関 す 研究 発現 胃 大 腸癌 け ト胎盤型

胃 ^． 大腸 癌^{に お}けるヒ ト胎盤 型ア^ル カ リフ ォ ス フ ァ タ ^ー ゼ の

発 現 に 関 す ^る 研 究

一 特異 的 単ク

^ロ

^ー ン抗 体^の開 発と免疫 組織学 的検討 ^一

食沢大学が ん 研究所 内 科学 講 座く主任

二

澤 武 紀 雄教 掛

渡 辺 弘 之

く平成

1

年

³

月

1 3

日受付1

胃 ^．大 腸 癌

に

お け る

^ヒ

ト胎 盤塾 ア

ル

カ リ

フ ォ ス フ

ァタ ^ー ゼく

p

la c e n

t

al alkalin e

p

ho s

p

ha

t

a s e，

P L A PI の発 現

^{に つ い}

て明ら か

に

す る目 的

で

， ハイ ブ リ ド^{ー マ}技 法を 用^いて， P L A P

に

対す る単

^ク

^{ロ ー}

ン

抗 体を開 発し た^． P L A P

の

み

^に

反応す る 4 種 類の特 異型抗 体 tA

l

O く抑， A l Oく5 01， A l O く6軋 A 1 1 く王朝1 と肝^． 小 腸^． 胎 盤

^の

3

つ の

ア

^ル

カ リ

フ ォ ス フ

ァタ ^ー ゼ ア イ

^ソ

ザ イ

ム に

同 等

に

反応す る 2 種 類 くG 6 く2 0ナ，G 8く5 711 の共 通 型 抗体が得ら れ た^． 特 異 塾

^の

ア イ

^ソ

タ イ プ は，l

_g

Gl， X

t y p

e であり． 共通型

の

そ れ は，I

_g

M _， X

t y p

e

で

あっ た．

こ

れ ら

の

単ク^{ロ ー}

ン

抗 体

^の

^エ ピ ト^ー プ は

^い

ずれ も

^ペ

ブ タ イ ド で あ る と考え ら れ た が． P L A P の活 性 中心

に

対し て影 響を与え な かった^． 特 異型単ク^{ロ ー}

ン

抗 体 A 1 0 uOl を 用

^い

て， 胃癌1 0 7例， 大腸 癌3 5例の手 術 材 料を主な る対 象

に

_， A B C 法

に

よ り， P L A P

の

免疫 組 織 化学 的 検 討 を行_{な フ た}^．P L A P の陽性 率は． 大腸 癌で1 1％ く4ノ3軋 胃 癌で は2 3％ く^{2 5}ル 叩

^で

あり， 胃 癌

^の

病理組 織 型別で は， 乳頭 腺癌4 6％ く6ハ3I， 高 分化 型 管 状 腺 病3 9％ く7ハ81， 申 分 化型管状 腹痛1 5％ く4ノ2 7I， 低 分 化 型管 状 腺病

