その定量的イメージング計測法に関する研究

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微小流路中の血液細胞動態と

その定量的イメージング計測法に関する研究

廣野泰亮

電気通信大学

2008 年 3 月

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微小流路中の血液細胞動態と

その定量的イメージング計測法に関する研究

廣野泰亮

電気通信大学大学院電気通信学研究科博士 ( 工学 ) の学位申請論文

2008 年 3 月

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微小流路中の血液細胞動態と

その定量的イメージング計測法に関する研究

博士論文審査委員会

主査山田幸生教授（主指導教員）

副査青山尚之教授（指導教員）

委員黒田成昭教授（知能機械工学専攻）

委員武田光夫教授（情報通信工学専攻）

委員中村整教授（量子・物質工学専攻）

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著作権所有者廣野泰亮

2008 年

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Microfluidic Image Cytometry for Quantification of Biological Cell Dynamics

Taisuke Hirono

Abstract

Microfluidic image cytometry was developed in order to quantify the function of blood platelet aggregation and thrombus formation which was important for diagnosing thrombotic diseases and providing physiological information on the development of an anti-platelet pharmaceuticals etc.

This technique can also be applied to assess the quality control of the transfusion blood products by counting residual leukocytes which is one of risk factors for induction of the transfusion side effects.

Conventional cytometric methods were reviewed to clarify the present state and to extract the problems to be solved. Novel mathematical model for quantification of platelet aggregation was proposed to extract the important factors. As a result, the temporal changes in the number and sizes of platelet aggregates were found to be appropriate factors for the quantification. A microchannel mimicked a blood vessel was implemented in a microchip fabricated using MEMS (micro electrical mechanical systems) technology and used for this study. Algorithms of image sequence analysis,

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micro particle image velocimetry technique based on the property of micro flow, and extraction of three dimensional position of each cell flowing through the microchannel, and a biocompatible polymer coating onto the surface of the microchannel in introducing biological cells, were conducted to develop a novel method and a prototype system. An interfacial collision micro reactor which enables reaction of flowing solid platelet cells with an agonist liquid solution in a micro laminar flow was also developed.

Finally, platelet aggregation and thrombus formation in the microchannel could be imaged and quantified using a converted platelet numbers concerned with the platelet aggregate layer. All functions of the system were validated quantitatively by experiments.

The proposed technique will be applicable to the quantitative imaging of platelet aggregation or adhesion to injured blood vessels and might become a powerful diagnostic tool for thrombotic diseases in the future.

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微小流路中の血液細胞動態と

その定量的イメージング計測法に関する研究廣野泰亮

概要

本研究は，血液細胞のうち，血栓形成や止血機能，あるいは動脈硬化・心筋梗塞・脳梗塞などの血栓性疾患に関与する血小板と，輸血時の輸血副作用を誘発する危険因子の一つである白血球を対象とし，マイクロ化学チップ上に構成された微小流路中における細胞動態とその定量的イメージング計測法の開発に関するものである．マイクロ化学チップは，細胞や生体分子などの処理や計測・

分析など，種々の新しい応用が期待されており，近年，応用研究が盛んに行われている．動画像処理・解析，微小流路中の流れ特性を利用したマイクロPIV (micro particle image velocimetry)，細胞の 3 次元位置情報取得などのアルゴリズム開発，微小流路へ細胞を導入する際の課題への対応，

層流中で浮遊固相と液相を反応させる界面衝突マイクロ・リアクタの開発などを通じ，血管を模擬した微小流路中を流れる細胞の動態計測系を作成し，その機能を実験的に評価した．その結果，血小板細胞の重要な機能である血小板凝集能，あるいは血栓形成現象の動的状態を定量的に評価する計測法を実現した．

血小板凝集能測定の従来法として濁度法や光散乱法が知られているが，これらの方法では血小板凝集能の定量計測は困難であり，多血小板血漿 (PRP; platelet rich plasma) 試料の臨床検査への適用も疑問視されつつある．

本研究の目的は，血液細胞である白血球および血小板を対象とし，それらの数とサイズを計測して，細胞の重要な機能である血小板凝集，あるいは血栓形成現象を直接観察し，その動的状態を定量的に評価する計測法を開発することである．成果として，血栓性疾患の状態把握や診断，新薬開発などに革新をもたらすべく有用な情報を提供することが期待される．血管を模擬した微小流路中を流れる血液細胞の動態計測法を実現し，これによって得られる情報を定量的に評価する方法の研究を行った．本論文では，このような臨床応用を目指した微小流路中を流れる細胞の動態とその定量的イメージング計測法の実現について述べる．

本論文は全7章で構成されている．各章の概要は以下のとおりである．

第 1 章は序論であり，本研究の背景と目的について述べる．医学，特に血栓・止血学における分

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野で必要とされる細胞計測とその定量的評価の現状，および技術的課題について述べる．本研究の応用分野を白血球計数と血小板凝集能計測に設定し，本研究の意義と目的を明らかにする．

第2章では，血小板凝集能を定量化するために有用な指標を検討する．従来の血小板凝集能測定法の一つである光散乱法で測定される，血小板凝集塊の「数」と「サイズ」2つの指標によって血小板凝集能を定量化することのできる可能性について検討する．そのため，血小板凝集反応の新しい数理モデルを提案し，光散乱法による血小板凝集計測に化学反応速度論を適用することによって，

計測結果から反応速度定数を求めるという線形逆問題を設定し，これを数値的に解くことで，血小板凝集反応の定量化を試みる．その結果について述べ，血小板凝集塊の数とサイズが血小板凝集能の定量化指標として有用であることを述べる．

