Title
Long-term maintenance of brain tumor stem cell properties under
at non-adherent and adherent culture conditions( 内容の要旨
(Summary) )
Author(s)
稲垣, 亮仁
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（再生医科学）甲 第762号
Issue Date
2008-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/23167
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
氏名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与要件 学位論文題目 審 査 委 貞 稲 垣 亮 仁(愛知県) 博 士(再生医科学) 甲第 762 号 平成 20 年 3 月 25 日 学位規則第4条第1項該当
Long-term maintenance of brain tumor stem cellproperties under at non-adherent and adherent culture conditions
(主査)教授 囲 貞 隆 弘 (副査)教授 岩 間 亨 教授 中 川 敏 幸 論文内容の要旨 【目的､緒言】 近年,様々な腫瘍から腫瘍幹細胞が分離,同定されているとの報告がみられる｡腫瘍幹細胞とは腫瘍の 中に存在する幹細胞様の性質を持った細胞のことであり,患者の腫瘍組織像と同様の二次腫瘍を作り出す ことができる｡また,腫瘍の再発は腫瘍摘出手術における残存した腫瘍幹細胞が増殖して発生していると 考えられる｡そこで我々は患者個人から脳腫瘍幹細胞の初代培養を試みたところ,長期培養可能な細胞株 を得られることに成功した｡この細胞は浮遊培養もしくは接着培養の二つの条件下で長期培養することが でき,各々の条件下で,どう性質が異なるかを調査した｡また,浮遊細胞塊(spbere)から脳腫瘍幹細胞 のマーカーであるCD133陽性細胞を分離し,二つのクローンを得た｡この二つのクローンにおいても, どのような性質を持っているのかを調査した｡ 【対象と方法】 細胞培養 グリオブラストーマの患者個人から腫瘍を摘出し,Neurosphere法により初代培養を行った｡浮遊培養 はDMEM/F-12にB27,LIF,EGF,FGFを添加した培地を使用した｡接着培養はDMEM/F-12にB27,ウシ血清 を含んだ培地を使用した｡ 免疫染色とフローサイトメトリー Poly-L-1ysineでコートしたdishに細胞を撒き,以下の抗体を使用し免疫染色を行った｡一次抗体,human anti-neStin,humananti-muSaShil,humananti-CD133,humanantiTTujl,humananti-GFAP｡二次抗体, Alexa fluorophoren｡ CD133陽性細胞はCD133-APCを用いてFACSVantageにより分離した｡ 免疫不全マウスヘの細胞移植 免疫不全マウスの脳内へ定位脳手術台を用いて細胞を移植した｡神経症状が出た.段階で脳を摘出し,切 片を作成した｡免疫不全マウスの腹腔内へ細胞を接種した｡ 脳組織の免疫染色 マウスから摘出した脳をホルマリン固定し,パラフィン切片を作成した｡切片はHE染色,免疫染色を行 った｡ RNA解析 cRNAの調整,ハイプリダイゼーション,マイクロアレイはAffymetrix社のプロトコルに従って行った｡ Microarray procedureとデータ解析
浮遊培養条件下と接着培養条件下の細胞の性質を比べたデータ解析はAffymetrix GeneChip operating
softwareを使用し,遺伝子の発現量が2倍以上あったものを論文中のテーブルに示した｡