¹

⁵％ く5ノ331， 膠様 腺 病3 8％ く3佃， 印環 細 胞 癌0 ％ く⁰何 と高^{分 化型で}高

^い

陽 性 率を認め た^．

一方， 胃 腺腫， 腸上皮 化 生 部， 癌 近 傍 非 癌 部

^に

は， 明ら か な染色は認め ら れ な

^か

っ た． 以 上

の

成 硬か ら． P L A P は胃 癌の高 分 化型

^に

出現し や す く， 消 化 管

^の

癌

^で

は， 癌 特 異性

の

高

^い

も

の

と考え ら れ る^．

K

e

y

^{w o r}

d

s

pl

a c e n

t

a

l

a

lk

a

li

n e

ph

o s

ph

a

t

a s e

，

m O n O C

l

o n a

l

a n

tib

o

d_y

，

i

m m u n o

h i

s

t

o c

h

e m

i

s

t

r

y^，g

^{a S}

t

r

i

c c a n c e r

，

C O

l

o

r

e c

t

a

l

c a n c e

r

ヒ

ト胎盤型 ア

ル カ

リ

フ ォ ス フ

ァタ ^ー ゼく

p

la c e n

t

al a

l kalin e

p

ho s

p

ha

t

a s e，P L A Pンが 腫瘍^{マ ー} カ^ー と し

て

注目さ れ る よ う

^に

な ^っ た

の

は， 1 9 6 8 年

に

F ishm a n

ら^1，

に

よ り， 肺 癌 患 者の血 清 中

^に

P L A P を検 出し， 剖 検時の肺 癌 組 織で も高 濃 度

^に

P L A P

の

存 在す る

こ

と が見出さ れ て

か

ら で あ る^． 以後， 本 酵 素は代 表 的な癌 性ア イ

^ソ

ザ イ

ム の

^一 つと し て内外

^で

多く

の

研 究が な さ れ，O n C Ode v elo

p

m e n

t

al

g

e n e e x

p

r e s sio n

の

産 物と し て考え ら れ る よ う

に

な^った^． そ し て， 卵 巣 癌や精 巣癌 な ど

に

強く 発 現 す る

^こ

と よ り， 臨 床 的

に

は 主

に

婦人科 や泌尿器 科 領 域で 腫瘍マ ^ー カ ^ー と し て

の

有用性が評 価

さ れ て

^い

る^．

消 化 器 領 域

の

癌 患 者 血 清^で

^の

電 気 泳動法

^に

よ る P L A P

の

発現 は数 ％

で

， そ

の

臨 床的 意 義は乏し

い

と さ れ て き た^{2，． 一} 方， 胃 粘膜

の

腸上皮 化生は， 胃癌

^の

前癌 状 態

で

は ない

か

と

い

う

こ

と は^，

^か

な り 以前よ り指 摘さ れ て き た が， 今な

お

議 論

^の

多

^い

と

^{こ ろ で}

あ る^{． 山}般

に

腸上皮 化生 を起

こ

し た胃 粘 膜

^に

は， ア

ル カ

リ

フ

_ォ

ス フ

ァタ^ー ゼくal kalin e

p

ho s

p

ha

t

a s e，A L PH 唐性

^の

高く な る

^こ

と が知ら れ

て い

る が， そ

の

活 性は 小腸 型

^ア

ル

カ

リ

フ ォ ス フ

ァタ ^ー ゼ くin

t

e s

t

in al al kalin e

p

ho sh

_p

a

t

a⁻ S e，I A Pナ

^に

由来し， 腸上皮 化 生

の

癌 化

に

伴

^い

O n C O⁻

A b b

r e v

i

a

ti

o n s ニ

A B C，

a V

idi

n

⁻b i

o

ti

n

⁻p

^e

^r

^O

^Xid

a s e

i A L P ，

a

l k

a

li

n e

ph

o s

ph

a

t

a s e

ニB S A

，b

o v

i

n e

S e r u m a

lb

u

mi

n

