低酸素曝露による⾎管バリアの破綻に関する 細胞⽣物学的研究

低酸素曝露による⾎管バリアの破綻に関する 細胞⽣物学的研究

い な だ ま こ と

稲⽥ 真

（眼科学専攻）

防衛医科⼤学校

令和２年度

⽬ 次

第 １ 章 背 景 と ⽬ 的

1.1 は じ め に 1 ⾴

1.2 脳 と 網 膜 に お け る 組 織 低 酸 素 を 来 す 病 態 3 ⾴

1.3 HIF-VEGF 系 を 介 し た ⾎ 管 バ リ ア の 破 綻 4 ⾴

1.4 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に 関 す る こ れ ま で の 研 究 の 概 要 6 ⾴

1.5 本 研 究 の ⽬ 的 7 ⾴

第 ２ 章 実 験 動 物 に お け る 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 第 １ 節 イ ン ト ロ ダ ク シ ョ ン 2.1.1 ⾎ 管 バ リ ア の 構 造 と 機 能 9 ⾴

2.1.2 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 の メ カ ニ ズ ム の 概 要 12 ⾴

2.1.3 低 酸 素 に よ る ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化 13 ⾴

2.1.4 マ ウ ス 網 膜 の 構 造 13 ⾴

2.1.5 本 章 の ⽬ 的 14 ⾴

第 ２ 節 材 料 と ⽅ 法 2.2.1 実 験 動 物 15 ⾴

2.2.2 低 酸 素 曝 露 16 ⾴

2.2.3 エ バ ン ス ブ ル ー ⾊ 素 漏 出 実 験 16 ⾴

2.2.4 遺 伝 ⼦ の 発 現 解 析 18 ⾴

2.2.5 ヘ マ ト キ シ リ ン /エ オ ジ ン 染 ⾊ 18 ⾴

2.2.6 パ ラ フ ィ ン 切 ⽚ の 免 疫 組 織 化 学 染 ⾊ 18 ⾴

2.2.7 網 膜 伸 展 標 本 の 免 疫 組 織 化 学 染 ⾊ 19 ⾴

2.2.8 透 過 型 電 ⼦ 顕 微 鏡 観 察 と ラ ン タ ン ト レ ー サ ー 実 験 19 ⾴

2.2.9 眼 底 の 観 察 20 ⾴

2.2.10 Iba-1 陽 性 細 胞（ ミ ク ロ グ リ ア ）の 数 の 測 定 20 ⾴

2.2.11 統 計 解 析 20 ⾴

第 ３ 節 結 果

2.3.1 低 酸 素 に よ る 脳 ⾎ 管 バ リ ア の 機 能 低 下 21 ⾴

2.3.2 低 酸 素 に よ る 脳 の 病 理 変 化 21 ⾴

2.3.3 低 酸 素 に よ る 網 膜 の 病 理 変 化 22 ⾴

2.3.4 低 酸 素 に よ る 網 膜 ⾎ 管 バ リ ア の 機 能 低 下 23 ⾴

2.3.5 低 酸 素 に よ る 網 膜 ⾎ 管 バ リ ア の 各 層 で の 変 化 24 ⾴

2.3.6 低 酸 素 に よ る ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化 25 ⾴

2.3.7 ミ ク ロ グ リ ア 減 少 マ ウ ス を ⽤ い た 実 験 26 ⾴

第 ４ 節 考 察 28 ⾴

第 ３ 章 脳 ⾎ 管 内 ⽪ 細 胞 に お け る 低 酸 素 性 タ イ ト ジ ャ ン ク シ ョ ン 破 綻 第 １ 節 イ ン ト ロ ダ ク シ ョ ン 3.1.1 タ イ ト ジ ャ ン ク シ ョ ン（ TJ）構 造 34 ⾴