第 3章では，静止蛍光画像を用いた白血球の数を計測する方法の開発について述べる．輸血用血液製剤の品質管理に重要とされる，血液製剤中に混入する白血球の計数法の開発について述べる．特に，白血球の蛍光画像を解析し，白血球のみを抽出・計数するためのアルゴリズム，測定原理に由来する測定限界上限を実用に耐えうる程度に拡張するための補正アルゴリズムについて述べる．

第4章では，マイクロPIV法を用いた血液細胞の数とサイズの同時計測法，µFIC法 (microfluidic

image cytometry) の開発について述べる．本計測法は，動く細胞を計測対象にした細胞動態計測

法であり，本論文を通じ，本研究で利用する計測法の基盤となる．動く細胞を計測対象とするため動画像を撮影し，動画像処理および解析を用いた計測法を確立する．本章では計測系の確立が主目的であるため，試料にはポリスチレン粒子浮遊液を用いる．光学的結像特性など計測系の特性について調べ計測に及ぼす影響を考察する．また，微小流路中の流れ特性を利用することによって，2 次元動画像から細胞の3次元位置情報を抽出する方法について述べる．さらに，確立された計測法を検証するために行った実験の結果について述べ，本計測法を定量的に評価する．

第 5 章では，蛍光動画像計測による白血球計数を行う．微小流路に実際の細胞を導入する際の問題点を抽出し，これに対応する．第3 章で開発した蛍光染色法，第4章で確立したµFIC法，さらに蛍光計測系を組み合わせ，蛍光染色した白血球を微小流路中に流し，その蛍光動画像を撮影し，

動画像処理・解析技術を用いて白血球を抽出・計数する．本手法の妥当性評価実験の結果を示し，

3 章で開発した静止画による白血球計数法に比べ，細胞計数の測定範囲が拡張されたことを確認する．

第 6 章では，µFIC法を用いた血小板凝集能の定量的イメージングについて述べる．本研究で開発されたこれまでの技術を総合し，血小板凝集・血栓形成現象の定量的イメージングを行った結果について述べる．微小流路中において，血液試料と血小板凝集惹起薬液を混和するための機構として，界面衝突マイクロ・リアクタを開発し，微小流路中で血小板凝集反応をイメージングする．動画像計測により，数とサイズの経時変化を計測し，血小板凝集能という細胞の機能を定量的に評価することが可能となった．

(9)

第 7 章では，本研究の結論と将来展望について述べる．本研究のまとめと課題，および今後の展望について述べる．

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図目次

頁

Fig. 1.1. 本研究の構成. ··· 6

Fig. 1.2. 遠心処理による血液の分離. ··· 7

Fig. 1.3. 血液の構成. ··· 8

Fig. 1.4. 白血球と血管内皮細胞との相互作用.··· 12

Fig. 1.5. 血液凝固機序.··· 15

Fig. 1.6. 血管の構造. ··· 18

Fig. 1.7. 血管壁と血小板，von Willebrand因子，フィブリノーゲンの相互作用. ··· 22

Fig. 1.8. 濁度法の測定原理. ··· 24

Fig. 1.9. 濁度法の構成. ··· 25

Fig. 1.10. 濁度法による測定結果例.··· 25

Fig. 1.11. グレーティング・カーブ. ··· 25

Fig. 1.12. 光散乱法のシステム構成. ··· 26

Fig. 1.13. 光散乱法によって検出される典型的な信号時系列. ··· 27

Fig. 1.14. 光散乱法による測定結果の一例. ··· 27

Fig. 1.15. インピーダンス法による測定.··· 28

Fig. 1.16. イメージ・フローサイトメータによる全血試料中の血小板凝集塊測定例. ··· 29

Fig. 1.17. ニッケル製マイクロメッシュ・フィルタ．··· 30

Fig. 1.18. Screen Filtration Pressure法の測定結果例. ··· 30

Fig. 1.19. Utah大学の研究グループによる全血用光散乱方式の血小板凝集測定方法. ··· 31

Fig. 2.1. Platelet aggregation patterns measured by TRLS method using the PRP samples from a same subject A. ··· 45

Fig. 2.2. A model of platelet aggregation expressed by the chemical kinetics. ··· 47

Fig. 2.3. The reaction rate constant matrix. ··· 50

Fig. 2.4. Flow chart of numerically solving the inverse problem. ··· 53

Fig. 2.5. Time courses of 0.6 µM ADP-induced platelet aggregation. ··· 55

Fig. 2.6. Time courses of 2 µM ADP-induced platelet aggregation. ··· 56

Fig. 2.7. Variation of the reaction rate constants with the changes in the ADP concentrations. ··· 57

Fig. 2.8. Reaction rates of platelet aggregation induced by the different concentration of ADP. ··· 58

(18)

頁 Fig. 2.9. Difference in the mechanism of platelet aggregation reaction

due to the ADP concentration. ··· 59

Fig. 2.10. The dependence of the mean rate of aggregation on the ADP concentration.··· 60

Fig. 2.11. Results of other PRP samples from another subject B with low degree of platelet aggregation. ··· 62

Fig. 2.12. Reaction rates of platelet aggregation in each path induced by the different reagents. ··· 64

Fig. 2.13. Differences in the reaction mechanisms of platelet aggregation induced by the different reagents. ··· 66

Fig. 2.14. Comparison of the kSN by the proposed method with the AUC values by TRLS method and the classes by aggregometry.··· 68

