免疫炎症制御研究分野

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免疫炎症制御研究分野

＜研究スタッフ＞

教授須田貴司

助教今村龍助教木下健博士研究員張培培

大学院生 (博士課程) 串山裕子研究生趙天祥技術補佐員齋藤翔子

【研究概要】

細胞死と炎症は共にがん微小環境に大きな影響を及ぼすことから，我々は細胞死と炎症のシグナル伝達の接点で働く蛋白分子群に着目した研究を行っている。

近年は，特に自然免疫応答や細胞死の誘導・制御に働く NLR ファミリーに属する細胞内蛋白質に着目した研究を行っている。具体的には，1）PYNOD (NLRP10)の獲得免疫応答における役割，2）がん細胞におけるNLRP3の役割，3）パイロトーシス（NLR 蛋白などが関与するカスパーゼ 1 依存性プログラム細胞死）の分子機構の研究などを行っている。詳細は以下の通りである。

＜2013年の研究成果，進捗状況及び今後の計画＞

1) 獲得免疫系におけるPYNODの機能解析：

PYNOD は我々が発見した NLR ファミリーに属する蛋白質である。我々は細胞

レベルでの解析やPYNODトランスジェニックマウスの解析から，PYNODはカスパーゼ1 の機能を阻害することで，IL-1βなどの産生を抑制する作用を持つことを示してきた。ところが，PYNOD欠損マウスを樹立したところ，明確な自然免疫応答の異常は認められず，むしろ獲得免疫応答の一種である遅延型過敏症応答が著明に抑制されていることが判明した。Eisenbarth らは，PYNOD 欠損マウスでは，抗原を取り込んだ末梢組織の樹状細胞が所属リンパ節へ移動するプロセスが障害されていると報告した。しかし，我々の解析ではそのような異常は確認できなかった。そこで，PYNOD欠損マウスのT細胞の抗原応答性や樹状細胞の抗原提供能についてin vitro実験系で検討したが，有意な機能低下は認められなかった。今後は，PYNOD欠損マウスのT細胞や樹状細胞の生体内での動きをさらに詳細に解析していく予定である。また，PYNOD欠損マウスの腫瘍免疫応答についても検討する。

一方，大島教授らが開発した C2mE および Gan マウスの胃病変部で PYNOD

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教授須田貴司

助教今村龍助教木下健

博士研究員張培培

【研究概要】

1)獲得免疫系におけるPYNODの機能解析：

PYNOD は我々が発見した NLR ファミリーに属する蛋白質である。我々は細胞レベルでの解析やPYNODトランスジェニックマウスの解析から，PYNODはカスパーゼ1 の機能を阻害することで，IL-1βなどの産生を抑制する作用を持つことを示してきた。ところが，PYNOD欠損マウスを樹立したところ，明確な自然免疫応答の異常は認められず，むしろ獲得免疫応答の一種である遅延型過敏症応答が著明に抑制されていることが判明した。Eisenbarth らは，PYNOD 欠損マウスでは，抗原を取り込んだ末梢組織の樹状細胞が所属リンパ節へ移動するプロセスが障害されていると報告した。しかし，我々の解析ではそのような異常は確認できなかった。そこで，PYNOD欠損マウスのT細胞の抗原応答性や樹状細胞の抗原提供能についてin vitro実験系で検討したが，有意な機能低下は認められなかった。今後は，PYNOD欠損マウスのT細胞や樹状細胞の生体内での動きをさらに詳細に解析していく予定である。また，PYNOD欠損マウスの腫瘍免疫応答についても検討する。

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教授須田貴司

助教今村龍助教木下健博士研究員張培培

【研究概要】

1) 獲得免疫系におけるPYNODの機能解析：

PYNOD は我々が発見した NLR ファミリーに属する蛋白質である。我々は細胞

レベルでの解析やPYNODトランスジェニックマウスの解析から，PYNODはカスパーゼ1 の機能を阻害することで，IL-1βなどの産生を抑制する作用を持つことを示してきた。ところが，PYNOD欠損マウスを樹立したところ，明確な自然免疫応答の異常は認められず，むしろ獲得免疫応答の一種である遅延型過敏症応答が著明に抑制されていることが判明した。Eisenbarth らは，PYNOD 欠損マウスでは，抗原を取り込んだ末梢組織の樹状細胞が所属リンパ節へ移動するプロセスが障害されていると報告した。しかし，我々の解析ではそのような異常は確認できなかった。そこで，PYNOD欠損マウスのT細胞の抗原応答性や樹状細胞の抗原提供能についてin vitro実験系で検討したが，有意な機能低下は認められなかった。今後は，PYNOD欠損マウスのT細胞や樹状細胞の生体内での動きをさらに詳細に解析していく予定である。また，PYNOD欠損マウスの腫瘍免疫応答についても検討する。