ニ ^cD N A ，

C O m

pl

e m e n

t

a r

y d

e o x

y

^r

ib

o n u c

l

e

i

c a c

id_三 C E A，

C a r C

i

n o e m

b

r

y

^o

ⁿi

c

a n

ti_g

e n

ニ D M E M ， D

u

lb

e c c o

^，

s m o

difi

e

d E

a

gl

e m e

d i

u m

三 E I A ，

e n Z

y

^{m e}

i

m m u n o a s s a

y 三 E L IS A ，

e n Z

y

^{m e}

⁻1i

n

k

e

d i

^m m u n o s o r

b

e n

t

a s s a

y 三H A T ，h_{y p}

o x a n

th i

n e

⁻

a m

i

n o

p t

^e

^ri

n

⁻th _ym id i

n e

ニ

50 8

de v elo

p

^m e n

t

al

_g

e n e e x

p

r e s sio n

に

よ り A L P

^の

形 質 転 換が起

^こ

り，P L A P な ど

^の

癌 性ア イ

^ソ

ザ イ

^{ム の}

発 現 し て く る

^こ

と が想 定さ れ る⁻ し か し，

こ

の よ う な問題

に

対し て， P L A P

^に

注 目し て な さ れ た研 究は電 気 泳 動 法で検 討さ れ た M ik i ら^別の も の が あ る の み

^で

^I 免 疫 組 織 化 学 的あ る^い は定 量的

^に

な さ れ た ア プ^{ロ ー} チ は内

外を通じ て み ら れ な

^い

^．

^こ

れ は， ポ リ ク^{ロ ー} ナ

ル

抗体

で

は，工A P と交 差 免 疫反応を有す る抗P L A P 抗 体し か得ら れず， P L A P の み

^に

反 応す る特 異な抗 体を得る

こ

と が不可 能

^で

あった

^こ

と

に

よ る と思わ れ る^■ そ

^{こ で}

， 本 研 究で は， P L A P

^{の み に}

反 応す る特 異な 単ク^{ロ ー}

^ン

抗 体を確 立し，

こ の

抗 体を 用

^い

て− 胃， 結 腸^． 直腸 癌

^に

^お

^い

^て免 疫組 織 化 学 的検 討^を行な

い

− 消 化 管 癌

^{に お}

け る P L A P の発 現

^{に つ}

^いて明ら

^{か に}

し よ う と し た^．

材 料お よ び方 法 l ． P IJA P

^の

精 製

1 ^． P L A P の抽 出

分 娩 時

^に

回収し た，

ヒ

ト胎 盤 組 織を直ち

に

生理食 塩 水を 用^い

^て

十 分

^に

洗 浄し， 血 液 成 分を除 去し た一 洗 浄 後，

こ

の胎 盤 組 織

^に

同 容 横の生理食 塩 水を加え，

1 5，0 0 0^r

p

^m ， 5 分 間の処理

^に

よ り作 製し た ホ

^モ

ジ ネ ^ー ト

に

， M o

t

o n 法⁴切変 法

^に

従

^い

， ブ タ

ノ

^ー

ル

く和 光 純 薬 工業^， 大 阪1 を2 5％ くV 仰

^に

追 加し た^．

^こ

れ

^に

超 音 波 破 砕 処理 を行なっ た後， 4⁰C で1 2時 間

^の

摸 拝を行なっ

た^．

^{つ い}

で 6，0 0 0

g

^， 4⁰C ^，3 0分 間の冷 却遠心機

^に

て， ブ タ

^ノ

^ー

^{ル に}

よ り抽 出さ れ た細 胞 膜 成 分を含む 上清を 回 収し た^．

2 ． 加 熱処理 と ア

^セ

ト

^ン

処理

耐 熱 性で あ る P L A P の性 質

^に

基づ

^い

て，5 6^OC，3 0分 間の加熱 処理 を行な

^い

^， 不耐 熱 性 物 質を失漬さ せ た^． そ の後， ろ過

^に

て不 溶 成 分を除き， 十 分 脱塩し た^{． −} 1 5⁰C

の