3.1.2 低 酸 素 に よ る TJ 破 綻 35 ⾴

3.1.3 本 章 の ⽬ 的 38 ⾴

第 ２ 節 材 料 と ⽅ 法 3.2.1 細 胞 の 単 培 養 40 ⾴

3.2.2 バ リ ア 細 胞 シ ー ト の 作 成 41 ⾴

3.2.3 BV2 と の 共 培 養 41 ⾴

3.2.4 バ リ ア 機 能 評 価 41 ⾴

3.2.5 LDH 測 定 42 ⾴

3.2.6 低 酸 素 培 養 42 ⾴

3.2.7 免 疫 細 胞 化 学 染 ⾊（ ICC） 42 ⾴

3.2.8 遺 伝 ⼦ の 発 現 解 析 43 ⾴

3.2.9 IL-1β の 培 地 へ の 添 加 44 ⾴

3.2.10 ELISA（ enzyme-linked immunosorbent assay） 44 ⾴

3.2.11 統 計 解 析 44 ⾴ 第 ３ 節 結 果

3.3.1 bEnd.3 単 層 細 胞 シ ー ト の 観 察 45 ⾴

3.3.2 bEnd.3 単 層 細 胞 シ ー ト の BV2 と の 共 培 養 46 ⾴

3.3.3 bEnd.3 単 層 細 胞 シ ー ト 培 養 液 へ の IL-1β 添 加 の 影 響 47 ⾴

3.3.4 バ リ ア 細 胞 シ ー ト の 作 成 48 ⾴

3.3.5 バ リ ア 細 胞 シ ー ト の BV2 共 培 養 お よ び IL-1β 添 加 49 ⾴

3.3.6 QMMuC-1 に よ る VEGF 産 ⽣ 50 ⾴

第 ４ 節 考 察 52 ⾴

第 ４ 章 ま と め 4.1 研 究 成 果 の ま と め 56 ⾴

4.2 本 研 究 に よ る 貢 献 67 ⾴

4.3 研 究 の 限 界 と 今 後 の 課 題 58 ⾴

謝 辞 60 ⾴

略 語 61 ⾴

引 ⽤ ⽂ 献 63 ⾴

図 表 85 ⾴

第 1 章 背景と⽬的

1.1 は じ め に

本 稿 に お い て は 、 以 下 の 通 り ⽤ 語 を 定 義 す る 。

低 酸 素 空 気 /低 酸 素 環 境 ： 酸 素 濃 度 が 18%以 下 の 空 気 /環 境 低 酸 素 曝 露 ： 低 酸 素 空 気 /環 境 へ の 曝 露

組 織 低 酸 素 ： 特 定 の 器 官 ま た は そ の 局 所 に お い て 酸 素 消 費 が 酸 素 供 給 を 上 回 っ た 状 態

低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 ： 組 織 低 酸 素 状 態 に お け る ⾎ 管 バ リ ア の 破 綻

⾎ 管 バ リ ア ： ⾎ 液 脳 関 ⾨ お よ び ⾎ 液 網 膜 関 ⾨

ヒ ト は 呼 吸 活 動 に よ り ⼤ 気 中 か ら 酸 素 を 取 り 込 む こ と に よ っ て ⽣ 命 活 動 を 維 持 し て い る 。脳 は ⽣ 命 活 動 の 中 ⼼ を 担 う 器 官 で あ る が 、⼤ 気 中 か ら ⾎ 液 中 に 取 り 込 ま れ た 酸 素 の う ち 約 20〜 25%を 消 費 し て お り 、 酸 素 の 不 ⾜ に よ り 最 も 重 篤 な 障 害 を 受 け る 器 官 の １ つ と し て も 知 ら れ て い る (1, 2)。 脳 が 組 織 低 酸 素 状 態 に ⾄ る 原 因 と し て 、 低 酸 素 空 気 へ の 曝 露 に よ る 酸 素 ⽋ 乏 症 が 考 え ら れ る 。 臨 床 的 に は 酸 素 ⽋ 乏 症 は 穀 物 倉 庫 や 汚 ⽔ タ ン ク 等 の 閉 所 で の 作 業 に 伴 っ て 発 症 す る こ と が 多 い が 、 こ の 他 に も 与 圧 機 能 を 有 さ な い 航 空 機 へ の 搭 乗 や ⾼ 所 地 域 で の 滞 在 な ど に よ っ て も そ れ ぞ れ 特 有 の 酸 素 ⽋ 乏 症 状 が ⽣ じ る 。 ⾃ 衛 隊 に は 多 く の 職 種 が 有 る が 、そ の 中 に は 燃 料 や 混 合 ガ ス 製 造 に 関 わ る も の 、艦 内 作 業 の よ う な 閉 所 で ⾏ わ れ る も の 、 ⼭ 岳 救 助 や 航 空 機 搭 乗 な ど 低 酸 素 曝 露 が 前 提 と な っ て い る も の な ど が あ り 、 ⼀ 般 ⼈ と ⽐ し て 低 酸 素 環 境 に 曝 露 さ れ る 可 能 性 が ⾼ い 。し か し な が ら 、こ れ ま で ⾃ 衛 隊 衛 ⽣ に お い て 低 酸 素 曝 露 の 職 務 遂 ⾏ へ の 影 響 が 着 ⽬ さ れ る こ と は 少 な か っ た 。 な か で も

⾼ 所 地 域 で の 部 隊 活 動 は 航 空 機 搭 乗 以 上 の ⻑ 時 間 の 低 酸 素 曝 露 が 予 想

さ れ る に も 関 わ ら ず 、⾼ ⼭ 病 予 防 に 着 ⽬ し た 研 究 は 皆 無 で あ る 。筆 者 は 2015 年 に ⾃ 衛 隊 医 官 と し て 初 め て 国 際 認 定 ⼭ 岳 医 (DiMM; Diploma in Mountain Medicine)資 格 を 取 得 し た こ と も あ り 、 こ の 分 野 に 焦 点 を 当 て た 研 究 を 進 め て い き た い と 考 え て い る (3)。