Fig. 3.1. Classification of the blood products.··· 76

Fig. 3.2. The dependence of the occurrence of the side effect on the number of the residual leukocytes in a blood product.··· 81

Fig. 3.3. Nageotte chamber. ··· 85

Fig. 3.4. The principle of the Coulter counter.··· 86

Fig. 3.5. Typical results of the Coulter counter.··· 86

Fig. 3.6. The principle of the flow cytometry. ··· 88

Fig. 3.7. Typical results of the flow cytometry. ··· 88

Fig. 3.8. The principle of the ICC method.··· 90

Fig. 3.9. A cuvette used in the ICC method.··· 90

Fig. 3.10. Triton X-100 concentration dependence of the cytolysis of platelets. ··· 92

Fig. 3.11. The relationships between the Triton X-100 concentrations and number of cells. ··· 92

Fig. 3.12. Determination of the optimum concentration of PI in ICC method. ··· 93

Fig. 3.13. Centrifugal speed dependence of the leukocyte counts by the ICC method. ··· 94

Fig. 3.14. System configuration of the ICC method.··· 95

Fig. 3.15. Illumination paths of the ICC method. ··· 96

Fig. 3.16. Fluorescence image by the ICC method.··· 96

Fig. 3.17. Calculating the leukocyte signal profile. ··· 97

Fig. 3.18. Standard leukocyte fluorescence image profile obtained by the ICC method. ··· 99

Fig. 3.19. Comparison between calculated profile and measured profile.···100

Fig. 3.20. Typical fluorescence image profile of dusts. ···101

(19)

頁

Fig. 3.21. Settings of the simulation of centrifugation process. ···103

Fig. 3.22. Simulation results of centrifugation process. ···105

Fig. 3.23. The dependence of the upper limit of the measurement on the tapered angle of the cuvette in the ICC method. ···106

Fig. 3.24. The dependence of the upper limit of the measurement on the object size in the ICC method. ···106

Fig. 3.25. Relation between signal profiles of leukocyte and dust with two different thresholds.···107

Fig. 3.26. Histogram of pixel intensities of an image obtained by the ICC method. ···108

Fig. 3.27. Differences in area size between a leukocyte and a dust under the thresholdings. ···109

Fig. 3.28. Demarcation between leukocytes and dusts by the area ratio SL/SU.···110

Fig. 3.29. Flow chart of the double thresholding algorithm. ···111

Fig. 3.30. Flow diagram of the local thresholding.···112

Fig. 3.31. The histograms used in the local thresholding algorithm.···113

Fig. 3.32. Background intensity distribution. ···114

Fig. 3.33. Comparison of the leukocyte counts by the ICC method with and without double thresholding algorithm. ···119

Fig. 3.34. Comparison in the leukocyte counts among the ICC method, the Nageotte method and the flow cytometry.···122

Fig. 3.35. The comparison of the coefficient variation values with the theoretical values. ···127

Fig. 4.1. The development of platelet aggregates during aggregation reaction.···135

Fig. 4.2. Microchip used in µFIC. ···139

Fig. 4.3. Flow chart of whole measurements in µFIC. ···142

Fig. 4.4. Flow chart of particle extraction. ···143

Fig. 4.5. Image processing in µFIC. ···144

Fig. 4.6. Determination of threshold in µFIC. ···145

Fig. 4.7. Trajectories of particles measured by µFIC. ···147

Fig. 4.8. Various patterns of particles moving. ···149

Fig. 4.9. Typical image sequence data measured by µFIC. ···150

Fig. 4.10. Optical system for estimating the effect of out-of-focus location. ···152

Fig. 4.11. Optical system for estimating the effect of diffraction.···153

Fig. 4.12. Point spread function in µFIC system. ···154

(20)

頁

Fig. 4.13. Image convolution occurred in µFIC. ···155

Fig. 4.14. Comparison of theoretical particle image profiles with experimental results.···156

Fig. 4.15. Coordinate system in calculating the flow rate in the microchannel.···158

Fig. 4.16. Flow rate distributions in rectangular microchannel. ···159

Fig. 4.17. Dependence of particle diameter on the z-position. ···161

Fig. 4.18. Photographs of polystyrene particles. ···163

Fig. 4.19. System setup in µFIC. ···164

Fig. 4.20. Comparison of velocity stability.···167

Fig. 4.21. Flow monitoring data in µFIC.···168

Fig. 4.22. Bürker-Türk hemocytometer. ···169

Fig. 4.23. Comparison of particle counts by µFIC with the results of Bürker-Türk hemocytometry. ···172

Fig. 4.24. Change of CV values against the mean values.···173

Fig. 4.25. Particle recognition in the high-concentration sample. ···175

Fig. 4.26. Estimation of the depth of the measurement volume in µFIC. ···178

Fig. 4.27. Comparison of particle diameter distributions. ···180

Fig. 4.28. Comparison of different diameters of particles measured by µFIC. ···181

Fig. 4.29. Comparison of measured particle diameters with the true values. ···182

Fig. 4.30. Location distribution of particles in rectangular microchannel.···186

Fig. 4.31. Particle diameter dependence of the degree of tubular pinch effect.···193