の発現が増強していたことから，胃病変形成における PYNOD の関与を検討する目的で，PYNOD欠損C2mEおよびGanマウスを作成した。PYNOD欠損C2mE マウスの胃病変に関して明瞭な差は認められなかった。さらにPYNOD欠損Gan マウスについて，現在経過観察中である。

2)がん細胞におけるNLRP3の役割の解析：

NLRP3はインフラマソーム（カスパーゼ1活性化複合体）を形成するNLR蛋白の一つとして注目されているが，我々はNLRP3がNF-κB活性化にも寄与することを示してきた。また，各種がん細胞株においてNLRP3をノックダウンすると IL-1β，TGF-β，MT1-MMPのmRNA発現が抑制されることを見出した。そこで，

GEO (Gene Expression Omnibus)で種々のヒトがん組織におけるNLRP3 mRNAの発現を検索したところ，グリオーマにおいて亢進していることが判明した。また，グリオーマ細胞株U87MGにおいてNLRP3発現をノックダウンするとTGF-β，

MT1-MMPの発現低下，MT1-MMPの基質（MMP2）切断活性の減弱，in vitroマトリゲル浸潤アッセイにおける浸潤能低下などが認められた。今後は，NLRP3 ノックダウン細胞のがん特性の in vivo モデルでの解析，NLRP3 による TGF-β,

MT1-MMP 発現誘導の分子機構の解析，グリオーマ治療抵抗性における NLRP3

の関与の可能性の検証などを行う予定である。

また，今後の有望な遺伝子ターゲティング，ゲノム編集技術になると考えられる人工ヌクレアーゼ TALEN の作製技術を導入した。これまでにヒト NLRP3 およびcaspse-1遺伝子を標的とするTALENを設計し，caspase-1ゲノム遺伝子切断活性を有するTALENを構築できた。引き続き，caspase-1ノックアウト細胞の作製およびNLRP3に対するTALEN構築•ノックアウト細胞作製を試みる。

3)パイロトーシスの分子機構の解析：

パイロトーシスはカスパーゼ 1 依存性のネクローシス様プログラム細胞死で，

細菌などに感染したマクロファージで見られる細胞死として発見された。我々は，カスパーゼ 1 を発現する多くのがん細胞株でもパイロトーシスが誘導されうることを見出した。また，パイロトーシスはカスパーゼ１に対するshRNAで抑制されるが，カスパーゼ１阻害剤では抑制されないことを見出し，カスパーゼ 1 の酵素活性に依存しないパイロトーシス誘導機構が存在することを見出した。そこで，パイロトーシスの分子機構をさらに明らかにするために，現在

shRNA ライブラリーを用いたパイロトーシス関連遺伝子の同定を目指した研究

を進めている。

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の発現が増強していたことから，胃病変形成における PYNOD の関与を検討する目的で，PYNOD欠損C2mEおよびGanマウスを作成した。PYNOD欠損C2mE マウスの胃病変に関して明瞭な差は認められなかった。さらにPYNOD欠損Gan マウスについて，現在経過観察中である。

2)がん細胞におけるNLRP3の役割の解析：

NLRP3はインフラマソーム（カスパーゼ1活性化複合体）を形成するNLR蛋白の一つとして注目されているが，我々はNLRP3がNF-κB活性化にも寄与することを示してきた。また，各種がん細胞株においてNLRP3をノックダウンすると IL-1β，TGF-β，MT1-MMPのmRNA発現が抑制されることを見出した。そこで，

GEO (Gene Expression Omnibus)で種々のヒトがん組織におけるNLRP3 mRNAの発現を検索したところ，グリオーマにおいて亢進していることが判明した。また，グリオーマ細胞株U87MGにおいてNLRP3発現をノックダウンするとTGF-β，

MT1-MMPの発現低下，MT1-MMPの基質（MMP2）切断活性の減弱，in vitroマトリゲル浸潤アッセイにおける浸潤能低下などが認められた。今後は，NLRP3 ノックダウン細胞のがん特性の in vivo モデルでの解析，NLRP3 による TGF-β, MT1-MMP 発現誘導の分子機構の解析，グリオーマ治療抵抗性における NLRP3 の関与の可能性の検証などを行う予定である。

