博 士 （ 理 学 ） 小 橋 川 敬 博
学 位 論文 題名
NIVIR Study of Canine IVIilk Lysozyme ： Analysis of Folding IVIechanism ， and the Relationship between Dynamics ， Structure and Function
（ イ ヌ ミ ル ク リ ゾ チ ー ム の NMR に よ る 研 究 ： 折り畳み機構および構造一機能一ダイナミクス相関の解析）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
蛋 白 質 は 様々 な生 体反 応 に関 る分 子で あり 、 その 機能 、構 造、 物 性を 多角 的に 研 究す るこ と は 生 命 現 象 を理 解す る上 で 重要 であ る。 蛋白 質 は生 体内 にお いて → 旦ポ りベ プチ ド 鎖と して 合 成 さ れ た 後 に、 その 特異 的 な立 体構 造を 獲得 し て初 めて 機能 を発 揮 する 。多 くの 蛋 白質 は生 体 内 で 自 発 的 に立 体構 造を 形 成す るこ とが 知ら れ てい るが 、そ のメ カ ニズ ムに 関す る 詳細 は不 明 で ある 。
ま た 、 立 体構 造を 獲得 し た蛋 白質 が機 能を 発 揮す る過 程に おい て 様々 なダ イナ ミ クス が関 っ て いる 。そ のダ イ ナミ クス は様 々なタイムスケール(ris〜our）および様々な振幅 から成り立って お り 、 例 え ぱ、 ルー プ領 域 の局 所的 なダ イナ ミ クス から ドメ イン ご との 大き なダ イ ナミ クス な ど か ら 成 る 。し かし なが ら 、そ れら ダイ ナミ ク スの 機能 に対 する 直 接的 な役 割に 関 して は研 究 例 が少 なく 、不 明 な点 が多 い。
上 記 命 題 を解 明す る上 で 蛋白 質の 構造 、ダ イ ナミ クス に関 する ア ミノ 酸残 基レ ベ ルで の情 報 が 不 可 欠 で あ る 。 本 研 究 で はNMRと 他 の 様 々 な 物 理 化 学 的 手 法 を 組 み 合 わ せ る こ と に よル イ ヌ ミ ル ク リ ゾ チ ー ム （CML） の 構 造 、 ダ イ ナ ミ ク ス 、 機 能 に 関 し て 詳 細 に 調 べ た 。 2．イヌ ミルクリゾチームの特徴
CMLは 細 菌 の 細 胞 壁 の 構 成 成 分 で あ る ペ プ チ ド グ リ カ ン 中 のN‑acetylglucosamineと N‑acetylmuramicacidの問のp．1，4 glycosideの加水分解反応を 触媒することにより、溶菌作用を示 す 酵素 であ る 。CMLは 酸性 条件 下、 適量 の 変性 剤存 在下 に おい てMolten Globule State(MG)とよ ぱ れ る 部 分 変 性 状 態 を 形 成 す る 。MGは 蛋 白 質 の 折 り 畳 み 中 間 体 に 類似 し てい るこ とが 知 られ て お り 、 蛋 白 質 の 折り 畳み 機構 を 研究 する 上で 格好 の モデ ルで ある 。こ れ まで に、 アミ ノ 酸配 列 で80％ 以 上 の 相 同 性 を 示 す 蛋 白 質 で あ る 、 ウ マ ミ ル ク リ ゾ チ ー ム(EML)のMGに 関 し て 研 究 が 行 わ れ て き た が 、CMLは そ れ に 比 べ て 著し く高 い 安定 性を 保持 して い るこ とが 知ら れ てい る 。 本 研 究 で は2つ の 蛋 白 質 のMGを 比 較 す る こ と に よ り 、MGの 安 定 化 機 構 、 形 成 機 構 に つ いて検討 した。
CMLの そ の 他 の 特 徴 と し て は1個 のCa2十 を結 合し 、 それ によ り熱 安定 性 が著 しく 向上 す るこ と が 挙 げ ら れ る 。CMLに 対 す るCa2゛ 結 合の 効 果に っい てよ り 詳細 に知 るた めに(1)溶菌 活 性の 温 度 依 存 性 、(2)立 体 構 造 、(3)ダ イ ナ ミ ク ス 、(4)基 質 お よ び 反 応 生 成 物 の 類 似 体 で あ る p‑aminophenyl‑tri‑N‑acetyl‑p‑cmtomoside（PAP‐m‐NAG）に対する結合および解離速度をCa2十．舶e お よ びCP・boundstateの両 方に つ いて 調べ た。 それ ら の結 果か ら、 酵素 活 性、 ダイ ナミ ク ス、
耐熱性の 相関を立体構造に基づいて 検討した。
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3.CMLの折 り 畳み 中間 体に 関す る 研究
CMLのNative状 態 の1H NMRス ペ ク ト ル に は 環 電 流 効 果 に よ り0ppm以 下 に シ フ 卜 し た シ グ ナ ル が 存 在 し 、 芳 香 環 を 含 む 疎 水 性 コ ア の 存 在 を 示 唆 し て い る 。CMLが 完 全 にMGで あ る pH2．Oに お い て もOppm以 下 に シ フ 卜 し た シ グ ナ ル は ブ ロ ー ド化 され ては いる も のの 観測 され た （ 図1） 。 一 方 で 、EMLのMGに お い て はOppm以 下 に は シ グ ナ ル は 観 測 さ れ な い 。 こ の こ と よ りCMLのMGに お い て は 芳 香 環 を 含 む 疎 水 性 コ ア が ま だ 残 っ て お り 、 そ の こ と が 安 定 性 に 関 っ て い る と 考 え ら れ る 。 ま た 、CMLお よ びEMLの 立 体 構 造 はA，B，C，Dの4本 のa‐ ヘ リ ッ ク スよ りな るd ‑ド メイ ンと 、3本のD‐ シー トよ りなるp‐ドメ インにより構成されている が、
