窒素代謝上のglutamate dehydrogenaseの機能

(1)

窒素代謝上のglutamate dehydrogenaseの機能

その他のタイトル The function of glutamate dehydrogenase on nitrogen metabolism

著者福留祥子

雑誌名関西大学社会学部紀要

巻 11

号 1

ページ 115‑119

発行年 1979‑11‑30

URL http://hdl.handle.net/10112/00022899

(2)

窒素代謝上の

g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e

の機能

福留

祥子

r a t l i v e rでは glutamatedehydrogenaseは窒素代謝の中心的存在である D

。この酵素は

d e a ‑ minationの方向へは ureac y c l eの carbamoylephosphate合成に必要な NHa

を生成し，反対方向へは種々の

deaminase

によって生ずる

NHa

から

g l u t a m a t e

を合成する。この反応は遊離アンモニアと

amino a c i d

の

a

ーアミノ基とを結ぶ経路であり窒素代謝上最も重要な反応である。

g l u t a m a t e dehydrogenase

は

mitochondriaの matrix

に局在し，

i s o l a t e d mitochondriaに g l u t a m a t e

を添加すると，

glutamateは transaminase経路で代謝され， deaminate

されるも

のはほとんどない2)3)。

i n t r a m i t o c h o n d r i a l g l u t a m a t e dehydrogenase

はよく

NADP+

と反応し，

deamination

の方向へのその活性は

e n e r g y ‑ l i n k e dtranshydrogenase

の作動によって

mitochondria

内に存在する高い濃度の

NADPH

でコソトロールされていると云われている

4)

0

bovine l i v e rの精製 g l u t a m a t edehydrogenase

は

ADPで活性化し， GDP,GTP

で阻害されるo分子量は

350000

で

6

個のサプユニットから成り，各ユニットは基質，

n i c o t i n a m i d e ,purine n u c l e o t i d e

との結合部位を持っ。高濃度で会合し，この会合は

ADP

との結合によって生じ，

GDP, GTP

との結合によって阻害される。

glutamate dehydrogenase

の活性化，およびその

阻害は~'‑‑の

a g g r e g a t 1

.

0 n ‑1 d " s a g g r e g a t 1 0 nに起因すると云われている 5)

。しかしながら，

r a tl i v e r

の

glutamatedehydrogenaseは bovine l i v e r

のそれとよく似たかたちで

purine n u c l e o t i d e

の影響を受けるが丸その生理的な意味合いは明確ではない。

glutamate dehydrogenaseに対する amino a c i d

の影響はよく検討されている7)8)9)。殊に，

L ‑ l e u c i n e

のこの酵素に及ぼす影響は重要であり

1 0 ) '

両者の複合体の形成についても報告されて

1 ) C h a l a m a u n , R . A. F . M. & T a g e r , J . H . ( 1 9 7 0 ) B i o c h ! m . B i o p h s . A c t a 2 2 2 , 1 1 9 ‑ 1 3 4 .

2 ) B o r s t , P . ( 1 9 6 2 ) B i o c h i m . B i o p h s . A c t a 5 7 , 2 5 6 ‑ 2 6 9 .

3 ) De H a a n , E . J . , T a g e r , J . M. & S t a t e r , E . C . ( 1 9 6 7 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 3 1 , 1 — 13.

4 ) P a p a , S . , T a g e r , J . M . , F r a n c a v i l l a , A . , De H a a n , E . J . & Q u a g l i a r i e l l o , E . ( 1 9 6 7 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 2 1 , 1 4 ‑ 2 8 .

5 ) F r i e d e n , C . ( 1 9 7 1 ) Ann. R e v . B i o c h e m . 4 0 , 6 6 6 ‑ ‑ ‑ 6 9 6 . 6 ) F r i e d e n , C . ( 1 9 7 0 ) J . B i o l . c h e m . 2 4 5 , 4 3 9 1 ‑ ‑ 4 3 9 6 .

7 ) Y i e l d i n g , K. L . & T o m k i n s , G . M. ( 1 9 6 1 ) P r o c . N a t . A c a d . S c i . U . S . 4 7 , 9 8 3 ‑ 9 9 0 .