さ て 、脳 が 組 織 低 酸 素 状 態 に 陥 る 原 因 は 低 酸 素 曝 露 だ け で は な い 。⼼

肺 機 能 の 著 し い 低 下 に よ っ て も 脳 は 組 織 低 酸 素 状 態 に 陥 り 、 脳 浮 腫 な ど を 発 症 す る 。さ ら に 、脳 は 、脳 梗 塞 や 脳 外 傷 な ど の 疾 患 に お い て も ２ 次 的 な 組 織 低 酸 素 状 態 を ⽣ じ る 。ま た 、組 織 低 酸 素 が 問 題 と な る の は 脳 だ け で は な い 。網 膜 は ⽣ 体 で 最 も 酸 素 消 費 が 盛 ん な 器 官 で あ り 、重 量 当 た り の 酸 素 消 費 量 は 脳 の ４ 倍 に も な る と ⾔ わ れ て い る た め (4-6)、 他 器 官 と ⽐ 較 し て 容 易 に 組 織 低 酸 素 状 態 に ⾄ る 。 網 膜 は 発 ⽣ 学 的 に 脳 の ⼀ 部 と 捉 え る こ と が で き 、脳 と 同 様 、組 織 低 酸 素 は 神 経 伝 達 機 能 の 維 持 に 重 ⼤ な 影 響 を 与 え る こ と が 知 ら れ て い る 。

以 上 の よ う に 組 織 低 酸 素 状 態 が ⽣ じ る 原 因 は 様 々 だ が 、 組 織 低 酸 素 状 態 に 陥 っ た 脳 や 網 膜 で は ⾎ 管 バ リ ア が 破 綻 し 、 組 織 浮 腫 を ⽣ じ る こ と は 共 通 し て い る (7-9)。 脳 や 網 膜 に お け る 浮 腫 は ⽣ 命 予 後 を 脅 か し 、 ま た ⽣ 活 の 質（ QOL; quality of life）を 著 し く 低 下 さ せ る 重 ⼤ な 要 因 と な る た め 、 我 々 は 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に 着 ⽬ し た 。

低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 の 発 症 機 序 と し て 、低 酸 素 誘 導 性 因 ⼦（ HIF;

hypoxia-inducible factor）を 介 し た 炎 症 プ ロ セ ス の 活 性 化 が 知 ら れ て い る が (10)、そ の 際 の ⾎ 管 バ リ ア を 構 成 す る 各 細 胞 に お け る 細 胞 ⽣ 物 学 的 な 動 態 に つ い て の 知 ⾒ は 乏 し い 。 こ れ ま で に 脳 お よ び 網 膜 に お け る 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 の メ カ ニ ズ ム 解 明 の た め に 様 々 な 実 験 モ デ ル 動 物 が 確 ⽴ さ れ て き た (11)。し か し 、そ の ほ と ん ど が 組 織 損 傷 や ⾎ 管 病 変 に 付 随 す る 特 定 の 疾 患 に 着 ⽬ し た 実 験 モ デ ル 動 物 で あ っ た 。実 際 に は 、 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 は 酸 素 ⽋ 乏 症 や ⾼ ⼭ 病 を 含 め た 多 く の 疾 患 に 共 通 し た 基 本 的 病 態 で あ る に も 関 わ ら ず 、 正 常 ⾎ 管 に お け る 低 酸 素 曝 露 に よ る ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に 関 す る 報 告 は 少 な い 。そ こ で 我 々 は 、低 酸 素 に 曝 露 し た 実 験 動 物 の 脳 お よ び 網 膜 を 詳 細 に 観 察 す る こ と 、 ま た ⾎ 管 バ リ ア の 構 成 細 胞 を 低 酸 素 環 境 で 培 養 し 解 析 す る こ と に よ り 、 未 だ 明

ら か で は な い 神 経 組 織 に お け る 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 の メ カ ニ ズ ム の ⼀ 端 を 明 ら か に す る こ と を ⽬ 指 し 研 究 に 取 り 組 ん だ 。 こ れ に よ り 本 研 究 が 低 酸 素 関 連 疾 患 に 関 す る 基 礎 的 理 解 の 深 化 に 貢 献 す る と 共 に 、

⾃ 衛 隊 衛 ⽣ の 向 上 の ⼀ 助 と な る こ と を 願 っ て い る 。

1.2 脳 と 網 膜 に お け る 組 織 低 酸 素 を 来 す 病 態

脳 と 網 膜 は ⼈ 体 の う ち で 最 も 代 謝 が 活 発 な 組 織 で あ り 、 多 く の エ ネ ル ギ ー を 必 要 と す る (4-6)。 こ れ ら の 組 織 で は 酸 素 供 給 不 ⾜ に よ る 組 織 低 酸 素 を 来 た し や す く 、 そ の よ う な 低 酸 素 状 態 の 組 織 で は ⾎ 管 バ リ ア の 破 綻 が ⽣ じ る (7-9)。

