Title
Evaluation of the Immunogenic and Diagnostic Potential of
Toxoplasma gondii Molecules( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
DAUTU, George
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(獣医学) 甲第259号
Issue Date
2008-09-12
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/33571
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏 名(国籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 貞 DAUTU,George(ザンビア共和国) 博士(獣医) 獣医博甲第259号 平成20年9月12日 学位規則第3条第1項該当 連合獣医学研究科 獣医学専攻 帯広畜産大学
Evaluation of theImmunogenicand Diagnostic
Potentialof 7bxqplasM gODdllMolecules
(トキソプラズマ原虫由来分子の免疫および診断応用 への可能性に関する研究) 主査 帯広畜産大学 教 授 副査 帯広畜産大学 副査 岩 手大学 副査 東京農工大学 副査 東京農工大学 副査 岐阜大学 教 教 教 教 教 授 授 授 授 授 一生 治一珍 誠 壮 久 修 英 浩 野 園 田 多.田 山 牧 倉 津 本 松 杉 論 文 の 内 容 の 要 旨 トキソプラズマ原虫(乃岬ノβ5野脚〟ノ)はアピコンプレックス門に属する細胞 内偏性寄生原虫である｡先天性感染においては,失明,精神発達遅滞,水頭症など の深刻な異常を引き起こす｡さらに,エイズや臓器移植患者のような免疫抑制患者 における最も主要な日和見感染症としても重要である(Dzierszinskietal･,1999, Lufta｡dR｡mi｡gt｡n,1992)｡エイズ患者においては,シスト内の緩増虫体(プラデ ィゾイト)が増殖型虫体(タキゾイト)に分化し,致死的な脳炎を引き起こす｡ト キソプラズマ症を効果的に予防,あるいは治療するためには,急性･慢性感染の鑑 別診断法の開発,及び効果的な薬剤ならびにワクチンの開発が不可欠である｡しか しながら現時点において,このようなワクチン,薬剤及び診断法はない｡そこで, 申請者はこのような問題を解決することを目的として,以下わ研究を行なった｡ 1.トキソプラズマ症に対し,高い効果を有するDNAワクチンの開発 2.薬剤標的分子としてのトキソプラズマ由来'FABZ分子(TgFABZ)の解析 3.トキソプラズマ原虫の急性および慢性感染鑑別診断法の開発 1.トキソプラズマ原虫由来,MIC2,M2AP,AMAl,BAGl遺伝子を用いたDNAワクチ ンの評価 トキソプラズマ由来ミクロネーム蛋白を数種類組み合わせて用いたワクチンは慢性 トキソプラズマ症に効果的であるとの報告がある0本研究において申請者は,トキ
ー105-ソプラズマ遺伝子であるAMAl,MIC2,M2AP,およびBAGl遺伝子をジーンガンを用 いてマウス(BALB/C,およびC57BL/6)の皮内に導入し,その免疫誘導能を評価し た｡AMAl免疫マウスにおいて,高レベルのIgG2aおよびIgG2c抗体とインターフェ ロンγの産生を引き起こしたことから,Thl型免疫の誘導を示唆した｡さらに,AMAl 免疫マウスはトキソプラズマ感染に対し,MIC2,M2AP,BAGl免疫マウスに比較し, 不完全ながらも強い防御効果を示した｡このことから,A舶1遺伝子を用いたワクチ ンはMIC2,M2AP,BAGlワクチンに比べ,より強い特異的免疫を引き起こすとともに, トキソプラズマ原虫感染に対しより効果的な感染防御能を付与すると考えられた｡
2.トキソプラズマ原虫由来β-Hydroxyacy卜AcylCarrier Protein Dehydratase
(TgFABZ)の性状解析
トキソプラズマ原虫はその宿主である噂乳動物と異なり,それぞれの独立した酵素 が各合成段階を触媒するという,いわゆるⅡ型の脂肪酸合成経路を利用している｡ このような違いから,Ⅱ型合成経路に関与する酵素はトキソプラズマ症に対する治 療薬開発の良い標的分子になり得ると考えちれる｡本研究において申請者は,トキ
ソプラズマ原虫β-Hydroxyacy卜AcylCarrier Protein Dehydratase(TgFABZ)遺伝 子がタキゾイトおよびブラディゾイトともに発現していることをRT-PCR法を用い て示した｡また間接蛍光抗体法を用い,TgFABZ蛋白がタキゾイトおよびブラディゾ イトともに発現しており,原虫の細胞内小器官であるアピコブラストに局在してい ることを示した｡大腸菌組換え蛋白は酵素活性を有し,そのKm値はcrotonoy卜CoA を基質として,82.57±10叫Mであった｡ 3.トキソプラズマ原虫実験感染マウス血清中に串ける旧ClO蛋白検出法の開発
申請者はサンドイッチELISA準を用いた血流中トキソプラズマ原虫MIClO抗原の検
出法の開発を行なった｡トキソプラズマ原虫試験管内培養上清中において,MIClO 抗原は増殖依存的に検出された｡感染致死量のRH株(強毒株)およびBeverley株 (弱毒株),感染致死量以下のPLK株(弱毒株)をマウスに接種し,感染実験を行っ た｡肌ClO抗原はⅢ株感染二日後のマウス血清において検出され,感染経過に伴い 抗原量は増大して言った｡一方,Beverley株タキゾイト腹腔内感染マウス血清中に おいては,MIClO抗原は検出されるもののその量は著しく低かった｡対照的に, Beverley株シストの経口感染においてはMIClO抗原は検出されなかった｡PLK株感 染マウス血清において,MIClO抗原は急性期後期から慢性期前期にかけて最も多く 検出された｡これらのデータから,血清中のMIclO抗原量の動態は株問および感染 ルートにより異なることが示された｡ 本研究において,トキソプラズマ症に対する新たな防御戦略の観点から,申請者は いくつかのトキソプラズマ由来分子に関してそのワクチンあるいは薬剤標的分子としての評価を行なった｡さらに急性･慢性鑑別診断法の関東にも取り組んだ｡ワク