-89-【結果】 接着培養条件下で培養した腫瘍幹細胞は試験管内にてニューロン,グリアの両方の細胞へ分化した｡ま た,この接着細胞は脳内においては二次腫瘍を形成できなかったが,腹腔内へ10000000個の細胞を接種す ると患者の腫瘍組織像と同様な二次腫瘍を形成した｡浮遊細胞は,100000個で脳内に二次腫瘍を形成した｡ 次に,浮遊細胞,接着細胞,接着細胞から誘導した浮遊細胞の3種の細胞についてCD133陽性率●を調べ たところ,接着細胞ではほとんど発現が見られず,接着細胞から誘導した浮遊細胞は元の浮遊細胞に比べ 約5倍のCD133陽性率を示した｡次に,接着細胞から誘導した浮遊細胞からCD133陽性細胞を分離し,100 個,1000個,10000個ずつ免疫不全マウスの脳内へ移植したところ,1000個以上では全てのマウスで腫瘍 形成を認めたが,100個の移植では3ケ月を経過しても腫瘍形成は認められなかった｡次に,接着細胞と 浮遊細胞の遺伝子発現の違いをcDNA microarrayで比較検討したところ,浮遊細胞ではグリオブラストー マの発生に関わるとされるEGFR,VEGF,IGFBP2の発現が上昇していた｡また,接着細胞では成長因子であ るBDNF,LIF,PDGFAが高発現していた｡ 最後に,接着細胞から誘導した浮遊細胞からCD133で1個ずつ細胞を分離し,二つのクローンを得た｡ 二つのクローンは元の浮遊細胞に比べて,非常に少数の細胞でsphereを形成することができ,自己複製能 が非常に高い集団であることがわかった｡このクローンもまた,接着条件下で多分化能を有し,患者と同 様の二次腫瘍を形成することができた｡ 【考察】 我々が樹立した脳腫瘍幹細胞株は試験管内においてニューロン,グリアへ分化したことから神経幹細胞 に類似の多分化能を有し,免疫不全マウスの脳内,腹腔内において患者の腫瘍組織像と同様の二次腫瘍を 形成したことから腫瘍幹細胞の特性を満たしていると考えられる｡接着細胞から誘導した浮遊細胞が元の 浮遊細胞より高いCD133陽性率を示したことから,接着培養から浮遊培養へ転換することにより腫瘍幹細 胞が濃縮されていると考えられる｡浮遊細胞のCD133陽性細胞は最低1000個で腫瘍形成を認め,接着細胞 はCD133陽性細胞が最低6000個あれば腫瘍を形成することから,各々の条件下で腫瘍形成には一定の CD133陽性細胞が必要と考えられる｡ 接着細胞と浮遊細胞の遺伝子発現の違いをcDNA microarrayで調べた結果,浮遊細胞には腫瘍発生に関 連する遺伝子が多く発現していることから,浮遊細胞には腫瘍幹細胞が高密度に存在していると考えられ, マウスへの移植実験の結果と矛盾がないと思われる｡また,接着細胞には成長因子の高発現が認められる ことからl腫瘍幹細胞の維持･増殖を支持する役割を持つ細胞ではないかと思われる｡18ケ月間培養し た浮遊細胞から単離した1個のCD133陽性細胞から得られたクローンは非常に高い自己複製能を持つこと から,腫瘍幹細胞を濃縮することが可能であり,長期間培養しても腫瘍幹細胞としての特性を維持してい ることが示唆された｡ 【結論】 我々が樹立した脳腫瘍幹細胞は腫瘍幹細胞としての特性,つまり自己複製能,多分化能そして患者と同 様の二次腫瘍を作り出す腫瘍形成能を持ち合わせていることがわかった｡この脳腫瘍幹細胞株を標的に試 験管内で薬剤や放射線の効果を調べることにより,抗がん治療の副作用を軽減するテーラーメイド治療が 可能になると考えられる｡ 論文審査の結果の要旨 申請者 稲垣亮仁は,日本で初となる患者個人からの脳腫瘍幹細胞株の樹立,性状決定の研究に携わり, 腫瘍幹細胞が試験管内でその性質を保持したまま長期間維持できることを示した｡この成果は,今後の脳 腫瘍研究に貢献し,脳腫瘍のテーラーメイド治療の開発につながると考えられる｡ [主論文公表誌] Long-term
maintenance of brain tumor stem cellproperties under at non-adherent and adherent culture conditions
Biochemicaland BiophysicalResearch Communications 361,586-592(2007).
