蒼 球, 視 床

お よ び

扁 桃^の括 怖

が ほ ぼ

同 程度

に

高 く,

海 馬

は

^こ

れ ら よ

り

や や

低 値

で

あ^っ

た

. 運動 野

が

他の大脳 皮 質 領 野

^{よ り わ}

ず

か に

高値^で, 小 脳 皮 質

^が

最 も低

^か

^っ

^た

^.

^{以 ヒ}

^の様

^に

,

比 較 的 限 局 性

に

存 在 す

る

^コ

リ

^ン作 動 性^{ニ ュ ー ロ ン}

が

脳^の多く^の領

域 に

広 く 投 射

し て

^い

る

こ

と が

示

さ れ た

^.

E e

y

^{w o r}ds cholin e a c e

t y

l

t

r a n sfe r a s e_,hu m a n_,br ain_,im m u n oh is

t

o che mis

t

r

y

^,in si

t

uh

_y

b ri diz a

t

io n

ア セ チ

ルコ

リ

ン(^{a c e}t y

l

c

h

o

li

n e_,

A C h

) を 合 成

し

伝 達 物 質

と し

て機 能す

る

神 経 細 胞

は

^コ

リ

ン作 動 性^{ニ ュ ー ロ ン}

と

称

さ れ

,運 動,

睡眠, 覚 醒, 認 知, 学 習, 記憶 な

^{ど に}

重 要

な

役 割を 担^っ

^て

^い

る

^.

A C h は 1 9 2 1

年

に L

o e w

i

^{l )}

に よ

っ

て は じ め て

神 経 伝 達 物 質

と し て

同 定

さ れ た が

, 神経 系

^{に お}

け

る

コ

リ

ン作 動 性^{ニ ュ ー ロ ン}

^に

関 す

る

形 態 学 的研 究

^が

成 果 を あ げ 始

^{め た}

^の

^{は 1 9 8 0}

年 代

に

なっ

て か

ら で あ る

^. 当 初

は

ア セ

チ

^ルコ

リ

^{ン の}分 解 酵 素

で あ る

ア

セ テ

^ルコ

1

)

^{ンエ ス}

テ ラ

^ー

ゼ

(^{a c e}t y

l

c

h

o

li

n e ste r a s e,

A C h E

)

^に

着 日

^し

,

そ

の

組 織 化 学 染 色

に よ

^っ

て

^コ

リ

^ン作 動 性^{ニ ュ ー} ロ ン の脳 内の分 布

や

投 射 領 域 な

ど

の形 態 学 的 解析

が

行

わ れ て

^い

た

.

し か し

,

A C h E

自 体

^は

^コ

^リ

^ン作 動 性^{ニ ュ ー ロ ン}

に

特 異 的

な

酵 素

で は な

く, コ

リ

ン作 動 性^ニ ュ ^ー ロ ン

が

投 射

し

^て い

る

神 経 細 胞 あ

る

^い

は

効 果 器

に

平 成9 年⁶ 月2 7 日受 付, 平成⁹ 年⁸ 月⁸ 日受理

A b br evi a

t

io n s

:

A C h, a C e

t y

lch olin e

;

A C h E, a C e

ty

lch olin e s

t

e r a s e

;

C 鮎 汀, Cholin e a c ety¹

^t

^{r a n sf6r a s e}

;

G A B A_,

_g

_{a m m a}

a min obu

ty

lic a cid

;

I S H_,in si

t

u h

_y

bridiz a

t

io n

;

N G Fr

, n e rv e

g

^{r O W}

t

h f^{a c}

t

o r r e c e

p t

^{o r}

;

P B S,

P

h o s

p

h a

t

e buffe r s al in e

;

V A C h T,V e Si_{c u}lar a C et

y

lch olin e

t

r a n s

p

^{o r}

t

e r

4 4 6

も存 在 す

る こ と か ら

,

A C b E

の組 織 化 学

に よ る

形 態 学 的研 究

に は

問 題

^が

指 摘

さ れ て

^い

た

^{2) 3 )}.

山 方, コ

リ

^ン

か ら ア セ チ

^ルコ

リ

^ン を

生

合 成 す

る

酵 素^であ

る

^コ

リ

ン ア

セ チ

^ル

ト ラ

^{ン ス フエ}

ラ

^ー

ゼ

(^c

^h

^o

^li

^{n e a c e}t y

l

tr an S

f

e r a s e,

C h A T

)

^は

, コ^l

)

^ン作動 性^{ニ ュ ー ロ ン}

の最 も 特 異 的

な

^{マ ー}

カ

^ー の ^一 つ

で

あ り,

そ

^の活性

^は

^コ

^リ

^ン作 動 性 神 経^の機 能 動 態

^{を よ}

く 反 映 す

る と

^い

わ

れ

て

い

る

^4).