EMLのMGに お いて はp‐ ド メイ ンの 構造 は 壊れ てい てa｜ド メイ ン の みが 残っ てい ると さ れて いる 。一 方 、CMLのMGに おい て 観 測 され る0 ppm以下 のシ グナ ル は全 てC‐ヘ リッ クス 周辺 残 基 m来し てお り 丶そ のシ フト 値ッIド メイ ン 内… 引tt靉
関 与 が 化 学 シ フ ト 値 の 計 算 値 と 実 測 値 の 比 較 か ら 示 唆 さ れ た 。 ！ j l こ の こと は、CMLのMGにお いてD‐ ドメ イ ンの 構造 の一 部が 残 ｜j
っ て いる こと を示 して い る。 ず
次 に 主 鎖 ア ミ ド プ ロ 卜 ン の 重 水 素 交 換 反 応 を 行 っ た 。 交 換 速 U i1 度 が 速 い ほ ど そ の 残 基 の 溶 媒 露 出 性 が 高 い こ と を 示 す 。 CMLお ： nし よ びEMLの 両 方のMGに おい て4本の伐‐ ヘリックスの領域で交 丶 ｀AA．一｜‑‑‥ー． ‥．.atiw 換 速 度 が 遅 い と い う 傾 向 が 共 通 し て 見 ら れ た 。 し か し な が ら 、2 ｀ ＾ 、 〜 〜 〜 u6 つ の 蛋 白 質 の 交 換 速 度 を 比 較 し た と き 、 CMLの 方 が 著 し く 遅 い ー ‑〜 ‑ ・ー 〜UnfoIMd＾
こ と が わ か っ た 。 こ の こ と は 、d‐ ヘ リ ッ ク ス 自 体 の 安 定 性 がCML 嚇1が 亀r万 一r布‑0.*− H卿m
のMGの方 が高 いこ とを 示 して いる 。2つの 蛋白 質の アミノ酸図1：lHNMR，spectra of CML in the 配 列 を比 較し たと ころ 、CMLの 方 が丗 ヘリ ック ス間 の疎水性相native，MG :Wd unfolded states.
互 作 用を 強め る残 基ー の 置換 が起 こっ て いる こと がわ かっ た 。
こ の こ と よ りMGの 安 定 化 に お い て へ り ッ ク ス 問 の 協 同 的 相 互作 用が 重要 であ る こと がわ かっ た 。
4． CMLの 構 造 ― 機 能 一 ダ イ ナ ミ ク ス 相 関 に 関 す る 研 究 Ca2十‑free CML(X‑ray)とCa2+̲bound CML(NMR)の構 造を比較し たと こ ろ、2っ の状 態問 で基 本構 造 の変 化は 見ら れ なか った（図 2） 。し かし な がら 、局 所的 な構 造 変化 がい くっ か の領 域に見ら れた 。 特筆 すべ き変 化 とし てCa2十‑bindingに伴うD‑helixの分子 内部 の 方へ の移 動が 挙 げら れる 。こ れに よ りD‑helix近 傍と疎水 性コ ア との 間の 相互 作 用が 増加 し、 それ に よりD‑helix近傍の構 造 が 安 定 化 さ れ 、 分 子全 体の 耐熱 性の 向 上を もた らし た と考 え られ る 。また、D‑helix近 傍において遅いタイムスケー ルてS〜ms) のダ イ ナミ クス の低 下 が観 測さ れて いる 。 この こと はD‑helix近 傍の 構 造安 定化 と相 関 があ ると 思わ れる 。 また 、D‑helix近傍は 基質 結 合領 域を 形成 し てい るが 、D‑helix近 傍に お ける ダイナミ ク ス お よ び 構 造 の 変 化は 基質 との 相互 作 用に 影響 を与 え るこ と が 予 想 さ れ る 。 実 際 、 基 質 お よ び 生 成 物 の 類 似 体 で あ る PAP‑tri‑NAGに 対す る結 合速 度と 解離速度はCa2十‑bindingに伴い 低下していた（表1）。また、速いタイムスケール(ps〜、ns)のダイ
ナ ミク ス に関 して は、6っ ある基質結 合 サ ブ サ イ ト の う ち3っ で 低 下 し た も の の 、 分 子 全体 では あま り 変化 し て いな か った 。
以 上 よ り 、Ca2゛ の 結合 はCMLの 構 造 お よ ぴ ダ イ ナミ クス に対 し て、 分 子 全 体 に 均 一 とい うよ りは む しろ 局
図 2: Superimposition of the structures of Ca2+̲bound (black) and Ca2+̲free CML(gray).
表1： Enzymatic characterizationザくタ ゛‑触Pロndくゲ゛．6D甜耐Cん伍，
Ca2+̲free CML Ca2+̲bound CML Activation Energy (kj/moVK) 41.6 50.4 Optimum Temperarure(oC) 35 50
kon(lls) 8.80 x l02 4.02 x l02 kofi‑(l/s) 2.69 x 10‑3 1.24 x 10‑3 Melting Temperature (oC) 39.0 65.1
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所的に影響を与えることが明らかに
なった。そのダイナミクスの低下は主に基質結合領域に集中しており、それがCML の耐熱性 の向上、基質結合速度および生成物解離速度の低下に関っていることが示唆された。
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