脳 や 網 膜 が 組 織 低 酸 素 に 陥 る 原 因 と し て 、 低 酸 素 曝 露 に よ る 酸 素 ⽋ 乏 症 が あ る 。 厚 ⽣ 労 働 省 に よ る と 、 平 成 21 年 か ら 平 成 30 年 ま で の 10 年 間 に お け る 酸 素 ⽋ 乏 症 に よ る 労 働 災 害 の 死 亡 率 は 63%以 上 （ 被 災 者 数 60 ⼈ 、死 亡 者 数 36 ⼈ ）で あ り 、全 労 働 災 害 に お け る 死 亡 率（ 約 1%）

と ⽐ べ る と ⾮ 常 に ⾼ い 。ま た 、⾼ ⼭ 病 の 最 も 重 篤 な 病 態 と し て ⾼ 所 脳 浮 腫（ HACE; high altitude cerebral edema）が 知 ら れ て い る 。⾼ 所 に 順 応 し て い な い ⼈ が 登 ⼭ 活 動 な ど に よ り 標 ⾼ 4000〜 5000 m に ⾄ る と 0.5〜

1%が 数 時 間 か ら 数 ⽇ の う ち に HACE を 発 症 し ⽣ 命 の 危 機 に 陥 る (12)。

低 酸 素 曝 露 以 外 に も 様 々 な 病 態 で 組 織 低 酸 素 に ⾄ る こ と が 知 ら れ て い る 。 脳 梗 塞 や 脳 出 ⾎ ま た は 網 膜 動 脈 閉 塞 症 な ど の 疾 患 で は 病 変 部 位 よ り 末 梢 の ⾎ 流 が 途 絶 え る た め 局 所 的 な 組 織 低 酸 素 状 態 に 陥 る 。ま た 、 脳 外 傷 に お い て も 損 傷 部 位 に ⽣ じ る 炎 症 が 組 織 低 酸 素 状 態 を 惹 起 す る こ と が 知 ら れ て い る 。さ ら に 、い か な る 病 態 で あ れ ⼼ 肺 停 ⽌ に よ っ て 脳 は 組 織 低 酸 素 状 態 に ⾄ り 、蘇 ⽣ に 成 功 し た と し て も 、約 7 割 は 低 酸 素 脳 症 で 死 に ⾄ る と ⾔ わ れ て い る (13)。 こ れ に 加 え 、 糖 尿 病 網 膜 症 （ DR;

diabetic retinopathy ）、 加 齢 性 ⻩ 斑 変 性 （ AMD; age-related macular degeneration）、 網 膜 静 脈 閉 塞 症 （ RVO; retinal vein occlusion） な ど 多 く の 眼 科 疾 患 で は 局 所 的 な 組 織 低 酸 素 が 病 態 形 成 の 主 要 な 原 因 と な っ て い る 。 こ れ ら の 眼 科 疾 患 に お い て 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に よ り ⻩ 斑 浮 腫 が ⽣ じ た 場 合 、中 ⼼ 視 ⼒ が 障 害 さ れ る た め QOL が 著 し く 損 な わ

れ る (14)。

こ の よ う に 、 脳 お よ び 網 膜 に お け る 組 織 低 酸 素 は 多 岐 に わ た る 疾 患 で 認 め ら れ 、 い ず れ の 疾 患 に お い て も 後 述 す る 共 通 の 低 酸 素 応 答 に よ り ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 が ⽣ じ る 。

1.3 HIF-VEGF 系 を 介 し た ⾎ 管 バ リ ア の 破 綻

細 胞 の 低 酸 素 応 答 に は HIF が 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 。 HIF は 、 肝 が ん 細 胞 株 Hep3B に お い て「 低 酸 素 依 存 的 に エ リ ス ロ ポ エ チ ン を 誘 導 す る 因 ⼦ 」と し て 1992 年 に Semenza ら に よ っ て 発 ⾒ さ れ た (15)。そ し て 1995 年 に HIF は α と β の ヘ テ ロ ⼆ 量 体 か ら な る こ と が 報 告 さ れ (16, 17)、 そ の 後 α サ ブ ユ ニ ッ ト の 種 類 に よ り HIF-1〜 3 が 同 定 さ れ た (18, 19)。 通 常 環 境 で は ⽔ 酸 化 酵 素 PHD（ prolyl hydroxylase） が HIF α の ２ ヶ 所 の プ ロ リ ン 残 基 を ⽔ 酸 化 す る 。 プ ロ リ ン 残 基 に ⽔ 酸 化 を 受 け た HIFα は pVHL（ von Hippel Lindau 遺 伝 ⼦ 産 物 ） に よ り ユ ビ キ チ ン 化 さ れ 、 プ ロ テ ア ソ ー ム で 分 解 さ れ る 。 ⼀ ⽅ 、 低 酸 素 環 境 で は PHD の 働 き が 抑 え ら れ る こ と に よ り HIFα は 安 定 化 し 、HIFβ と の ⼆ 量 体 を 形 成 す る 。 こ れ が DNA 上 の 低 酸 素 応 答 性 領 域 (HRE; Hypoxia Responsive Element)に 結 合 し 800 個 以 上 の 様 々 な 遺 伝 ⼦ の 発 現 を 誘 導 す る (20, 21)（ 図 1）。