Fig. 5.1. PSBEを用いたインピーダンス方式の細胞計数系.···203

Fig. 5. 2. 直接全血を導入したときに微小流路管壁に形成される血栓様吸着物. ···208

Fig. 5.3. 生体膜の流動モザイク・モデルの概念図. ···209

Fig. 5. 4. MPCポリマーの化学構造式.···210

Fig. 5. 5. poly(MPC-co-BMA) (PMB) の化学構造式. ···210

Fig. 5.6. MPCポリマーの生体適合の作用機序. ···211

Fig. 5.7. マイクロ化学チップ. ···214

Fig. 5.8. 非コーティング流路状態の時間変化.···218

Fig. 5.9. コーティング流路 (平衡化時間60分) の状態の時間変化. ···218

Fig. 5.10. 流路における吸着領域面積の時間変化.···219

Fig. 5.11. コーティング流路 (平衡化時間30分) の状態の時間変化. ···221

Fig. 5.12. コーティング流路 (平衡化時間0分PBS導入直後) の状態の時間変化. ··221

(21)

頁

Fig. 5.13. コーティング流路 (平衡化時間0分直接血液導入) の状態の時間変化. ···222

Fig. 5.14. 吸着領域面積の時間変化に対する平衡化時間の影響.···223

Fig. 5.15. µFFIC測定光学系. ···227

Fig. 5.16. 実際の光学配置. ···227

Fig. 5.17. µFFIC計測系蛍光画像撮影系の分光特性. ···229

Fig. 5.18. PI濃度計測のための測定系. ···230

Fig. 5.19. µFFIC計測系におけるU937蛍光強度のPI濃度依存性. ···231

Fig. 5.20. 白血球蛍光動画像撮影の様子. ···232

Fig. 5.21. 典型的な白血球蛍光画像とその画像処理. ···233

Fig. 5.22. U937細胞数の経日変化. ···234

Fig. 5.23. µFFIC法で撮影された典型的な白血球蛍光動画像その1. ···237

Fig. 5.24. µFFIC法で撮影された典型的な白血球蛍光動画像その2. ···238

Fig. 5.25. 微小流路中を流れる白血球に確認されたtubular pinch 効果. ···239

Fig. 5.26. Türk液で染色したU937培養白血球細胞の顕微鏡画像. ···241

Fig. 5.27. 細胞径による白血球認識の分類基準. ···242

Fig. 5.28. 白血球の楕円短辺径の定義. ···243

Fig. 5.29. 各クラスにおける白血球画像とその分類.···243

Fig. 5.30. Nageotte法とµFFIC法による白血球計数結果の比較. ···244

Fig. 5.31. CV値の平均値に対する変化.···245

Fig. 6.1. 平行平面板チャンバ. ···252

Fig. 6.2. 従来法で用いられた典型的なマイクロ・チャンバ. ···253

Fig. 6.3. A double infusion flow systemとmixing chamber. ···254

Fig. 6.4. Microchannel array flow analyzer, MC-FAN systemの測定模式図.···255

Fig. 6.5. コーン−プレート粘度計を用いた血小板凝集分析法. ···256

Fig. 6.6. 血小板の光学顕微鏡像．···262

Fig. 6.7. µFIC法によって得られたPRP試料中の血小板動画像. ···263

Fig. 6.8. PRP試料のµFIC法による画像とその差分画像の状況. ···264

Fig. 6.9. 本章で使用したマイクロチップの流路パターン.···266

Fig. 6.10. 層流界面位置制御の原理. ···267

Fig. 6.11. 2層流界面位置制御実験系の構成. ···269

Fig. 6.12. 流量変化による2層流間の界面位置の移動. ···270

(22)

頁

Fig. 6.13. 層流界面制御技術を用いた微小流路内における

2液反応機構の動作原理. ···272 Fig. 6.14. 3層流界面位置制御実験系の構成. ···274 Fig. 6.15. 実現した3層流流れ. ···274

Fig. 6.16. 層流界面制御技術を用いた微小流路内における

2液反応機構の作動状況. ···277 Fig. 6.17. 印加電圧と3層流れ幅の関係. ···278 Fig. 6.18. 界面衝突リアクタの動作原理. ···279 Fig. 6.19. 界面衝突リアクタを実現する別流路パターン.···280 Fig. 6.20. PRP試料，着色PBSバッファ，凝集惹起剤の3層流.···282

Fig. 6.21. 最前段Y字型ジャンクションにおけるPRP試料と

着色PBSバッファの2層流.···283 Fig. 6.22. 界面衝突リアクタ作動時の流れ状況. ···283 Fig. 6.23. 界面衝突リアクタによる血小板凝集反応.···284 Fig. 6.24. 界面衝突リアクタによる血小板凝集塊面積の時間変化. ···285 Fig. 6.25. 血小板凝集イメージング計測系の構成.···289 Fig. 6.26. 微小流路内を流れるコラーゲン惹起血小板凝集塊その1.···292 Fig. 6.27. 微小流路内を流れるコラーゲン惹起血小板凝集塊その2.···293 Fig. 6.28. 微小流路内を流れる血小板凝集塊動画像とその差分画像. ···295 Fig. 6.29. 微小流路内を流れる血小板凝集塊数のサイズごとの経時変化. ···296

Fig. 6.30. 界面衝突リアクタによって形成されたコラーゲン惹起

血小板凝集層の動画像. ···298 Fig. 6.31. 凝集層からの凝集塊の解離とローリング. ···299 Fig. 6.32. 界面衝突リアクタによる血小板凝集層形成初期過程の動画像. ···301 Fig. 6.33. 血小板凝集層の発達の様子を示す差分画像. ···302 Fig. 6.34. 血小板凝集層面積の経時変化. ···304 Fig. 6.35. 測定中の流量変化. ···305