8 ) M c G i v a n , J . D . , B r a d f o r d , N . M . , C r o m p t o n , M. & C h a p p e l l , J . B . ( 1 9 7 3 ) B i o c h e m . J . 1 3 4 , 209‑

2 1 5 .

9 ) M e n d e s ‑ M o u r a o , J . , M c G i v a n , J . D . & C h a p p e l l , J . B . ( 1 9 7 5 ) B i o c h e m . J . 1 4 9 , 4 5 7 ‑ 4 6 4 .

1 0 ) K u n , E . & A c h m a t o w i c z , B . ( 1 9 6 5 ) J . B i o l . Chem. 2 4 0 , 2 6 1 9 ‑ 2 6 2 7 .

(3)

関西大学『社会学部紀要』第

1 1

巻第

1

号

T a b l e

1.

S p e c i f i c i t y o . f a c t i v a t i o n

o . f g l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e

的

a m i n o a d d s i n i s o l a t e d m i t o c h o n d ‑ r i a From

8

R a t e o f NAD(P)H Amino a c i d a d d e d mitl•tinn < , , m o l / m i n )

NODO 0 . 0 5 8 1 . ‑ l e n r i o o 0 . 8 1 3 L‑

励

I A l l f i

血

0 . 4 5 0 1 . ‑ V a l i n e 0 . 1 5 ゜

1.-M~thioni而 0.070

L ‑ l i < .

四

0 . 0 5 0

L-Al•n加 0.063

1 . ‑ R i w t i t l i l f f l 0 . 0 6 3

いる

11)12) 。

各種

amino a c i dの中で l e u c i n e , i s o l e u c i n e , v a l i n e

は

g l u t a m a t edehydrogenaseの活性化に影響を与える。

特に

l e u c i n e

の影響は顕著である。このデークは

i s o l a t e d m i t o c h o n d r i a

を使用しているが，精製

g l u t a m a t edehyd‑

r o g e n a s e

では

h i s t i d i n e , m e t h i o n i n e

による活性化が報告されている

7)13)

。このデークでは

h i s t i d i n e ,m e t h i o n i n e

による活性化は認められず，故にこれらは

i n t r a m i t o c h o n d r i a lenzyme

を活性化しないと云える。

l e u c i n eが i n t r a m i t o c h o n d r i a lenzyme

を活性化するには

m i t o c h o n d r i aの m a t r i xs p a c eに

侵透しなければならない。

Mcgivan等は L‑

〔

1 ‑ 1 4 C J l e n c i n e

を使用し実験した結果，その侵透は速やかに行われると報告している

8)

。し力し

、, l e u c i n e ‑ t r a n s p o r t m g system

の存在につい

ては未だ不明確である。

NHaは i s o l a t e dI i v e r m i t o c h o n d r i aで 2

方向へ代謝される。

1

つは

g l u t a m a t e

合成の方向であり，他は

c i t r u l l i n e合成の方向である。

C y t o s a l

訓血

o n d r t o n

, I I I I I I J

‑ ︶

‑

︱

一竺ぷ一一

—+

‑ M P

‑

﹁

x ‑

一匹︱

一ーニ︱

L19

ヽ

119,'﹄

I G l 1 1 l a l l l ! I I R ‑ O H 11~! 即細 I I

わ呵

l 曲直匹 l a t ea u l 恥直 r

m ^O ^I 1 1 1 U 1 f 1 1 1 1 I r a n 岬 t i n g s y 曲 m I V C l t r u l l f n e l r a n s p o r l l 呵呻m

S c h e m e 1 . C o m p a r t m e n t a t i o n

of

n i t r o g e n m e t a b o l i s m i n l i v e r . From 9

F i g . 1

は

2‑ o x o g l u t a r a t e , NH8源として NH4Cl

を用い，

g l u t a m a t e

合成に及ぼす

l e u c i n e

の影響を表している。

l e u c i n e

の存在は

g l u t a m a t edehydrogenase

を活性化し，結果として

g l u t a m a t eの急速な合成を行う。

o r n i t h i n e , b i o c a r b o n a t eの存在の下で， NH4Clは carbamoylp h o s p h a t e

に代謝され，続い

1 1 ) P r o u g h ,

R.