条 件下で， ア

^セ

ト

ン

を4 0％ くVノVl

^に

な る ま で

ゅっ く り と攫 拝し な が ら加え て^， ア

セ

ト

^ン

分 画を行 な^った^． 続

^い

て． 3^，0 00

g

， 4^．C ，2 0分 間の冷 却 遠心

^に

て得ら れ た沈 漆を 回収し た^■

^こ

れ を^， 2^m M 塩 化^マ グ ネ

シ

ウ

^ム

お よ び 1

月

M 硫 酸亜鉛を含む0^．0 1 M ト リ

ス

塩 酸緩 衝 液 く

p

王i 7 ^．01 くト リ

^ス

緩 衝 掛

^に

溶 解さ せ， 次

の

イ オ

^ン

交換用緩 衝 液

^に

^て， 十 分 脱塩し た^■

3 ^． イ オ

^ン

交換

^ク

ロ マ ト グ ラ

フ ィ

^ー

辺

こ

の試 料を D E A E⁻Se

p

ha r o s e Fa s

t

F lo w Colu m n

くP ha r m a cia_，U

p p

^{u s a}la，S w ede nl を 用

^い

て0^．0

1

M トリ

ス

緩 衝 液 く

p

H 7^．01 中で． O M か ら0 ⁻3 M ま

で の

塩化ナ ト リ ウ

ム の

リ^ニア グ ラ ジ^エ

^ン

ト

に

よ り， イ オ

^ン

交換ク

ロ マ ト グ ラ

フ ィ

^ー を行な

^い

， 溶 出さ れ た有 情 性 分画を 回収し た，

こ の

分 画を十 分脱 塩 後， さ ら

に

． 高 速液体 ク^{ロ マ} トグラ

フ ィ

^ー 装 置 くH igh Pe rfo r m a n c e L i

q

uid C hr o m a

t

o

g

r a

p

h

_y

．H P L CHP ha r m a cial の

^{シ ス}

テ

ム の

下で，

M o n o⁻Q H R 515 Colu m nくP ha r m a cial を 用

^い

て， D E A E^．Se

p

ha r o s e Fa s

t

Flo w

の

場 合と同じ条件 で^， イ オ

^ン

交 換ク^{ロ マ} ト グ ラ

フ ィ

^ー を 2 回線り 返 し

て

行な

^い

， P L A P を分 離 精 製し た．

王工． 小腸型， 非特 異型 ア

ル

カ リ

フ ォ ス フ

ァタ ^ーゼ

^の

精 製

心 不 全

^で

死亡 し た剖 検 例よ り得ら れ た成人 正常小腸 組 織と． 肺 炎で死亡し た剖 検 例よ り得ら れ た 正常 肝臓 組 織を材 料

^に

用

^い

て， 小腸 型 くI A Pl お よ び非 特 異型 で あ る肝 型ア

^ル

カ リ

^フ ォ ス フ ァ

タ ^ー ゼ くu n s

p

^{e c}ific alkalin e

p

ho s

p

ha

t

a s e，U A Pl の精 製を行な^った^一 方法 は， 両 者と も加 熱処理 を除

^{い て}

， 他は同 様な

ス

テップ

に

よ り精 製を行なっ た．

H L P L A P 単ク^{ロ ー}

^ン

抗 体

^の

作 製 1 ^{． マ} ウ ス^へ

の

免 疫

生後6遇

^の

雌 B A L BIc マ ウ

ス に

精 製し た P L A P 2 0叫

^g

^{づつ 2} 週 間お き

に

3 回腹 腔 内 免 疫し， そ

の 4

週 間 後

^に

， ブ

^ス

タ^ー 注 射と し て，2 0伸

^g

^を追 加 免疫し た． そ れ か ら 4 日目

^に

^マ ウ

^ス

を屠 殺し， 無 菌 的

^に

肺細 胞を摘 出し， 単 細胞 懸濁 液を作 製し た^■

2 ^． 細 胞 融 合 法^{5 1}

S P ⁻210^．A

g

1 4 ^マ ウ

^ス

骨 髄 腫 細胞と^マ ウ

^ス

脾 細 胞は，

別

^{々 に}

ダ

^ル

ベ ツ コ 変 法イ ^ー グ

^ル

培 地 くDulbe c c o^，s m od ified Ea

g

le m ed iu m ， D M E Ml くG ibc o Lab⁻，