HIF の 機 能 は 、 嫌 気 性 代 謝 へ の 切 り 替 え (22)、 活 性 酸 素 種 （ ROS;

reactive oxygen species） 発 ⽣ の 抑 制 (23)、 細 胞 内 pH 調 整 (24)な ど 多 岐 に わ た る が 、 ⾎ 管 内 ⽪ 細 胞 増 殖 因 ⼦ （ VEGF; vascular endothelial growth factor）の 発 現 を 誘 導 す る こ と で ⾎ 管 形 成 を 亢 進 し 最 終 的 に 酸 素 環 境 を 改 善 す る 作 ⽤ も 有 す る (25)。VEGF の 主 な 機 能 は ⾎ 管 新 ⽣ 、⾎ 管 内 ⽪ 細 胞 の 増 殖 促 進 だ が 、 そ れ と 同 時 に 強 い ⾎ 管 透 過 性 亢 進 作 ⽤ も 持 つ た め 、 低 酸 素 状 態 の 組 織 で は 浮 腫 を 来 す 可 能 性 が あ る 。 VEGF に は VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF（ placenta growth factor）

の ５ つ の フ ァ ミ リ ー が あ る が 、 ⾎ 管 内 ⽪ に 対 す る 作 ⽤ が 最 も 強 い の は VEGF-A で あ る た め (26)、 本 稿 に お い て VEGF は VEGF-A を 表 す も の と す る 。

HIF に よ る 低 酸 素 応 答 と 炎 症 と が 密 接 な 関 係 に あ る こ と も 明 ら か に な っ て い る 。 炎 症 細 胞 の 中 で も マ ク ロ フ ァ ー ジ や ミ ク ロ グ リ ア は 低 酸 素 部 位 に 集 積 し 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン を 産 ⽣ す る 性 質 が あ る が 、 こ の よ う な 炎 症 プ ロ セ ス の 活 性 化 に よ っ て も ⾎ 管 透 過 性 が 亢 進 す る (27)。炎 症 局 所 で は ⾎ 流 の 途 絶 な ど に よ る 酸 素 供 給 の 低 下 に 加 え 、 細 胞 浸 潤 に よ る 酸 素 消 費 の 増 加 が 引 き 起 こ さ れ 、組 織 低 酸 素 状 態 が 助 ⻑ さ れ る た め 、 HIF は ま す ま す 安 定 す る (28)。さ ら に 、炎 症 反 応 に 関 わ る 転 写 因 ⼦ で あ る 核 内 因 ⼦ κ B（ NF-κ B; nuclear factor-kappa B） も HIF に よ っ て 誘 導 さ れ る 。NF-κ B は 多 く の 炎 症 関 連 タ ン パ ク を 誘 導 す る が 、こ れ ら の タ ン パ ク に 加 え HIF も ま た NF-κ B に よ っ て 誘 導 さ れ る た め 、 HIF と NF-κ B は ポ ジ テ ィ ブ フ ィ ー ド バ ッ ク ル ー プ を 形 成 し て い る (10, 29)。

さ ら に 、 HIF だ け で な く VEGF に も 炎 症 を 誘 導 す る 作 ⽤ が あ る こ と が 知 ら れ て い る (30)。つ ま り 、低 酸 素 状 態 に あ る 組 織 で は 、HIF、VEGF、

炎 症 性 サ イ ト カ イ ン が 互 い に 刺 激 し な が ら ⾎ 管 透 過 性 を 亢 進 さ せ て い る 。

低 酸 素 に よ っ て ⾎ 管 透 過 性 亢 進 が ⽣ じ る 要 因 と し て 、 ⾎ 管 内 ⽪ 細 胞 の タ イ ト ジ ャ ン ク シ ョ ン（ TJ; tight junction）破 綻 が 知 ら れ て い る 。TJ は 全 ⾝ の 上 ⽪ 細 胞 に 存 在 す る 細 胞 間 結 合 の １ つ で 、 様 々 な 分 ⼦ が 細 胞 間 を 通 過 す る こ と を 防 い で い る 。脳 と 網 膜 に お い て は 、⾎ 管 内 ⽪ 細 胞 の TJ に 加 え 、 グ リ ア 細 胞 が ⾎ 管 を 包 み 込 む こ と で 構 成 さ れ る ⾎ 液 脳 関 ⾨

（ BBB; blood-brain barrier）/⾎ 液 網 膜 関 ⾨（ iBRB; inner blood-retinal barrier）と 呼 ば れ る ⾎ 管 バ リ ア 構 造 が そ れ ぞ れ 存 在 す る 。こ れ ら の 組 織 に お い て は 、⾎ 管 バ リ ア に よ り 組 織 の 恒 常 性 が 厳 密 に 保 た れ て い る が 、 ひ と た び 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 が ⽣ じ る と 、命 に 関 わ る よ う な 、ま た は 著 し い QOL 低 下 を 引 き 起 こ す よ う な 重 要 な 病 態 と な り 得 る 。