A . & F i s h e r , H . F . ( 1 9 7 2 ) B i o c h e m i s t r y 1 1 , 2 4 7 9 ‑ 2 4 8 2 .

1 2 ) P r o u g h ,

R. A

. , C u l v e r , J . M. & F i s h e r , H . F . ( 1 9 7 2 ) A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 4 9 , 4 1 4 ‑ 4 1 8 .

1 3 ) Y a m a g u c h i , T . ( 1 9 7 1 ) B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 2 切， 2 4 1 ‑ 2 4 7 .

(4)

o . ,

4 2 0 0

︵百

/ 1 o w

" )

p o 日

5 J S e g ‑ n I O

゜

O . S I

ぢ

四

C I J ( m M )

F i g . 1 . Formation of glutamate from NH8+2‑oxoglutarate. From

8

The r e a c t i o n w a s s t a r t e d by a d d i t i o n o f m i 而 h o n d r i a ( S . S m g o f p r o t e i n / m l ) t o a m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 1 M ‑ KC, 0 . 0 2 M ‑ T r i s ‑ H C , l O D I M ‑ p y r u v a t e , S m M ‑ 2 ‑ D x o ‑

血

t a r a t e ,l O m M ‑ p h o s p h a t e , l m M ‑ m a l a t e a o d v a r i o u s m n n ‑ n t r a t i o n s o r NH 、

a

a t pH 7 . 3 a o d 2 5 ° C . Tho I F . f i c t i o n w a s ‑ t e r m i n a 吋 a f t e r 3 m i n . F n r m a t i n n of a s p a r t a 鯰 w a s

n叫i前,,~ ^●,

S m M ‑ T

門

1 r i n " ;o , no

佃 l f i l l f ' t

1 . 5 1 . 0

〇．

0 5 B

8

; ; o o 6 d D D

宮︳百g

百g

目

DJ

O I I J O I U I P J O O l " l l

D . 5 I . D

四

OJ(IDM)

t‑‑‑

．

g

I I 5 , 0

F i g . 2 . C i t r u l l i n e s y n t h e s i s from added NH,a. From 8

Thenw; 血 nm e d i u m c o n t a i n e d 0 , 0 8 M ‑ K C I , 0 . 0 2 M ‑ T r i s ‑ H C I , S

皿

1 ‑ s u c c i n a t e , 3mM•ATP, 0 . 0 2 M ・ KHCO,, 1 0 1 1 1 1 1 ‑ p b o s p h a t e , l O m ' ‑ 1 ‑ < > m i t h i n e ‑ H O and 四 DUS c o n c e n t r a t i o n s o f

NH.Cl

a t p H 7 . 3 a n d 2 5 ° C . M i t f f l ' b o n d r i a ( 4 . 5 噸 m l ) w e r e a d d e d a n d c : l t r u l l i n e f o r m a t i o n w a s a s s a y e d a f t u r 4 , 8 a n d 1 2 m i n .

●,

5 m M ‑ T

病

n i n e ; o , no l e u c i n e .

て

citrulline

となる。

Fig.

2はこの

citrulline

合成に及ぼす

leucine

の影響をテストしたものであるが，

leucine

の存在は

citrulline

合成に影響しないことが判る。

Table 2 .

蹄

e c tof l e u c i n e on t h e me

比紐

i c fate

が

NH,a The i n c u b a t i o n c o n t a i n e d 0 . 0 8 M ‑ K C I , 0 . 0 2 M ‑ T r i s ‑ H C I , 5 m M ‑ 2 ‑ o x o g l u t a r a t e , lOmM‑phosphate, 3mM‑ATP, lOmM‑pyruvate, lmM‑malate, 15mM‑KHCO

む

l O m M ‑ o r n i t h i n e ‑ H C l , 1.6mM‑NH4Cl and 5.2mg

of

m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n / m l a t pH 7 . 3 and 2 5 ° C . I n some experiments 5mM‑leucine was a

函

p r e s e n t . The v a l u e s shown a r e c o r r e c t e d f o r t h e s m a l l amounts o f m e t a b o l i t e s formed i n t h e a b s e n c e o f added N