U^．S^．A1^． と 10％ウ

シ

胎 児 血 清 くG i b^{c o} Lab1^．

^に

て洗 浄 し， 1

^こ

5

の

比率

^で

混合し た^．

¹

^．00 0r

p 町

5 分間遠心 後， 上浦を除 去し， 沈 漆を再 懸 濁 液と し た^■ 次い

で

_， 0 ^．0 5 M リ

ン

酸 緩 衝 液 く

^p

^{ho s}

^p

^ha

^t

^{e buffe r ed s alin e，} P B SH

p

H 7．21 を溶 媒と し た 5 0％ポ リ^エ チレ

ン

グリ

コ ^ー

ル

く

p

ol

_y

e

t

h

_y

le n e

g

l

y

c ol， P E GJ 4，0 0 0くM ^{e r c}k，

W e s

t

Ge r m a n

y

H 3 7⁰C 僻 削 を 1^ml 加え． 2 分間ゆ^っ く り と渡 拝す る

^こ

と

に

よ り細 胞 融 合を行な^っ た^． そ

の

後， 前 述と同 様な遠 心

^に

て 上清を除 去 後^{， 2 5ml}

^の

a n

tib

o

d_{y i} P A G E ， p

^O

l_y

^{a c r}

yl

a m

id

e

g

^e

l

e

l

e c

t

r o

ph

o r e s

i

s

言 P B S， ph

o s

ph

a

t

e

⁻b

u

ff

e r e

d

s a

li

n e

i P E G ， p

^O

l_y

e

th_yl

e n e

gl_y

c o

l_ニP L A P，

pl

a c e n

t

a

l

a

lk

a

li

n e

ph

o s

ph

a

t

a s e

三S D S，

S O

di

u m

d

o

d

e s

yl

s u

lf

a

t

e

i U A P ，

u n S

p

^{e C}

ifi

c a

lk

a

li

^{n e}

ph

o s

ph

a

t

a s e

I A P，i

n

t

e s

ti

n a

l

a

lk

a

li

_{n e}

_ph

o s

ph

a

t

a s e

i M A b，

m O n O C

l

o n a

l

D M E M を加え て捜 拝^し， 同 様な操 作を繰り返し て可 及的

^に

P E G 4，0 0 0 を除

^い

た^． そ れ か ら． h

y p

o x a n

t

h^． in e⁻a min o

p t

e rin⁻

t

h

_y

mi din eくH A Tl 培 養液 く和 光 純 薬 工鼎 を 9 0^ml を加え て静か

に

擾 拝 く1

x

l O⁶牌 細 胞 ノ

mり 後^{， 3 0}分 間 静 置し た^{． 一}方， 生 後4週の B A L Bノ

c マ ウ

ス

よ り胸 腺を無 菌 的

^に

摘 出し， 胸 腺 細 胞1．5

X

lO⁸個を 回収し， 細 胞 浮 遊 液

に

追加し た^．

こ

れ を， 9 6 ウ^ェ

^ル

平 底 組 織 培 養^プ

^レ

^{ー ト}くBe c

t

o n D ick in s o n，

Ne w J^{e r s e}

y

，U．S．AI． の ウ^ェ

^ル

ご と

に 1

5 0

J

^Ll づ

^つ

分 注 し， 3 7⁰C， 5 ％C O2イ

^ン

キ^{ュ ベ ー} タ ^ー

^に

て培 養を行 なった^． 2 日後， 選 択 的 H A T 培 養液を 5 0

ノ

バ づ

つ

各 ウ^ェ

^{ル に}

追 加し， 以後， 2 ^ノー 3 日 ご と

^に

半 容量交 換を 行なった．

3 ^{． ハ}イ ブ リ ド^{ー マ}

の

選 択と限界 希 釈 法

9 6 ウ^ェ

^ル

ビ^{ニ ー}

ル

ア

ツ セ

イ プ ^{レ ー} トくCo s

t

a r，

Ca mb^rid

_g

e，U．S．A ．ン

^に

， あ ら か じ め精 製し た P L A P，