19 8 0

年 代 中 頃

か ら C 山1 T に

対 す

る ポ リ ク

^ロー ナ^ル

^{お よ び}

^{モ ノ}

^ク

^{ロ ー}

^ナ

^ル 抗 体

^が

開発

^{さ れ て}

免 疫 組 織 化 学

が

可 能

に な

り, 中 枢 神 経 系

に お

け

る

^コ

リ

^ン作 動 性^{ニ ュ ー ロ ン の}詳 細

^な

分 布

^が

報 告

^{さ れ は じ め} た

.

1 9 90

年代

に 入 る と

,

C h A T

m

R N A

の存 在^の有 無 を 確 認 す

る

細 胞 内^ハ

イ プ リ ダ イ ゼ

^ー

シ

ョ ン (

ⁱ

^{n s}

ⁱ

^tu

^h

y

b

r

idi

z at

i

o n,

IS H

) 法

が

確 立

さ れ

, こ

れ

を 用^い

^た

最 も信 頼 性^の高^い形 態 学 的 解 析

が

可 能

^と

な^っ

^た

^{. マ}

^ウ

^ス,

ラ

ッ

ト

, ネコ _,

サ

^ルな

ど

^の実 験 動 物

を

対 象

と し た

形 態 学 的 研 究

で は

, 中枢 神 経 系

に

お け

^る

^コ

リ

^ン作 動 性

ニ ュ ^ー ロ ン の分 布

^に

^{つ い}

^て

概

^ね

研 究 者 間

^で

^一致 を

み

て

お

り,

以 下

^の主 要 な 領 域

^に

ま

と め ら れ て

^い

る

^. す な

わ

ち, 前 脳 基 底 部 ( 内側 中 隔核,

ブ

ロ ^ー

カ

対 角帯 垂 直 枝

お よ び

水 平枝, マ

イ

ネル

ト

基 底 核), 新 線 条 体 ( 尾状 核, 被 殻, 側 座 核), 間 脳 ( 内側 手 綱 核),

上

部 脳 幹 (

^{二 丘}

傍体, 外 側 背 側 被 蓋 核, 脚 橋 被 蓋 核),

お よ

び 脳神 経 核

^と

脊 髄 前 角^{5 卜8)}

^で

あ

^る

^.

^{し か}

し, ヒ

ト

脳

^に

関 す

る

同様^の研 究

は

数 少 な く, ま

た

, 陽 性 線 椎^の分 布

に

^{つ い}

て

の報 告 も 断 片 的

^で

, 不 明 な点 も 少

^な

く

^な

^い.

^そ

^こ

^で

, 本 研 究

^{で は}

,

ヒ

ト

脳 全 域

に

村

し

て

C h A T

の免 疫 組 織 化 学

^{とI S E}

法,

お よ び C h 打r

活 性^の計 測

^を

行^って, ヒ

ト

の中枢神 経系

^{に お}

^け

^{る C b A T}

の発 現

と

局 在 を形 態 学 的

お よ び

生 化 学 的

^に

検 討

し た

^. 対 象

お よ

び方 法

Ⅰ. 症 例

金 沢 大 学 医 学 部 病 理 学 第^一講 座

に お

^い

て 1 9 9 4

年

⁴

月

^{か ら 19 9 6}

年

⁷

月

の

間

に

剖 検

さ れ た

関 頭 症 例

2 3

例^のう ち, 臨 床 的

に

も 病 理 学 的

に

も神経 系

に

著 変

^の

な

^か

^っ

^{た 1 0}

症 例 を 対 象

^{と し た}

( 全

^て

男 性, 年 齢

1 7

^〜

8 9

歳, 平 均

6 1

歳)^. 対 象 症 例

の

臨床 病 理 学 的 事項

は

, 表

1 に

ま

^{と め た}

^.

Ⅱ

. 脳

の

固 定, 包

埋 お よ

び 組織 染 色

脳 を 採 取

^{し た}

後, 水 冷

^{し た 4 %}

^パ

^ラ

^{フ ォ ル ム}

^ア

^ル

^デ

^ヒ

^ド

溶 液 (p

H 7

^.

4

) を 両 側 内 頚 動 脈

^{お よ び}

椎 骨 動 脈^へ注 入

し

,

さ ら に

同 固 定 液 中

^{に 2}

^〜

³

週 間 漬

^{し た}

^.

²

症 例

に

つい

て は

, 組 織 中^の

C l

l

〟r

Ta

b

le l･

C

linic o

p

^{at holog ic}

fi

nd ings ofc a s ese x a min ed

活 性

^を

測 定 す

^{る た め}

, 後 述^の

^{ご と}

く, 国 定前

^に

脳 組 織^{の →} 部 を 採 取

し た

^. 固 定 後, 脳 底 部^の

血

管 を 遊離

し

,

上 丘

^の高

さ で

大 脳

か ら

脳 幹 以

^下

^の組 織 を 切 離

^{し た}

^. 大 脳

は

, 側 頭 葉 先 端 部

か ら

脳 梁 膨 大 部 後 端 ま

で は 0

^.

