乳 酸 菌 の 酸 性 ウ レ ア ー ゼ の 性 質 と そ の 応 用 に 関 す る研 究

学 位 論 文 題 名

農 学 博 士 柿 本 茂 八

乳 酸 菌 の 酸 性 ウ レ ア ー ゼ の 性 質 と そ の 応 用 に 関 す る研 究

学 位 論 文 内 容 の 要 旨

  ア ル コー ル飲 料 には ，発 癌 性物 質であるウレタン が含有されており， ウレタン含量を低 減させ る方 法 の開 発は 重 大な 関心 事 とな っていた。著者は ，ウレタンがエチル アルコールと尿素 から生 成す る と推 定し ， ウレ タン の 蓄積 抑制のためには前 駆体である尿素の分 解が有効であると 考え，

酸性 ウ レア ーゼ を 適用 して ， 通常 酸性である酒類中 の尿素の分解技術を 確立することを目 的に本 研究を行った 。

  ま ず ，酸 性ウ レ アー ゼを 生 産し 得る微生物を，広 く自然界および保存 菌株中に検索した 結果，

動物 消 化管 内容 物 およ び糞 便 から の分離株16，324株のうちの700株と， 保存菌株118株のうちの3 株に本活性を 見出した。これら酸 性ウレアーゼ生産 菌の菌学的諸性質 を検討した結果，大部分（98     碕

％ ） は ，Streptococcus属，Lactobacillus属 に属 し てい たほ か ，Staphy Zococcus属 ，Bifido bacterium属 ，E．scんeんcん ぬ 属 ，MO曙0ne2ぬ 属 の4属 に も 分 布 し て い た 。   次 に ，己acと06acff2us属 およ び ＆r印 とococcMs属に 属する酸性ウレ アーゼ生産菌37菌 株の菌 体抽 出 液を 用い て ，こ れら の 産生 する 酸 性ウ レア ー ゼが，電 気泳動的に6夕イプの分子種 に分類 され る こと を示 し た。 各タ イ プか ら代 表 酵素 を1っ ずつ 選び，それらの 分子量，等電点， 酵素活 性お よ び安 定性 に およ ぼすpHおよ び温 度 の影 響を 調 べ， いず れ の性 質に も 多様性がある ことを 明ら か にし た。 酸 性領 域で 最 も安 定に活性を維持し 得た酵素は，己，んrmenとumIF014511，工．

reMとeんRT―5，s．mfとforPG−118由 来 の酵 素で あ り， この 性 質は ，既 知 の中性ウレア ーゼの いずれにも認 められないものであ る。

  酸 性 域で 安定 性 の高 い工 ， ルrmenとumIF014511， 工．reufeんRTー5，s．mfとforPG一l18由 来の 酵 素を 電気 泳 動的 に単 一 にな るまで精製し，そ の諸性質を明らかに した。精製酵素の 分子量 はそれぞれ220，000，220，000，200，000で，等電点は4．8，4．7，4，6であった。いずれの精製酵素 も分子量の異 なる3サブ ュニットから構成 されており，サブュ ニット分子量は，a：66，000〜68，O 00， ロ ：15，000〜16，800，7：8，600〜8，800の範 囲に分布していた。 サブュニットの構 成比は

（ ばIロ271）2と 推 定 さ れ ， （ば1ロ271）ユ ニッ ト あた り2モ ルの ニ ッケ ルを 含 有し てい た 。

110

3

精製酵素のアミノ酸組成は互いに近似しており，チ口シン，メチオニンの含量か中性ウレアー ゼより高いことが特徴的であった。己，

fermenturn

，IF014511由来の酵素のd，月，7サブュニッ トを分離し，それぞれのアミノ酸組成およびN末端アミノ酸配列を決定した。3精製酵素の基質 特異性は同じ特徴を示し，尿素とヒド口キシ尿素を基質とした。それぞれの至適反応pHは，2，

2

． 4.5であり，至適反応温度はいずれも65℃であヮた。精製酵素の至適反応pH，37℃におけ るKm値は，それぞれ2．7，2．8，2．OmMであり，

Vmax

値は，それぞれ440，580，460Umol／

min7mg protein

であ った 。い ず れの 酵素 活性 も

pH3

〜

9

の 範囲 で安 定であり，一方pH4の 緩衝液中で種々温度で30分間保温したところ，L. fermentz.tm IF014511，己，reuteri RT‑―5由 来の精製酵素活性は50℃まで，S．mitior PG一118由来の精製酵素活性は40℃まで安定であった。