また，今後の有望な遺伝子ターゲティング，ゲノム編集技術になると考えられる人工ヌクレアーゼ TALEN の作製技術を導入した。これまでにヒト NLRP3 およびcaspse-1遺伝子を標的とするTALENを設計し，caspase-1ゲノム遺伝子切断活性を有するTALENを構築できた。引き続き，caspase-1ノックアウト細胞の作製およびNLRP3に対するTALEN構築•ノックアウト細胞作製を試みる。

3)パイロトーシスの分子機構の解析：

パイロトーシスはカスパーゼ 1 依存性のネクローシス様プログラム細胞死で，

細菌などに感染したマクロファージで見られる細胞死として発見された。我々は，カスパーゼ 1 を発現する多くのがん細胞株でもパイロトーシスが誘導されうることを見出した。また，パイロトーシスはカスパーゼ１に対するshRNAで抑制されるが，カスパーゼ１阻害剤では抑制されないことを見出し，カスパーゼ 1 の酵素活性に依存しないパイロトーシス誘導機構が存在することを見出した。そこで，パイロトーシスの分子機構をさらに明らかにするために，現在

shRNA ライブラリーを用いたパイロトーシス関連遺伝子の同定を目指した研究

を進めている。

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【研究業績】

＜論文発表＞

原著

（当研究室主体）

1. Wang, Q., Imamura, R., Motani, K., Kushiyama, H., Nagata, S., and Suda, T.

Pyroptotic cells externalize eat-me and release find-me signals and are efficiently engulfed by macrophages. Int. Immunol. 2013, 25:363-372

＜学会発表＞

1. 須田貴司: パイロトーシス細胞の貪食とそのメカニズム第22回日本Cell

Death学会学術集会シンポジウム（京都）2013年7月

2. 須田貴司: パイロプトーシスとその被貪食機構第86回日本生化学会大会シンポジウム,（横浜）2013年9月

＜外部資金＞

1. 須田貴司，科学研究費基盤研究（Ｂ）（代表）：炎症抑制型ＮＬＲ蛋白ＰＹＮＯＤの生理的・病理的役割の解明. 5,330千円

2. 今村龍，科学研究費基盤研究（Ｃ）（代表）：抗炎症NLRファミリー分子

PYNODの発現制御機構の解析. 2,210千円

3. 木下健，科学研究費基盤研究（Ｃ）（代表）：自然免疫ストレスセンサー NLRPの新機能とその分子機構解明. 1,040千円

＜共同研究＞

学外

1. 広島大学生物圏科学研究科加藤範久教授

NLRP3インフラマソーム活性化におけるビタミンB6の効果の検討

2. 東京薬科大学生命科学部田中正人教授，西躰元助教

腫瘍随伴マクロファージによるがん死細胞貪食とがん免疫抑制機構の解明 3. 琉球大学熱帯生物圏研究センター松﨑吾朗教授，梅村正幸助教

BCGの抗癌活性発現における炎症反応および免疫応答の分子基盤の確立 4. 京都府立医科大学大学院医学研究科鈴木孝禎教授

HDAC阻害剤のIL-1β産生誘導機構の解析

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【研究業績】

＜論文発表＞

原著

＜学会発表＞

＜外部資金＞

＜共同研究＞

学外

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【研究業績】

＜論文発表＞

原著

＜学会発表＞

＜外部資金＞

＜共同研究＞

学外

5. 鳥取大学医学部林眞一教授，吉野三也准教授

PYNOD欠損樹状細胞の抗原輸送能の検討

所内

1. 腫瘍遺伝学研究分野大島正伸教授

胃がん発症モデルマウスにおけるPYNODの役割の検討 2. 腫瘍制御研究分野源利成教授

ヒト消化器がんにおけるインフラマゾーム関連遺伝子発現の解析

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5. 鳥取大学医学部林眞一教授，吉野三也准教授 PYNOD欠損樹状細胞の抗原輸送能の検討

所内

1. 腫瘍遺伝学研究分野大島正伸教授

胃がん発症モデルマウスにおけるPYNODの役割の検討 2. 腫瘍制御研究分野源利成教授

ヒト消化器がんにおけるインフラマゾーム関連遺伝子発現の解析

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