Fig. 6.36. 単位流量あたりの血小板凝集層に関与する換算血小板数の経時変化. ···306

Fig. 6.37. 累積流量に対する血小板凝集層に関与する換算血小板数，あるいは

血小板凝集層に関与する換算血小板数の理想的経時変化. ···307 Fig. 6.38. 流れ停滞部で観察されたフィブリン凝集. ···314 Fig. 6.39. 気泡による測定場流れの崩壊. ···317 Fig. 6.40. マイクロチップによって測定可能な血小板凝集イメージング.···320

(23)

表目次

頁 Table 1.1. 血液細胞.··· 9 Table 1.2. 血漿中の成分. ··· 14 Table 1.3. ヒト血管の各部位と寸法. ··· 18 Table 1.4. 日本国における死因順位別死亡数・死亡率・構成割合. ··· 19 Table 1.5. マイクロ化学チップ技術. ··· 32

Table 3.1. Classification of the blood products for transfusion. ··· 78 Table 3.2. Contribution of the overlapping correction and the double thresholding.···121 Table 3.3. Data for evaluating the reproducibility of the ICC method.···126 Table 3.4. Comparison of the measurement time.···128 Table 4.1. Comparison of the properties of polystyrene with platelets. ···162 Table 4.2. Contribution of corrections of diffraction and out-of-focus location. ···183

Table 5.1. Cytometric methods using a microchannel. ···206 Table 5.2. The sizes of leukocytes measured by optical microscopy. ···241

Table 6.1. 微小流路中における化学反応の特徴.···258

Table 6.2. µFIC法による血小板数密度と血小板直径測定結果の

Bürker-Türk血球計算盤による測定値との比較···264

(24)

略語一覧

A

ADP Adenosine diphosphate １アデノシン2リン酸

AUC Area under the Curve あるデータ曲線の下の面積の総和

C

CCD Charged coupling devices 電荷結合素子

CJD Creutzfeldt Jacob disease クロイツフェルト−ヤコブ病

CMOS Complementary metal oxide semiconductor 相補性金属酸化膜半導体

CT (X線) Computed tomography コンピュータ断層撮影

CV Coefficient of variation 変動係数 (標準偏差/平均値 × 100 (%))

D

DNA Deoxyribonucleic acid デオキシリボ核酸

F

FDA Food and drag administration 米国食品医薬品局

G

GVHD Graft versus host disease 移植片対宿主病

H

HLA human leukocyte antigen ヒト白血球抗原

I

ICC (法) Image cytometry centrifugation 遠心濃縮細胞計数(法)

ITO Indium-tin-oxide インジウム-スズ酸化物

M

MEMS Micro-Electro-Mechanical Systems (機械要素部品，センサ，アクチュエータ，電子回

路を一つのシリコン基板上に集積化したデバイス)

µFIC (法) Microfluidic image cytometry マイクロ流体画像細胞計測(法) MPC 2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine

(25)

MRI magnetic resonance imaging 核磁気共鳴画像法

µTAS Micro-Total Analytical Systems (MEMS技術を用いて，チップ上に微小流路や反応室，混合室などを設け，1つのチップ，また

はデバイスで血液やDNAなどのさまざまな液体や気体を分析する生化学分析デバイス)

N

nvCJD New variant Creutzfeldt Jacob disease 新変異型クロイツフェルト−ヤコブ病

P

PBS Phosphate-buffered saline リン酸緩衝生理食塩水

(PBS バッファは，生体内と浸透圧が同じになるよう塩濃度を調整してある．通常のリン酸緩衝液は，細胞と浸透圧が異なる可能性がある．浸透圧が低ければ細胞が破裂，

あるいは溶血し，高ければ細胞の水分が奪われてしぼんでしまうといった弊害がある．)

PC¹ Platelet concentrates 濃厚血小板製剤

PC² Personal computer パーソナル・コンピュータ，パソコン

PDMS Poly dimethyl siloxane

PET Positron emission tomography ポジトロン断層法

PI Propidium iodide ヨウ化プロピジウム

^{(蛍光色素，DNA}の塩基間にインターカレートし

て，細胞核を蛍光染色することができる)

PIV Particle image velocimetry

PLT Platelet 血小板

PMB

PPP Platelet poor plasma 乏血小板血漿

(血小板のほとんど含まれていない血漿)

PRP Platelet rich plasma 多血小板血漿

(血小板が豊富に含まれている血漿)

PSF Point spread function 点状応答関数

R

RBC Red blood cell 赤血球

RC Red cells 赤血球製剤

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T

TRALI Transfusion-related acute lung injury 輸血関連急性肺障害

TRLS (法) Time-resolved laser scattering method 時間分解式レーザー散乱(法)

V

vWF von Willebrand factor フォン-ウィルブランド因子

W

WB Whole blood 全血，または，全血製剤

WBC White blood cell 白血球

(27)

第 1 章序論

最初に，本研究の意義と目的について述べ，本論文の構成を概観することによって，本研究の全体像を明らかにする．

その後，本研究の背景として，血液について述べる．本研究で血液を測定対象とする理由を明らかにするため，各種疾病の診断，健康状態や生体状態の把握に血液がいかに重要であるかについて述べる．血液中で営まれている多様な生命活動の中から，血小板凝集反応とその作用機序を取り上げ，本論文の理解に必要な知識を提供するとともに，本研究で血小板凝集反応を測定対象とする意義を明らかにする．

次に，本研究で開発する細胞計測技術の従来研究として，血小板凝集計測の従来方法を紹介する．本研究で開発する計測技術のもう1つの適用例である白血球計測に関する従来法については3章で述べることにする．