5

c m 間 隔

で

, 側 頭 葉先 端 部

よ

り 前 方の前 頭 葉

^と

脳 梁膨 大 部 後 端

^よ

り 後方^の後 頭葉

は 1

c m 間 隔

で

前 額 断

し た

^. 大 脳 脚

^{以 下}

^の組 織

^{は 0}

^.

⁵

^{c m} 間隔

^で

水 平 断

し た

^. 大 脳

^は

左 右

ど

ち

ら か

^一 側 を ( 表

1

), 脳 幹

以 下

^の組 織

は

両 側 を 最 大 割 面

6

^×

4

c m 大 ま

^で

^の組 織 断片

に

細 切後, 組 織 断 片 を

^ア

^{ル コ ー ル}系 列

^{に て}

^{脱 水},

キ シ

^{レ ン}

で

置 換

し

, パ

ラ

フ ィ ン

に

包 埋

し た

^{. パ}

ラ

フ ィ ン包埋 組 織

^{か ら}

厚

^さ

約

⁴

〃^m の切 片 を 作 成

^し

, 通 常の へ マ

ト キ シ リ

^{ン ･ エ}

オ ジ

^ン染 色^の他, 神経 線 維 を 観 察 す

る た め ボ デ

ィ

ア

ン染色 を, ま

た

, 髄 鞘 を観 察 す

る た め に ク リ

^{ュ ー バ ー ･ バ}

レ ラ

染 色

を

施 行

し た

^.

大脳 皮 質

^は

細 胞 構 築 学 的

^{に み て}

^いくつ

か

^の領 野

に

区分

さ れ て お

り, 複 数^の分 類 法

^が

あ

る

^, 本 研 究

^{で は}

,

V

o n

E

c o n o m o

9)

が

分

類

^{し た}

皮 質 基 本

⁵

乱 ^す

^{な わ}

^ち,

1

) 無 顆粒 塑 皮 質,

2

) 前 頭 型 皮 質,

3

) 東 頂 型 皮 質,

4

) 極 型 皮 質,

5

) 顆 粒 型 皮 質

^に

,

辺 緑 葉

^に

属 す

る と

^い

わ れ る

^一部^の皮 質 ( 帯 状 回

と

内 喚 領) を加 え

て 6

領 野

に

区分 す

^{る と}

,

そ

^の領 野 間^の差 異 を 表 す^の

^に

有 用

^で

あ^っ

た

^の

で

, こ

れ に

従^っ

て

述^べ

る

こ

と に

す

る

^. な

お

, 有 名な

B

r o

d

^{m a n nl O )の}細 胞 構 築 学 的 地 図

^に

相 当 す

^る

領 野 番 号 も 共

に カ

ツ コ内

に

表 示

し た

^. ま

た

海 馬

は

, 錐 体細 胞 層^の細 胞 配 列^の遠^い

と

神経細 胞 突 起^の形 態^の遠^い

^{か ら}

, 海 馬 台

か ら

歯 状 回

に か

け

て C A l

,

C A 2

,

C A 3

,

C A 4 と

呼

ば れ る

区 域

に

分 類

さ れ て お

り, そ

の区分

^に

^つい

^{て は L}

^{o r e nte}

^d

^e

^N

^o‖)の記 載

に

従っ

た

^.

Ⅱ

^.

C h 貯r の

免 疫 組 織 化 学

あ

ら か じ め ポ リ

^･ エ ル ^･

リ ジ

^ン(po

l

_y^‑

し1

_ys

i

n e) を 塗 布

し た

大

ス

ラ イ ド グ ラ

^ス(

⁷

^.

6

^×

5

.

2

c m 大, マツ

ナ ミ

, 束 京)

^{上 に}

, 薄 切

し た

^パ

ラ

フ ィ ン包 埋 標 本 を 張 り 付 け, ヒ ス

ト ク リ ア

^{･ エ}

タ

^ノ

ー ル系 列

で

脱^パ

ラ

フ ィ ン

し た

^.

0

.

3 %

過 酸 化 水 素 水

^{と 9 8 %}

^メ

^タ

^ノ

ー ル

に よ

^っ

て

組 織 中^の内 因 性ペ ル

オ キ シ ダ

^ー

ゼ

を 阻止

し た

後l

抗 原 を 露 出 す

^{る た め}

,

プ レ

^パ

ラ

^ー

ト

標 本 を

^{9 5}

℃

に

加 熱

し た タ

ー

ゲ

ッ

ト ア

^ンマ ス

キ

ン

グ

フ ル

イ ド

(

T

a rget

U

n m a s

k i

ng

Fl

^u

i d

)

(

^敗

^{e ate c}

^{h di}

^ag^{n o s}t

i

c s,

A m

ste r

d

a m ,

N

et

h

e r

l

a n

d

s)

^{で 1 0}

分 間処

理 し た

^.

リ

ン醸 緩 衝 食 塩 水 (p

h

o sp

h

ate

b

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ff

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