比

C l . A s s a y s were performed i n dup‑

l i c a t e . From

8

Time(min) 4 1 2 8

4 1 2

8

A r i r i i f i o n , None None None Tm

而

n e

'"''函

l < ' n r i n f l

笠匹碑

gg

一日

il

皿 g

19 m5 67 18 1 00 0o oo 00 00

一

G l u

F o r m a t i o n o f m e t a b o l i t e s ( p m o l / m l ) C i l n i l l i n e

！

A s p a r t a t e 』

0 . 0 6 0 . 1 2 0 . 1 5 0 . 1 3 0 . 2 6 0 . 4 7

ornithine, biocarbonate,

2

‑oxoglutarate, pyruvate

の存在の下で，

mitochondria

は

NH4Cl Table

2はこのシステムでの

NH4Cl

を

citrulline

合成と

glutamate

合成の両方向へ代謝する。

の代謝的運命を示したものである。

leucine

が存在しない場合，

glutamate, citrulline

はほゞ同量生成される。

leucine

が存在する場合，

方，

citrulline

合成は阻害されている。

glutamate (plus aspartate)

合成が多くなり，一

citrulline

合成と

glutamate

合成の間で

NH4Cl

に対する競合が行われるわけであるが，

ということが判る。

leucine

の存在によって

citrulline

合成が強く阻害される

以上の結果は

isolatedmitochondria

で認められたものであるが，

とが云えるかどうかは次のデークで判る。

whole cell

でも同様のこ

C, N

源として

alanine

を使用している。

alanine

から消失した

amino N

は

leucine

が存

‑117‑

(5)

関西大学『社会学部紀要』第

1 1

巻第

1

号

T a b l e 3 . L ‑ A l a n i n e u t i l i z a t i o n by i s o l a t e d r a t l i v e r c e l l s

The r e a c t i o n was s t a r t e d by t h e a d d i t i o n o f a l a n i n e (lOmM f i n a l c o n c n . ) ( ' A l a ' ) o r a l a n i n e (lOmM) t o g e t h e r w i t h l e u c i n e (5mM)

、(

A l a + L e u ' ) . S a m p l e s w e r e t a k e n a t 0 , 2 0 , 4 0 a n d 6 0 min a n d a s s a y e d f o r t h e m e t a ‑ b o l i t e s . The r e s u l t s shown a r e t h o s e o b t a i n e d f r o m p r o g r e s s c u r v e s , a n d t h e c a r b o n b a l a n c e s w e r e c a l c u l a t e d on t h e a s s u m p t i o n t h a t two m o l e c u l e s o f a l a n i n e w e r e r e q u i r e d f o r t h e s y n t h e s i s o f o n e m o l e c u l e o f g l u c o s e , g l u t a m a t e o r g l u t a m i n e ( K r e b s e t a l . , 1 9 7 3 ) . D i f f e r e n c e s i n t h e v a l u e s o f c o n c e n t r a t i o n s o f m e t a b o l i t e s l e s s t h a n 1 0 nmol/mg o f p r o t e i n a r e n o t s i g n i f i c a n t . The r e s u l t s shown a r e t h o s e o b t a i n e d by u s i n g a s i n g l e b a t c h o f c e l l s . S i m i l a r r e s u l t s w e r e c o n s i s t e n t l y o b t a i n e d i n s e v e r a l e x p e r i m e n t s o f t h i s t y p e . From 9

M e t a b o l i t e a s s 町 e d(nmol/ms q f p r o t e i n )

A

皿血,

Ammnni• A s p a r t a t e G I

匹0$8

G l a t a m a t o G l u t a m i n e L a c t a t e P y r u v a t e U r e a . . . .

.

..

. . . . .

.

. . . . .

·•

. .