また，本研究の関連技術として，マイクロ化学チップ技術についても概観し，現状を把握するとともに，マイクロ化学チップを細胞計測に適用した先行研究についても説明する．

さらに，これらの従来研究および関連研究，先行研究を総括するとともに，この分野における課題を抽出し，本研究で行うべき指針とする．

最後に，上記指針にしたがい設定した本研究の目的とその意義について述べる．

(28)

1.1. 目的

生体医工学の分野において，血液中の細胞計測技術は重要な技術の一つである．血液細胞は生体を構成する重要な要素の一つであり，これまでに種々の血液細胞の検査法が確立・

利用されてきた．しかし，その数やサイズなどの物理的特性を計測するだけでは，生体内で血液細胞が果たす生理学的機能を解明するのに十分とはいい難い．なぜなら，生体内において血液細胞は他の生化学物質との相互作用，あるいは物理的刺激を受け，複数の血液細胞が体系的・集団的，かつ動的に活動することによって多種多様な機能を実現し，生命活動を維持しているからである．したがって，血液細胞の計測を行う場合，その動的状態を計測することが重要である．

本研究では，動画像を用いることによって，生体細胞の動的状態の計測を試みる．1.6.2 節で述べる科学的動画像とその計測技術の利点と問題点を考慮し，画像を撮影するだけではなく，計測によって得られた動画像を解析する方法の開発についても検討し，最終的には，動画像計測を用いた動的生命現象の定量化を実現することを目的とする．

本研究では，生体にとって重要，かつ不可欠である生命活動のうち，血液中の血小板凝集反応現象を測定の対象と定める．そこで，より具体的な目的として，血小板凝集・血栓形成現象に動画像解析技術を適用することによって，その動的状態を定量的に評価する方法を開発する．この血小板凝集反応の定量的イメージング計測法を開発するため，血管を模擬した微小流路を作成し，この微小流路中を流れる血液細胞の計測法を確立し，この方法によって得られる生体情報を定量的に評価するための研究を行う．

このような計測技術の確立は，生体活動・生命現象解明に対する理工学分野からの新しいアプローチであり，重要である．また，臨床的にも，血栓性疾患の疾病・病理状態の把握や診断，新薬開発に革新をもたらすべく有用な情報を提供することができるものと期待される．

本研究では，微小流路中での細胞動態の定量的イメージングを実現するための要素技術として，

(1) 画像処理および画像解析による細胞計測法の確立，

(2) MEMS (Micro-Electro-Mechanical Systems)，µTAS (Micro-Total Analytical Systems)などの微細加工技術を駆使したマイクロ化学チップ製造技術による微小流路の開発，

(3) マイクロ化学チップ上に実装された微小流路中を細胞が流れる様子のマイクロ PIV

(29)

(Particle Image Velocimetry)技術を用いた解析方法の実現，

(4) 従来の静的光散乱法による血小板凝集反応計測を定量する試みとして，化学反応速度論を利用した血小板凝集反応の数理モデルと数値解析方法の提案，

(5) 層流が支配的となる微小流路中における生化学反応の誘起，および制御，

(6) 血小板凝集，あるいは血栓形成現象を定量化するための物理的指標の抽出を挙げ，研究に取り組んだ．

(30)

1.2. 概要と構成

本研究は，7章で構成されている．Fig. 1.1は，本研究の構成と各章の関係を示したものである．

この図に示したように，本研究は，最終目的である血小板凝集反応の定量化イメージング計測法の実現へ向け，各章ごとに新しい試みを実施することによって，段階的に研究を進めた．

各章の概要は以下の通りである．

第1章「序論」では，本研究の位置づけと目的を明らかにし，論文の構成について述べる．

本研究の適用例として，(1) 輸血用血液製剤の品質管理に有用な白血球計数と，(2) 臨床検査に用いられる血小板凝集能計測を想定し，これらに関連する，医学，特に血液学，または，

血栓・止血学における分野で必要とされる血液細胞計測とその定量的評価の現状，および技術的課題を把握する．

第 2 章「光散乱法による血小板凝集能の定量化」では，血小板凝集反応の程度を定量化するために有用な指標について検討する．そのため，従来の静的光散乱法による血小板凝集計測の結果を定量的に評価するために有用な，血小板凝集反応の新しい数理モデルを提案した．血小板凝集反応に化学反応速度論を適用することによって線形逆問題を設定し，これを数値的に解析することによって血小板凝集反応の定量化を行った結果について述べ，血小板凝集塊の「数」と「サイズ」の経時変化が，凝集反応定量化の重要な指標となり得ることを示す．

第3章「静止蛍光画像を用いた血液細胞計数」では，2章で抽出された定量化指標のうち，

「数」を計測する方法，すなわち，輸血用血液製剤中に混入する白血球の計数方法の開発について述べる．これは，本研究で開発する最初の細胞画像計測法となる．特に，血液試料以外に夾雑物などが混入した試料から白血球のみを抽出するための蛍光染色技術と，その結果得られる蛍光静止画像の解析方法，白血球のみを抽出・計数するためのアルゴリズム，さらに，測定原理に由来する測定範囲の上限を実用に耐えうる程度に拡張するための補正アルゴリズムについて述べる．

第4章「マイクロPIVを用いた生体微粒子の数とサイズの同時計測」では，3章で開発した静止画像による細胞計測技術にマイクロ化学チップ技術と動画像計測技術，流体工学で用いられるマイクロ PIV(micro-particle image velocimetry)技術を適用することによって，粒子の