BBB/iBRB に つ い て は 第 ２ 章 で 、 TJ に つ い て は 第 ３ 章 で 詳 述 す る 。 な お 、 網 膜 に は outer BRB（ oBRB） も 存 在 す る が 、 こ れ は 網 膜 ⾊ 素 上 ⽪ 細 胞 の TJ に よ る バ リ ア で あ り 、⾎ 管 バ リ ア と は 異 な る 機 能・構 造 を 有 す る た め 本 稿 で は oBRB に つ い て は 論 じ な い 。

1.4 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に 関 す る こ れ ま で の 研 究 の 概 要 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 の メ カ ニ ズ ム に つ い て 詳 細 に 調 べ る こ と は 、 多 岐 に わ た る 疾 患 の 病 態 解 明 や 新 た な 治 療 戦 略 の 開 発 に お い て 重 要 で あ ろ う 。 こ の ⽬ 的 達 成 の た め に こ れ ま で に 多 く の 実 験 モ デ ル 動 物 が 確

⽴ さ れ た 。

脳 に お け る ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 を 来 す 実 験 モ デ ル 動 物 の １ つ に 凍 結 脳 損 傷 モ デ ル マ ウ ス が あ る 。 こ の モ デ ル マ ウ ス で は 、 BBB 破 綻 を 伴 う 脳 浮 腫 や 炎 症 所 ⾒ が 認 め ら れ た (31, 32)。ま た 、流 体 衝 撃 に よ る 脳 外 傷 モ デ ル マ ウ ス も 主 要 な 脳 浮 腫 モ デ ル の １ つ で あ る 。こ の モ デ ル マ ウ ス で は 、 炎 症 所 ⾒ や ⾎ 管 基 底 膜 の 変 性 を 伴 う BBB 破 綻 が 認 め ら れ た (33, 34)。

さ ら に 様 々 な ⽅ 法 で 脳 出 ⾎ モ デ ル 動 物 が 作 成 さ れ 、 こ れ ら の モ デ ル 動 物 を 解 析 す る こ と で 、活 性 化 し た グ リ ア 細 胞 に よ る ⼆ 次 的 な BBB 破 綻 な ど が 明 ら か に な っ て き た (35, 36)。

網 膜 で の ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 を 来 す 実 験 モ デ ル 動 物 も 数 多 く 報 告 さ れ て い る 。例 え ば 、レ ー ザ ー を ⽤ い た 光 凝 固 ⾎ 栓 に よ る RVO モ デ ル マ ウ ス が 確 ⽴ さ れ 、⾎ 管 か ら の 漏 出 、重 篤 な 浮 腫 、⾎ 管 変 異 な ど の 網 膜 病 変 が 認 め ら れ た (37, 38)。ま た 、⽣ 理 ⾷ 塩 ⽔ を 眼 内 に 注 ⼊ し 眼 圧 を 調 節 す る こ と に よ る 網 膜 梗 塞 再 灌 流 モ デ ル ラ ッ ト で は 、 網 膜 浮 腫 、 TJ 破 綻 、 ⾊ 素 漏 出 が 観 察 さ れ た (39)。 さ ら に 、 様 々 な 糖 尿 病 モ デ ル マ ウ ス で BRB 破 綻 に よ る 浮 腫 を 含 む 網 膜 の 変 化 が 報 告 さ れ て い る (40-42)。

し か し な が ら 、 こ れ ら の 実 験 モ デ ル 動 物 で は ２ 次 的 な 病 態 と し て 組 織 低 酸 素 を 来 す た め 、 低 酸 素 曝 露 の 直 接 的 な 影 響 を 調 べ る に は 不 向 き で あ る 。 低 酸 素 曝 露 に よ る 直 接 的 な ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に 関 す る 報 告 と し て 、 実 験 動 物 を ７ ％ 酸 素 に ６ 時 間 曝 露 す る こ と に よ る 脳 で の ⾊ 素 漏 出 の 増 加 や (43)、８ ％ 酸 素 に 24 時 間 曝 露 す る こ と に よ る フ ル オ レ セ イ ン イ ソ チ オ シ ア ネ ー ト （ FITC; fluorescein-5-isothiocyanate） の 脳 で の ⾎ 管 か ら の 漏 出 増 加 (44, 45)、な ど が あ る が 、報 告 数 は 少 な く 、メ カ ニ ズ ム の 詳 細 に 関 し て は 明 ら か で は な い 。 特 に 網 膜 に お け る 直 接 的 な 低 酸 素 の 影 響 に 関 す る 報 告 は 限 定 的 で あ る 。 1969 年 に 初 め て ⾼ 所 に お け る 網 膜 浮 腫 が 報 告 さ れ て か ら (46, 47)、低 酸 素 に よ る 網 膜 浮 腫 に 関 す る い