'Ala+'Ala+

、

Ala+'Ala

十

'Ala+'Ala+'Ala+'Ala+ Ala+

'Ala'Leu''Als'Leu''Ala'Leu'

、

Ala'Leu''Ala'Leu''Ala'Leu'

、

Ala'Leu''Ala'Leu''Ala L e u ' Amount i n i t i a l l y

<"h•nfl" a f t e r 6 0 m l n

O•n野 in

Natoma n.,nw i n C . u n i t s

2 2 1 6 2 1 7 6 9 3 9 3 8 8 6 6 1 6 1 6 2 3 6 S 6 5 S 4 2 1

一

7 3 8‑ 7 2 6

十

2 9 + 9 + 6

十

3 + 2 3 4 + 1 6 1 + 7 2 + 1 4 6 + 1 1 4 + 1 9 9 + a 6 + s 2 o + 1 + ! 8 3 + s o

‑ 7 3 8 ‑ 7 2 6 + 四十 + 6

十

3 -— ⁺⁷² ⁺ ¹ ⁴ ⁶ ⁺ ² ² ⁸ ⁺ ³ ⁸ ⁹ ‑ ‑ ‑ ‑ + 3 6 6 i , o o

―

7 3 8 ‑ 7 2 6 ‑ ‑ +6 + 3 + 碑 + 3 2 2 + 1 4 4 + 2 9 2 + 2 2 8 + 3 9 8 + 8 6 十立

0

+ I ・ ‑ , ‑

在するか否かにかかわらず

glutamate,glutamine, urea

に出現する。又，

leucine

の存在下，

gluconeogenesis

が一部阻害を受けるが，

glutamate, glutamine

合成へ

carbon

の流れが増加している。又，

leucine

の存在が

urea

合成を阻害しているということは，やはり，

i s o l a t e d mitochondria

で

leucine

の存在が

c i t r u l l i n e

合成を阻害して

glutamate

合成を増加させる事

実と一致する。

leucine

が

glutamate,glutamine

合成の為の

N,C

を供給するということは

r a t l i v e r

において

leucine‑2 ‑oxoglutarate aminotransferase

の活性が非常に低いので考えられない

1 5 ) 1 6 )

0

より直接的なデークは〔

1 4 C J leucine

を使用して行った結果から全く

leucine

は

N, C

を供給しないことが判明している

1 4 )

。故に，

leucine

はその

metabolic degradetion

を示さない方法でその効果を発揮するということであらねばならない。

Table

3のデークでは

endogenouss u b s t r a t e

の影響は明らかではなく，従って

leucine

の添加は

glutamine,glutamate

合成の増加と

u r e a ,glucose

生成の減少を結果したが，これは

alanine catabolism

の伸展を現すものかどうかは判らない。

Mendes‑Mourao

等はこの点につその生成物の

r a d i o a c t i v i t y

の分布を追跡し，

いて〔

u‑1

℃〕

alanine

と

l i v e rc e l l

を反応させ，

leucine

は

1 4 C

の

glucose

と

l a c t a t e

への

incorporation

の減少と，

glucose

と

glutamate

へのその増加を引き起すということを立証している

1 4 )

。このよつな

leucine

の影響は単に

alanine

のみに示されるのではなく他の

Aminoacid

にも認められ，すなわち，

leucine

の作用部位は

alanine metabolism

にのみ特異的であるのではない

1 4 > ,

に一般的な効果を有すると云える。

つまり，

leucine

は

N

代謝

glutamate dehydrogenase

は

carbamoylphosphate

合成の為の

NH3

の生成を結果し，

urea

分子の

2

つの

N

の中の

1

つはこの経路から来るものと見なされている1)。この酵素が

inv i r o

で

1 4 ) 1 5 ) 1 6 ) 1 7 )

M e n d e s ‑ M o u r i l o , J . , McGivan, J . D. & C h a p p e l l , J . B . ( 1 9 7 4 ) B i o c h e m . J . , i n t h e p r e s s . Awapara, J . & S e a l e , B . ( 1 9 5 2 ) J . B i o l . Chem. 1 9 4 , 4 9 7 ‑ 5 0 2 .

I c h i h a r a , A. & Koyama, E . ( 1 9 6 6 ) J . B i o c h e m . 5 9 , 1 6 0 ‑ 1 6 9 .

W i l l i a m s o n , D. H . , L u n d , P . A. & K r e b s , H.

A. (

1 9 6 7 ) B i o c h e m . l 1 0 3 , 5 1 4 ‑ 5 2 7 .