3

精製酵素活性ともHg2十，Ag゛，Cuい，パラク口口メリクリ安息香酸，アセトヒドロキサ厶 酸により阻害された。

  

次に，己，fermentum IF014511による酸性ウレアーゼ生産のための最適培養条件の検討を行ワ た。酸性ウレアーゼ生産に対して最適な炭素源はグルコースであり，窒素源はぺプトン，肉工キ ス，酵母工キスであった。尿素を添加して酵素を誘導生産させたところ，単位液量あたり酵素量 は4倍に も増 加し た。

0.005Y6 (W/V

）硫 酸二ッケル6水和物と，O．oosi0（W/V）硫酸マン ガン4〜5水和物の添加が有効であり，これら

2

金属塩は酵素生産に対して相乗効果を示した。

至適生育温度は

34

〜42℃であり，酵素生産は30 ‑‑36℃の範囲で高く，32℃で最も高かった。そこ で種培養は37℃で，酵素生産培養は32℃で培養した。炭酸ナトリウムを中和剤として培養pHを

4

〜4．5に制御することにより，酵素生産量が高くなった。これらの結果をもとに，2，000セ発酵 槽での最適培養条件を設定して培養を行ったところ，酸性ウレアーゼの活性は40units/mEに達 し，これは検討開始時の約

20

倍の上昇であった。

  

次いで，L.fermentum IF014511由来の酸性ウレアーゼを用いて，清酒中での尿素除去に景彡 響する種々の要因にっいて調べた。清酒中で保温すると中性ウレアーゼは不安定であったが，酸 性ウレアーゼは安定であり，

30

℃で16日間保温後も，約50％の活性が残存していた。尿素の除去 に対する至適温度は30〜40℃であった。pH4.9以下では，pHが高いほど尿素の除去は速かった。

30units/

ゼの酸性ウレアーゼを添加し，

15

℃で反応させることにより，

4

日間で

30ppm

の尿素を 完全に除去することが出来た。一方，30ppmの尿素を含む清酒を，30℃で3月間保温すると120

ppb

のウレタンが生成した。これに対し，酸性ウレアーゼで尿素を除去した清酒を同条件で保 温しても，ウレタンの生成は認められず，本酵素がウレタンの生成抑制に有効であることが示さ れた。酸性ウレアーゼ（菌体抽出液）の変異原性および毒性試験の結果，いずれも異常は認めら

れなかった。

  

著者らが本研究で開発した，酸性ウレアーゼを酒質保全剤として清酒に添加する方法は，国税 庁の認可を経てすでに清酒製造業界において広く実施されて，極めて有効な方法であることが，

工業的規模で実証されている。

学位論文審査の要旨

  

アルコール飲料には，発癌性物質であるウレタンが含有されており，ウレタン含量を低滅させ る方法の開発は，重大な関心事であった。本論文は，ウレタンの蓄積抑制のためには酒類中に含 まれる尿素の分解が有効であると考え，酸性ウレアーゼを適用して通常酸性であるアルコール飲 料中の尿素分解技術を確立した結果をまとめたもので，総頁数95，表30，図18，引用文献95から なる和文の論文である。その他に関連論文7編が添えられている。主な内容は以下のように要約 される。

1

．酸性ウレアーゼ生産菌の検索とその菌学的性質

  

酸性ウレアーゼを生産しうる微生物を広く自然界および保存菌株中に検索し，703株に本活性 を見出した。これら酸性ウレアーゼ生産菌の菌学的諸性質を検討した結果，大部分(98％）は，

Lactobacillus

属，Stretococcus属に属していたほか，Staphylococcus属，

Bifidobacterium

属 ，

E

．

sc

ん

e

ん

c

ん ぬ 属 ，

Mor

・

g

． 。

neZ

ぬ 属 の

4

属 に も 分 布 し て い た 。

2

．酸性ウレアーゼの多様性

  Lactobacillus

属およびStreptococcus属に属する酸性ウレアーゼ生産菌37菌株の菌体抽出 液を用いて，これらの生産する酸性ウレアーゼが，電気泳動的に6夕イプの分子種に分類される ことを示した。各タイプから代表酵素を1っずつ選び，それらの分子量，等電点，酵素活性およ び安定性におよぼす

pH

および温度の影響を調べ，いずれの性質にも多様性があることを明らか

112

司 哉

男

哮 誠

房

野 葉

田

大 千

冨

授 授

授

教 教

教

査 査

査

主 副

副

に した 。己 ． fermentum IF014511，L. reuteri RT―5，sImitior PG―118由来 の酵 素 は酸 性 領 域で 最も 安 定に 活性 を 維持し ，この性質は，既知 の中性ウレアーゼ のいずれにも認め られない こ とを 示し た 。