「数」と「サイズ」を同時計測するµFIC 法 (microfluidic image cytometry)を開発する．マイクロ化学チップ上に構成された微小流路中を流れて動く細胞の動画像を撮影し，得られた動画像の処理および解析法を開発する．本方法によって初めて「動く」粒子の計測が可能となり，本章は，細胞の動態計測研究のための第一歩となる．また，本章で，以降の研究で用いられる

(31)

測定系の基本型を試作・構築する．そこで，測定系の光学的，流体工学的特性についても検討する．微小流路中の流れ特性を利用することによって，微小流路中を流れる 2 次元動画像から細胞の 3 次元位置，細胞の流れる経路などの情報を抽出する方法についても述べる．この方法は，粒子のサイズ計測の補正に利用される．さらに，微小流路中を流れる細胞の位置分布にみられるtubular pinch効果についても考察する．

第5章「µFIC法を用いた蛍光画像計測による細胞計数」では，4章で開発したµFIC法の生体細胞計測への適用について述べる．生体細胞を微小流路へ導入する際の課題を抽出し，

これに対応する．さらに，3 章の蛍光計測系を実装することによってµFIC 法による細胞計測法を確立する．本方法では，あらかじめ蛍光染色した白血球を微小流路中に導入し，白血球の蛍光動画像を撮影し，動画像処理・解析技術を用いて，血液検体中に混入する夾雑物を排除して白血球のみを抽出・計数した．本手法の妥当性評価の結果，および 3 章で残された課題であった測定範囲の拡張が解決された結果について述べる．

第6章「µFIC法を用いた血小板凝集能の定量的イメージング」では，これまでの技術を総合し，血小板凝集，および粘着性凝集，血栓形成現象の定量的イメージングを行った結果について述べる．微小流路中において，血液試料と血小板凝集惹起薬液を混和するための機構として，界面衝突マイクロ・リアクタを考案・開発し，これと5章で確立した微小流路への細胞導入手法を用いて，微小流路中で血小板凝集反応を任意に開始し，流れ中に血小板凝集層が形成される過程を撮影することに成功した．4 章で開発した動画像計測技術により，細胞の

「数」と「サイズ」，あるいは「動態」の経時変化を計測し，その結果から血小板の凝集程度，すなわち，細胞の「機能」を定量的に評価するための指標を提案する．得られた定量化指標は，

2章で開発した解析法を適用し得る物理量である．さらに，4章のµFIC法によれば，2次元動画像から，流れる細胞の3次元位置，流れ経路の情報を抽出することができるため，凝集層の 3 次元構造を予測することのできる可能性がある．最後に，マイクロ化学チップを用いた血小板凝集計測の可能性について検討する．

第7章「結論と将来展望」では，本研究の結論を述べる．本研究のまとめと課題，疾病の診断に有用な情報を提供することのできる可能性，および，今後の展望について述べる．

(32)

7.7. 結結論論とと将将来展来展望望

血小板凝集反応の定量化指標の抽出

細胞の画像計測技術の確立

粒子数とサイズの動画像計測技術の確立

蛍光動画像解析による細胞計数技術の確立

細胞機能の定量的イメージング計測技術の実現

現状把握と課題抽出目標設定

適用例 1 血小板凝集反応の定量

的イメージング計測適用例 2 輸血用血液製剤中の

混入白血球の計数

静止画像細胞数のみ

動画像細胞数 & サイズ

動画像細胞機能,

( 血小板凝集能 ) 速度, 3次元座標

数 & サイズマイクロ化学チップ技術

動画像計測技術

細胞の導入

生体適合性ポリマー・コーティング技術

マイクロ流体の制御技術界面衝突マイクロ・リアクタ

1

1.. 序序論論

数 & サイズ時系列データ細胞

・・・データ型

・・・対象

・・・計測量

Fig. 1.1. 本研究の構成. 5

5.. µµFFIICC法を法を用用いいたた蛍

蛍光動光動画画像像計計測測にによよるる細細胞胞計数計数

6

6.. µµFFIICC法を法を用用いいたた血

血小小板板凝集凝集能の能の定定量量的的イイメメーージジンンググ

速度, 3次元座標ポリスチレ

ン粒子

動画像数 & サイズ

4

4.. マイマイククロロPIPIVVをを用用いいたた生体生体微粒微粒子子のの数数とサとサイイズズのの同同時計時計測測

33.. 静静止蛍止蛍光光画画像像を用を用いいたた細細胞胞計計数数 2.2. 線線形形逆逆問問題題解解法に法によるよる

血小血小板板凝集凝集反応反応のの定定量量化化

(33)

1.3. 背景

ここでは，本研究の背景として，本研究で開発する血小板凝集イメージング計測法の測定対象である血液の概要と血小板凝集反応の作用機序について述べる．

1.3.1. 血液 ^[1–5]

抗凝固剤をもちいて採血された血液を軽く遠心すると，Fig. 1.2に示したように3層に分離される．最上層は多血小板血漿，最下層は赤血球層，両層の間にある薄い膜状の層はbuffy coat といわれ，各々，血小板が浮遊した血漿，白血球，赤血球を含んでいる．このように，血液は，

約 45%の細胞成分と約 55%の液体成分から構成される．より詳細な血液の構成成分を Fig.