‑118‑

(6)

窒素代謝上の

g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e

の機能（福留）

a c t i v e

であるので触媒する反応は

"thermodynamic e q u i l l i b r i u m " ,

あるいはそれに近いと報告されている

1 7 )

。この観点が正しいとするならば

g l u t a m a t edehydrogenaseは r a t e ‑ l i m i t i n gで

あり得ないということになる。しかし，上記したデータより明らかに

g l u t a m a t edehydrogenase

の

a c t i v a t o rである l e u c i n eが g l u t a m a t e( g l u t a m i n e )合成を増加させ, u r e a

の生成を阻害するので

i s o l a t e dm i t o c h o n d r i a , i s o l a t e d I i v e r c e l lでは g l u t a m a t edehydrogenase

の反応は

e q u i l l i b r u mではないということになる。

N . M. Bradford

は

g l u t a m a t e

の

m i t o c h o n d r i amenbrane

を通過する速度は

malate

や

phosphate

に比して非常に遅いと報告している。この事実や上記したデータより

glutamate deamination

は根本的に

mitochondriaの matrixspaceへの g l u t a m a t et r a n s p o r t e

にコント

ロールされ得るということを示している。

g l u t a m a t e合成が l e u c i n e

により顕著に増加するので

g l u t a m a t edehydrogenaseの主たる機能は g l u t a m a t edeamination

よりもむしろ

g l u t a m a t e

合成にあると云える。

NHaは l i v e rc e l lでは持続的に cytoplasmにおいて s e r i n ed e h y d r a t a s e , t h r e o n i n e d e h y ‑ d r a t a s e , a d e n y l a t e deaminase

などにより生成される。この

NH3は ureaの形で排泄されるか，

もしくは次の

aminoa c i d合成の為の glutamate( g l u t a m i n e )

として貯蔵される。

l i v e r c e l l

の

mitochondria

中の

l e u c i n e濃度がこの NHa

が排泄されるか貯蔵されるかを決定する因子であり得る。

一方，

urea合成の為の NH3生成に関していえば， p r i n e n u c l e o t i d e c y c l e

から生じる

NH3量を考慮することが出来る。 Tornheim等によれば IMP

と

a s p a r t a t eから生じる AMP

の

deamination

は

37

℃で

3n mol o f NH3/min p e r mg o f c y t o s o l p r o t e i n

となり，これは

l i v e r wet wtに換算すると 0.35μmolo f NH3/min p e r g wet wt o f l i v e r

となる

20)

。これに対して，

g l u t a m a t eからの NH3量は 0.08μmol/minper g wet wt o f l i v e rである 18)

。g

l u t a ‑ mate

より生成される

NH3量は purinen u c l e o t i d e c y c l e .

より生成される

NH3

量をかなり下廻るということになる。つまり，

carbamoylephosphate合成に要する NHaは purinen u c l e o ‑ t i d e c y c l eより容易に補給され得ると考えられる。

このような点からも，

gutamate dehydro‑

genaseは ammoniogenesis

には余り重要な位置を占めていないと思われる。

l e u c i n eは e s s e n t i a lamino a c i d

であり，食餌摂取量により

plasma中のその濃度が決る ²¹⁾

。

i s o l a t e d m i t o c h o n d r i a , i s o l a t e d l i v e r c e l lで認められた結果が i nv i v oでの状況を反映したも

のであるならば，

N

が

glutamine

として貯蔵されるか，あるいは，

u r e a

として排泄されるかは細胞内の

l e u c i n eの濃度に左右されるところが多いと云うことになる。

1 8 ) K r e b s , H . A . & V e e c h ,

R.

L . ( 1 9 6 9 ) i n The E n e r g y L e v e l a n d M e t a b o l i c C o n t r o l i n M i t o c h o ‑ n d r i a . 3 2 9 ‑ 3 8 2 , A d r i a t i c a E d i t r i c e , B a r i .

1 9 ) B r o s n a n , J . T . , K r e b s , H . A . & W i l l i a m s o n , D . H . ( 1 9 7 0 ) B i o c h e m , J . 1 1 7 , 9 1 ‑ 9 6 . 2 0 ) T o r n h e i m , K . & L o w e n s t e i n , J . M. ( 1 9 7 2 ) J . B i o l . Chem. 2 4 7 , 1 6 2 ‑ 1 6 9 .

2 1 ) F e r n s t r o m , J . D . , L a r i n , F . & Wurtman,

R.