王A P，ロA P を抗 原と し て固 相 化し， 各ウ^ェ

ル

か ら培 養 上清

^に

含ま れ る抗 体を反 応さ せ て， 後 述す る酵 素 免 疫 測定法 く^{e n z}

y

^m eim m u n o a s s a

y

，E I A い

^こ

て吸 光 度を測 定し た^． 次

^い

で， 限 界 希 釈 法

^に

よ る ク^{ロ ー ニ}

^ン

グ を繰 り返し て^ハイ ブ リ ド^{ー マ} を選択し た^．

4 ^． 選択し た^ハ イ ブ リ ド^ー マの培 養

そ の後， 選 択^{し た クロ ー}

^ン

を順 次2 4 ウェ

ル

組 織 培 養 プ

^レ

^ー ト くBe c

t

o n D ick in s o nl な ら び

に

2 5ml組 織 培 養

^フ

ラ

^ス

^コくBe c

t

o n D ick in s o nJ

^に

移し て増 殖さ せ ，

さ ら

^に

， あら か じ め プ リ

^ス

タ

．

^ン

^{くA l drich C he mic al，}

U^．S^．Aン^． を腹 腔 内

^に

投 与し て

^い

た B A L BI c マ ウ

ス

腹 腔内

に

_， 選択し た ク^{ロ ー}

ン

を注入 し， 増 殖さ せ て， 1 0

日目

に

腹水を 回収し た^． 次

い

で，

こ

の腹 水を M ^{o n o−}Q

H R 515 Colu m n を 用

^い

て前 述と同 様な緩 衝 液

^の

下

で

， O M か ら0^．3 M ま

で の

塩 化ナ ト リ ウ

ム の

リ^ニ ア グ ラ ジ^エ

ン

ト

に

よ る イ オ

^ン

交 換ク^{ロ マ} ト グ ラ

フ ィ

^ー を行 な

^い

， 抗体

^の

活 性 分 画を 回収し た^． 必 要な ク^{ロ ー}

^ン

は_， 液 体 窒 素 中

^に

保 存し た^．

N ^． E I A

l ^． 抗原 プ

^レ

^ー ト

の

作 製

精 製し た抗 原 くP L A P で は 5

J

^L

g

l ^ml， U A P と，

I A P で は

1

0

J

L

g

J^lmり を9 6 ウェ

ル ビ

^{ニ ー}

ル

ア ツ

セ

イ プ

レ

^ー トくCo s

t

a rJ

^に

ウ^ェ

^ル

ご と

に

5 0

J

^Ll づ

つ

分注し た^． 4⁰C，1 2時 間固 定し， 0．0 5％ Tw e e n 2 0く半 井化 学，京 執 を含む0．05 M P B Sく

p

H 7．

4

ン

^に

て 3 回洗 浄し た^．次

い

で， 1 ％ウ

シ

血清ア

^ル

ブ ミ

ン

く^{bo vin e} s e r u m

a

l bu min，B S AHS i

g

m a，S

t

．Lo uis，U．S．A1． と0^．0 5％ 窒 化ナ ト リ ウ

ム

く和 光 純 薬工勤 を含有し た0^．0 5 M P B S く

p

H 7．41 を ウ^ェ

^ル

ご と

に 1

5 0

月

1 づ

^つ

分 注し，

4

⁰C，

1

時間 固定 後， 使用時ま で−^{2 00C}

^に

^て保 存し た^．

2 ． EI A

の

手 順

E I A 施 行 時

^に

は， プレ ^ー ト を室温

に

戻し，

1

回洗 浄 後， 培 養^上清 く^一次抗 体1 を ウ^ェ

^ル

ご と

^に

5 0

ノ

バ づ^つ分 注し． 3 7⁰C， 1 時 間反応さ せ た^． 3 回洗 浄後，

二

次 抗 体

^{の ペ ル}

オ キ

^シ

ダ^ー ゼ結 合 抗^マ ウ

ス

免 疫グ^ロ ブ リ

ン

くDako，Co

p

^{e n}ha

g

^{e n}，De n m a rkl を0^．5％B S A を含 有 し た 0^．0 5 M P B S く

p

H 7 ^．4い

^こ

よ り1 ，0 0 0倍 希 釈 く²

メ g

ノmりし た後， ウェ

ル

ご と

に

5 0

ノ

バ づ

^つ

分 注し， 3 7