1.3にまとめた．

1.3.1.1.. 細胞成分細胞成分は，以下の細胞から構成される．

赤血球 (erythrocyte, red blood cell; RBC)，白血球 (leukocyte, white blood cell, WBC), 血小板 (platelet, PLT)

各細胞のおもな特徴をTable 1.1にまとめた．以下，各細胞について，形状，サイズ，機能について概観する．また，本研究では，マイクロ流体中を流れる細胞を測定対象とするため，これに関する細胞のレオロジー的特性についても述べる．

50 % 45 %

血液を軽く遠心すると (@1000 rpm, 5 min) ・・・

Fig. 1.2. 遠心処理による血液の分離.

多血小板血漿層

buffy coat

(白血球やタンパク質が浮遊)

赤血球層 100 %

多血小板血漿層

buffy coat

(白血球やタンパク質が浮遊)

赤血球層

(34)

血液

細胞成分

液体成分

赤血球

白血球

血小板

血漿

電解質

塩化ナトリウム

アルブミン

免疫グロブリン

フィブリノーゲン

ブドウ糖 (血糖)

各種脂質

中性脂肪

コレステロール

脂肪酸血液凝固因子カルシウム

(I フィブリノーゲン) 200–400 mg/dl II プロトロンビン 100–150 µg/ml III 組織トロンボプラスチン

(IV カルシウム (Ca²⁺))

V 不安定因子 (ACグロブリン) 50–100 µg/ml VII 安定因子(プロコンバーチン) 400 ng/ml VIII 抗血友病因子 (AHF・AHG) 100–200 ng/ml IX Christmas因子 (PTC) 3–5 ng/ml X Stuart-Prower因子 5–10 µg/ml

XI PTA 6 µg/ml

XII Hageman因子 20–30 µg/ml XIII フィブリン安定化因子 10–20 µg/ml

・プレカリクレイン (Fletcher因子) 50 µg/ml

・高分子 (HMW) キノゲン (Fitzgerald) 因子 70 µg/ml

・ von Willebrand因子 (vWF) 5–10 µg/ml 5 × 10⁷ 個/µl

直径: 約 8 µm 厚さ: 1 – 2 µm

5 – 10 × 10³ 個/µl

2.5 × 10⁶ 個/µl 直径: 2 – 3 µm 厚さ: 約0.5 µm

単球 60–70 % 直径: 10 – 12 µm

30–40 % 直径: 8 – 16 µm

5 %

直径: 14 – 20 µm

Fig. 1.2. 血液の構成.

NK 細胞

T 細胞

B 細胞

・killer T 細胞

・suppressor T 細胞

・helper T 細胞 etc.

45 %

50 %

有機物

血漿タンパク質好中球

好酸球

好塩基球顆粒球

リンパ球

大リンパ球

中型リンパ球

小リンパ球

その定量的イメージング計測法に関する研究

微小流路中の血液細胞動態と

その定量的イメージング計測法に関する研究

廣野 泰亮

電気通信大学

2008 年 3 月

微小流路中の血液細胞動態と

その定量的イメージング計測法に関する研究

廣野 泰亮

電気通信大学 大学院 電気通信学研究科 博士 ( 工学 ) の学位申請論文

2008 年 3 月

微小流路中の血液細胞動態と

その定量的イメージング計測法に関する研究

博士論文審査委員会

主査 山田 幸生 教授 （主指導教員）

副査 青山 尚之 教授 （指導教員）

委員 黒田 成昭 教授 （知能機械工学専攻）

委員 武田 光夫 教授 （情報通信工学専攻）

委員 中村 整 教授 （量子・物質工学専攻）

著作権所有者 廣野 泰亮

2008 年

Microfluidic Image Cytometry for Quantification of Biological Cell Dynamics

Taisuke Hirono

Abstract

微小流路中の血液細胞動態と

その定量的イメージング計測法に関する研究 廣野泰亮

概 要

目 次

第 1 章 序 論 ···

1

第 2 章 最小 2 乗法を用いた線形逆問題解法による

血小板凝集反応の定量化 ··· 39

第 3 章 静止蛍光画像を用いた血液細胞計数 ··· 75

第 4 章 マイクロ PIV を用いた生体微粒子の数とサイズの 同時計測法 ··· 133

第 5 章 µFIC 法を用いた蛍光動画像計測による 白血球細胞の計数 ··· 199

第 6 章 µFIC 法を用いた血小板凝集反応の 定量的イメージング ··· 249

第 7 章 結 論 ··· 325

謝辞 ··· 338

関連論文の印刷公表の方法および時期 ··· 342

著者略歴 ··· 345

図 目 次

表 目 次

略 語 一 覧

A

C

D

F

G

H

I

M

N

P

R

T

V

W

第 1 章 序 論

廣野泰亮

廣野泰亮

電気通信大学大学院電気通信学研究科博士 ( 工学 ) の学位申請論文

主査山田幸生教授（主指導教員）

副査青山尚之教授（指導教員）

委員黒田成昭教授（知能機械工学専攻）

委員武田光夫教授（情報通信工学専攻）

委員中村整教授（量子・物質工学専攻）

著作権所有者廣野泰亮

その定量的イメージング計測法に関する研究廣野泰亮

概要

目次

第 1 章序論 ···

第 2 章最小 2 乗法を用いた線形逆問題解法による

第 3 章静止蛍光画像を用いた血液細胞計数 ··· 75

第 4 章マイクロ PIV を用いた生体微粒子の数とサイズの同時計測法 ··· 133

第 5 章 µFIC 法を用いた蛍光動画像計測による白血球細胞の計数 ··· 199

第 6 章 µFIC 法を用いた血小板凝集反応の定量的イメージング ··· 249

第 7 章結論 ··· 325

図目次

表目次

略語一覧

第 1 章序論