チン開発においては,ミクロネーム蛋白を中心にその効果を検証した｡問題点とし ては,いずれの分子もトキソプラズマ感染に対し完全な防御効果を示さなかったこ とであり,今後これら分子を組み合わせるようなワクチンデザインを考慮する必要 性が考えられる｡薬剤標的分子としてのTgFABZ分子に関しては,その酵素測定法を 確立したことにより,今後の薬剤スクリーニングに応用できるものと考えられる｡血清中のトキソプラズマ抗原検出法の開発は,トキソプラズマ急性感染の診断に有 用であると考えられ,今後臨床応用のためにさらに信頼性を高めていくことが必要
である｡これらの研究は医学及び獣医学領嘘で,トキソプラズマ症制圧のために有
用であると思われる｡ 審 査 結 果 の 要 旨 申請者の研究は,人獣共通感染症である細胞内寄生性のトキソプラズマ原虫 乃ズ叩ノ∂ぷ財g即〟Jより,ワクチン,薬剤の標的,及び診断に応用できる可能性のある分 子を探り,トキソプラズマ症制圧の辛がかりを得ようとするものである｡ワクチン開発 に関して申請者は,トキソプラズマ遺伝子であるAMAl,MIC2,M2AP,およびBAGl遺伝子 をジーンガンによりマウス(BALB/C,およびC57BL/6)の皮内に導入し,その免疫誘導 能を評価した｡AMAl免疫マウスにおいて,高レベルのIgG2aおよびIgG2c抗体とインタ ーフェロンγの産生を引き起こしたことから,Thl型免疫の誘導を示唆した｡さらに, AMAl免疫マウスはトキソプラズマ感染に対し,MIC2,M2AP,BAGl免疫マウスに比較し, 不完全ながらも強い防御効果を示した｡このことから申請者は,AMAl遺伝子を用いたワ クチンはMIC2,M2AP,BAGlワクチンに比べ,より強い特異的免疫を引き起こすとともに, トキソプラズマ原虫感染に対しより効果的な感染防御能を付与することを明らかにし た｡次に,申請者は宿主との代謝酵素の違いをもとに,トキソプラズマ症に対する治療 薬開発の標的分子としてのβ-Hydroxyacyl-AcylCarrierProteinDehydratase(TgFABZ) の解析を行なった｡申請者はTgFABZ遺伝子が急性期の虫体ステージであるタキゾイトお よび慢性期ステージであるブラディゾイトともに発現していること,TgFABZ蛋白が両ス テージにおいて原虫の細胞内小器官であるアピコプラストに局在していることを示し た｡さらに薬剤スクリーニングの目的で･CrOtOnOyl-CoAを基質として用いる酵素測定系 を確立した｡最後に,申請者はサンドイッチELISA法を用いた血流中トキソプラズマ原 虫MIClO抗原の検出法の開発を行なった｡この方法を用い,申請者はトキソプラズマ原 虫試験管内培養上浦中および実験感染マウス血清においてMIClO抗原の検出に成功した｡ また,感染実験の詳細な検討により,血清中のMIClO抗原量の動態は株問および感染ル ートにより異なることを明らかにした｡以上の内容は,トキソプラズマ症を制圧する上 での辛がかりとして,学術的に重要な知見を提示したといえる｡■更に,その成果を評価 の高い海外の雑誌に発表し,研究者としての素質ならびに熱意は十分学位を与えるだけ の価値があると全員一敦で判断した｡ 以上について,審査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位 論文として十分価値があると認めた｡ 基礎となる学術論文 1)題 目:7bxqplasmag∽dil:DNAvaccinationwithgenesencodingantigensMIC2,M2AP,AMAland BAGland evaluation of theirimmunogenic POtential
著 者 名:Dautu,G,,Munyaka,B.,Carmen,G.,Zhang,G･,Onata,Y･,Xuan,
Ⅹ.andIgarashi,W.
学術雑誌名:ExperimentalParasitology 巻･号･貢･発行年.:116(3):273-282,2007
2)題 目:7hrqpla5MBmdII:detection of MIClO antigenin sera of experimentallyinfected nice
ー107-著 者 名:Dautu,G.,Ueno,A.,Miranda,A.,Mwanyumba,S.,Munyaka,B., Carmen,G.,Kariya,T.,Omata,Y.,Saito,A.,Ⅹuan,X.and IgarashiM. 学術雑誌名:ExperimentalParasitology 巻･号･貢･発行年:118(3):362-371,2008 3)題 目:Molecularandbiochemicalcharacterizationof7bxqplasM8mdIl
beta-hydroxyacyl-aCylcarrier protein dehydratase(FABZ)
著 者 名:Dautu,G.,Ueno,A.,Munyaka,B.,Carmen,G.,Makino,S.,
Kobayashi,Y.andIgarashi,M.
学術雑誌名:Parasitology Research
巻･号･貫･発行年:102(6):130卜1309,2008
既発表学術論文
1)題 目･:A heterologous prime-boost vaccination regime using DNA and a VaCCinia virus,both expressing GRA4,induced protective
immunity against 7bxqplas脚∂gOndIIinfectionin mice
著 者 名:Zhang,G.,Huong,Ⅴ.T.,Battur,B.,Zhou,J.,Zhang,H.,Liao,
M.,Kawase,0.,Lee,E.G.,Dautu,GリIgarashi,M.,Nishikawa, Y.and Xuan,X.
学術雑誌名:Parasitology