0C， 1 時 間反応さ せ た^． さ ら

に

， 3 回洗 浄後，

ペ

ル オ キ

^シ

ダ^ー ゼ

の

反応 基 質

^で

ある オ

^ル

ソ

フ

ユニ レ

ン

ジ ア

ミ ン

く和 光 純 薬工業1 を0^．1 M ク ^エ

^ン

酸−^{0．2 M P B S} く

p

H 4^．8J

^に

て 1m

g

l^ml と し， さ ら

に

，0．0 1 5％ 過 酸 化 水 素 水と な る よ う

^に

調整し た 反応 基質 液を，2 0毎1 づ

つ

ウ^ェ

^ル

ご と

に

分 注し， 室 温

^に

て 30分間 反応 後， 2 M 水 酸 化ナ ト リ ウ

ム に

よ り 反応を停止 さ せ た． 次

^い

で，

E I A R E A D E R くM odel F L 3 0 7， 東洋 紡， 大 阪I を 用

^い て

． 吸 光 度

⁴

0 5n m

に て

測 定し た^．

V ． イ

^{ム ノ}

ブロ ッ ト法 くW e s

t

e r n b lot 法^即ン

ス

ラ ブ ゲ

ル

電 気 泳 動装 置 K S⁻8 0 0 0 S E 型 く^マ リ

^{ソ ル}

産 業， 東 京I を 用^い

て

_， 精 製し た P L A P を ゲ

^ル

濃 度 1 0％の S Od iu m dode s

y

ls ulfa

t

eくS D SJ⁻ポ リ ア ク リ

ル

ア

ミ

ド

^ス

ラ ブ ゲ

^{ル に}

て 1 0 0 V の定 電 圧下で電気 泳 動^を行 な^い ， ブ^ロ

モ フ

ェ

ノ

^ー

ル

ブ

ル

^ーが ゲ

^ル

下 端

に

ま で泳 動 さ れ た時 点で電 源を 止 め て， ゲ

^ル

を取り出し た． 続

^い

て， ゲ

ル メ ン

ブ ラ

ン

転写 装 置 装 置 K S^．8 4

4

0 G M T 型 く^マリ

ソ ル

1 を 用

い て

， 3 5 V の定 電圧下で 2 0時 間通電 し， ポ リ ア ク リ

^ル

ア

ミ

ド

ス

ラ ブ ゲ

ル

か ら^ニ ト^ロ

セ ル

ロ ^ー

ス

膜 くSchleiche r 8z Schull， Da s s el， W e s

t

Ge r m a n

y

い

^こ

転 写し た^． 酵 素 免疫 染色用

に

は，

こ

の 蛋 白を転 写さ れ た^こ ト^ロ

^{セ ル}

^{ロ ー}

^ス

膜

^に

^一 次抗 体と し て 抗P L A P 抗 体 特 異型 A l Oく1 01 く^マウ

ス

腹 水 精 製 抗 体

1

0，0 0 0倍 希 釈ナを 反応さ

せ

， 続

^{い て 二}

次 抗体と し

^て

^ペ

ル

オ キ

シ

ダ ^ー ゼ結 合 ウ サ ギ抗マ ウ

ス

I

g

G 抗 体 のakol を 反応さ

せ

た後， 0．0 2％ジ ア

ミ ノ

ベ

ン

チ ヂ

ン

くS i

g

m aI

^に

て 5 分 間反応を行な っ て発 色さ

せ

た． ま た， ア

ミ

ド ブ ラック

1

0 Bく和 光純 薬

工

業1

^に

よ り 蛋白を 染 色し た^．

VI． 免 疫 組 織 化 学 的検 討

1

^． 対 象と方 法

対 象

^に

は， 悪性 疾 患と し

て

， 胃 癌

¹

0 7例， 結 腸 癌2 2 例， 直 腸 癌

¹

3例

^の

計1

⁴

2例

の

手 術 材 料を 用

い

た^． ま た，

良 性 疾 患と し

て

， 胃腺腫 1 5例， 化 生 部^{2 0}例

^の

生検^{な ら} び

に ス

ト リッ プ^バイ オ プ

^シ

^ー

の

材 料を 用^い た^， さ ら

に

， 陽 性 対照 用

に

分 娩 時

^に

得た胎盤を 用

^い

た^，

こ

れ ら を

1

0％

^{ホ ル}

^マリ

^ン

緩 衝 液 く

p

H 6．01 で固 定後，

ヒ ス

ト プ

レ ツ

プ5 6 8く和光 純 薬工業I を 用

^い

て， 6 2⁰C

^{の パ}

ラ

フ イ