3． 精 製酸 性ウ レ ア― ゼの 蛋 白化 学的 お よび 酵素 学 的性 質の 解 析

  酸 性域 で 安定 性の 高 い， 己，fermentum IF014511， 工 ．reuteri RT←5，S．mitior PG―118 由来 の酵 素を電気泳動的に単 一になるまで精製 した。3精 製酵素の分子量は200，000〜 220，000, 等電 点は4．6〜4.8の 範囲 に 分布していた。い ずれの酵素も異な る3種のサ ブュニット（血， 居，

ア） から 成 り， その 構 成比 は（aiロ27｜）2と推 定され た。更に，金属含 量，アミノ酸組成 ，サ ブュ ニッ ト のN末 端ア ミノ 酸 配列 ，な ど の蛋 白化 学 的特 性を 明 らか にし た。一方，3酵素は ，尿 素と ヒド 口 キシ 尿素 を 基質 とする同 じ基質特異性を有す ることを示すとと もに，それぞれの 至適 反 応pH， 至 適 温 度 ，KmとVmax値 ， 安 定 なpH領 域 お よ び 熱 安 定 性 ， 阻 害 剤 な ど の 酵 素 学 的性 質を 明 らか にし た 。

4． 酸性 ウレ ア ーゼ 生産 条 件の 検討

  工，fermentum IF014511に よ る酸 性ウ レ アー ゼ生 産 のた めの 最 適条件 の検討を行った。 最適 な 炭素 源 はグ ルコ ー スで あり，窒素 源はペプトン，肉 工キス，酵母工キス であった。尿素添 加に よ り酵 素 の誘 導生 産 がみ られ ， 酵素 量は4倍に 増加し た。硫酸二ッケルと 硫酸マンガンの添 加が 有 効で あ り， これ ら2金 属 塩は 酵素 生 産に 対し て相乗 効果を示した。種培 養を37℃に酵素生 産培 養 を32℃ とし，炭酸ナトリ ウムを中和剤として 培養pHを4〜4．5に制御しっ つ2，000セ酉發酵 槽で 培 養し た とこ ろ， 酸 性ウ レア ー ゼの 活性 は 検討 開始 時 の約20倍 に 上昇し ，40units/泌とい う高 い 価に 達 した 。

5．酸性 ウレアーゼによる 清酒中の尿素除去と ウレタン生成の抑 制

  酸性ウレアーゼ を用いて清酒中の 尿素の除去活性に影響する因子にっいて明らかにするとともに，

30units/ゼ の酸 性ウ レ アー ゼを 添 加し ，15℃ で反 応さ せ ると ，4日 間で30ppmの尿素を完全 に除 去す るこ と を確 認し た 。一 方，30ppmの 尿素 を含 む 清酒 を，30℃で3月 間保温すると120ppbのウ レタンが生成した 。これに対し，酸 性ウレアーゼで尿 素を除去した清酒を 同条件で保温してもウレ タンの生成は認め られず，本酵素は ウレタンの生成抑 制に有効であること を示した。酸性ウレアー ゼ （ 菌 体 抽 出 液 ） の 変 異 原 性 お よ び 毒 性 試 験 の 結 果 ， い ず れ も 異常 は 認め られ な かっ た。

  

本研究 で著者 らが開 発し た酸性 ウレア ーゼを ウレ タン生 成抑制 のため の酒質保全剤として清酒 に 添加 する方 法は， 国税庁 の認 可を経 て清酒 製造界 で広く 実施 されて おり，極めて有効な方法で あ るこ とが工 業的規 模で実 証さ れてい る。本 研究は ，この よう に産業 上重要な貢献をすると同時 に ，酸 性ウレ アーゼ を精製 し， 酵素学的あるいは蛋白化学的に詳しく調べた初めてのものであり，

学 術的 にも高 く評価 される もの である 。

  

よって 審査員 一同は ，別 に実施 した学 力確認 試験 の結果 と合わ せて， 本論文の提出者柿本茂八 は 農学 博士の 学位を 受ける に充 分な資 格があ るもの と認定 した 。

114ー