く つ か の 研 究 が ⾏ わ れ た (48, 49)。近 年 で は 網 膜 に お け る 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 の 細 胞 ⽣ 物 学 的 な 研 究 も 報 告 さ れ て い る (50, 51)。特 に Kaur ら は 低 酸 素 性 の iBRB 障 害 で は TJ 破 壊 お よ び ア ス ト ロ サ イ ト /ミ ュ ラ ー 細 胞 ⾜ 突 起 の 腫 脹 を 認 め る こ と を ⽰ し た (50)。し か し な が ら 、網 膜 の 層 構 造 に 着 ⽬ し 、 層 ご と の 低 酸 素 に よ る ⾎ 管 構 造 変 化 を ⽰ し た 研 究 例 は 我 々 が 知 る 限 り 無 い 。

ま た 、 低 酸 素 環 境 で の 培 養 細 胞 の TJ 破 綻 も 多 く 報 告 さ れ て い る が 、 こ れ ら の 報 告 で は 培 養 シ ス テ ム 、細 胞 種 、酸 素 濃 度 、解 析 ⽅ 法 な ど が ⼤ き く 異 な る の で 実 験 結 果 を ⼀ 般 化 す る こ と は 難 し い 。し か し 、内 ⽪ 細 胞 の TJ 破 綻 は 1%程 度 の 低 酸 素 曝 露 開 始 後 30 分 か ら 48 時 間 以 内 に ⽣ じ る こ と は 確 か ら し い (52-55)。 こ れ ら は い ず れ も 内 ⽪ 細 胞 の 単 独 培 養 に よ る 報 告 だ が 、 実 際 の ⾎ 管 バ リ ア は 内 ⽪ 細 胞 だ け で な く 周 ⽪ 細 胞 や グ リ ア 細 胞 な ど 種 々 の 細 胞 が 連 携 し て 機 能 を 維 持 し て い る た め 、 共 培 養 実 験 も ⾏ わ れ て い る 。特 に ア ス ト ロ サ イ ト は 内 ⽪ 細 胞 の TJ 維 持 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と が 確 か め ら れ て い る (56, 57)。し か し な が ら 、 低 酸 素 環 境 で の ア ス ト ロ サ イ ト の TJ へ の 影 響 に 関 し て は 定 ま っ た ⾒ 解 が 得 ら れ て い な い 。ア ス ト ロ サ イ ト は 低 酸 素 環 境 で TJ タ ン パ ク の 局 在 を 維 持 す る な ど し て TJ を 保 護 す る と い う 報 告 が あ る が (58-60)、⼀ ⽅ 、 VEGF や 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン を 産 ⽣ す る こ と で TJ 破 綻 に 寄 与 す る と い う 報 告 も あ る (7, 61, 62)。

1.5 本 研 究 の ⽬ 的

前 述 の 通 り 、 こ れ ま で に 低 酸 素 に 関 わ る 様 々 な 実 験 モ デ ル 動 物 が 確

⽴ さ れ て き た 。し か し な が ら 、正 常 ⾎ 管 に お け る 急 性 か つ 直 接 的 な 低 酸 素 の 影 響 に 関 す る 報 告 は 少 な い 。な ぜ な ら 、こ れ ま で に 報 告 さ れ た 殆 ど の 実 験 モ デ ル 動 物 の 病 態 は 、 ⾎ 管 病 変 が 先 ⾏ す る ⼆ 次 的 な 低 酸 素 に よ る も の だ か ら で あ る 。 そ こ で 我 々 は 、 野 ⽣ 型 マ ウ ス を 6%酸 素 に 24 時 間 曝 露 す る こ と で 直 接 的 な 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 モ デ ル マ ウ ス を 作 成 し 、脳 お よ び 網 膜 に お け る ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に つ い て 詳 細 に 観 察 し た 。 特 に 網 膜 で は 各 層 に お け る ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に つ い て 評 価 し た 。ま た 、炎

症 プ ロ セ ス の 中 ⼼ と な る ミ ク ロ グ リ ア に 着 ⽬ し 、 低 酸 素 環 境 で の ミ ク ロ グ リ ア の ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 へ の 関 与 に つ い て 報 告 す る 。 こ れ ら の 実 験 動 物 を ⽤ い た 研 究 の 詳 細 は 第 ２ 章 で 論 ず る 。

ま た 、 ⾎ 管 周 囲 の 細 胞 が 変 化 す る こ と に よ っ て ⾎ 管 バ リ ア 機 能 に 異 常 が ⽣ じ る と 考 え ら れ て い る に も 関 わ ら ず 、 ⾎ 管 バ リ ア 構 成 細 胞 間 で の 相 互 作 ⽤ の 詳 細 は 未 だ 不 明 な 点 が 多 い 。前 述 の 通 り 、低 酸 素 環 境 で の 細 胞 培 養 実 験 は 多 数 報 告 さ れ て い る も の の 、 複 数 種 の ⾎ 管 バ リ ア 構 成 細 胞 を 共 培 養 す る こ と に よ る ⾎ 管 バ リ ア モ デ ル を ⽤ い た 低 酸 素 曝 露 実 験 の 報 告 は 少 な く 、定 ま っ た ⾒ 解 も 得 ら れ て い な い 。そ こ で 我 々 は 、低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に お け る 各 細 胞 の 影 響 を 明 ら か に す る た め に 、 脳 ⾎ 管 内 ⽪ 細 胞 株 と 網 膜 ミ ュ ラ ー 細 胞 株 を ⽤ い て 、 ⾎ 管 バ リ ア を 模 し た ２ 層 の 細 胞 シ ー ト （ 以 下 、「 ⾎ 管 バ リ ア を 模 し た ２ 層 の 細 胞 シ ー ト 」 を「 バ リ ア 細 胞 シ ー ト 」と 記 す ）を 作 成 し 、こ れ を 低 酸 素 環 境 で 培 養 し た 。さ ら に 、バ リ ア 細 胞 シ ー ト の ミ ク ロ グ リ ア と の 共 培 養 や 、炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の １ つ で あ る interleukin（ IL） -1β の 培 地 へ の 添 加 を ⾏ っ た 。こ の よ う な 条 件 で の TJ 構 造 お よ び バ リ ア 機 能 の 変 化 を 詳 細 に 調 べ る こ と で 、 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に お け る 各 細 胞 の 影 響 を 明 ら か に し た 。 こ れ ら の 培 養 細 胞 を ⽤ い た 研 究 の 詳 細 は 第 ３ 章 で 論 ず る 。

以 上 の 実 験 動 物 お よ び 培 養 細 胞 を ⽤ い た 実 験 に よ り 、 脳 お よ び 網 膜 に お け る 低 酸 素 曝 露 に よ る ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 メ カ ニ ズ ム の ⼀ 端 を 明 ら か に す る こ と が 本 研 究 の ⽬ 的 で あ る 。 TJ を 取 り 巻 く 細 胞 間 の 相 互 作 ⽤ へ の 理 解 を 深 め る こ と は 、 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 を 伴 う 多 く の 病 態 の 解 明 に 貢 献 し 、 ⾎ 管 バ リ ア 安 定 化 に 焦 点 を 当 て た 新 た な 細 胞 特 異 的 な 治 療 戦 略 の 開 発 に つ な が る 可 能 性 が あ る 。ま た 、こ れ ら の 知 ⾒ は 、こ れ ま で ⾃ 衛 隊 衛 ⽣ に お い て 注 ⽬ さ れ る こ と の 少 な か っ た ⾼ 所 医 学 の 基 盤 の 構 築 に 資 す る も の で あ る 。

第２章

実験動物における低酸素性⾎管バリア破綻

第１節 イントロダクション

2.1.1 ⾎ 管 バ リ ア の 構 造 と 機 能

脳 や 網 膜 に お い て 神 経 細 胞 の 興 奮 や 刺 激 伝 導 が 円 滑 に ⾏ わ れ る た め に は 、神 経 系 の 細 胞 内 外 の 環 境 を ⼀ 定 に 保 つ 必 要 が あ る 。こ の た め 、神 経 系 組 織 の 液 性 環 境 は ⾎ 液 か ら 厳 密 に 分 け ら れ て お り 、 ⾎ 中 に 存 在 す る 物 質 が 容 易 に 神 経 系 組 織 へ 到 達 す る こ と を 防 い で い る 。 こ の バ リ ア 機 能 を 担 っ て い る の が BBB/iBRB で あ り 、 毒 物 や 外 来 微 ⽣ 物 な ど が 脳 や 網 膜 へ 侵 ⼊ す る の を 防 ぎ 、 組 織 の 恒 常 性 を 維 持 す る こ と に 寄 与 し て い る (63, 64)。BBB/iBRB は バ リ ア と し て 働 く の み な ら ず 様 々 な ト ラ ン ス ポ ー タ ー を 発 現 し て お り 、 神 経 系 に 有 害 な 薬 剤 の 汲 み 出 し や 必 要 な 栄 養 を 神 経 組 織 に 供 給 す る 役 割 も 持 っ て い る (65)。し か し 、ど の よ う に バ リ ア 機 能 が 維 持 さ れ て い る の か に 関 し て は 未 だ 不 明 な 点 が 多 い 。

2.1.1a 基 本 構 造

BBB は ⾎ 管 内 ⽪ 細 胞 の TJ を 中 ⼼ に 、ア ス ト ロ サ イ ト 、周 ⽪ 細 胞 、基 底 膜 か ら 構 成 さ れ る 。iBRB は こ れ ら に 加 え ミ ュ ラ ー 細 胞 も 構 成 に 関 わ る 。 ⾎ 管 内 ⽪ 細 胞 と 周 ⽪ 細 胞 は 直 接 接 触 し て お り 基 底 膜 を 共 有 し て い る (57, 63)。⾎ 管 内 ⽪ 細 胞 と 神 経 線 維 は ２ つ の 層 で 隔 て ら れ て い る 。内 側 の 層 は 内 ⽪ 細 胞 の 基 底 側 に 存 在 す る 基 底 膜 で 、 外 側 の 層 は ⾎ 管 を 覆 う ア ス ト ロ サ イ ト ま た は ミ ュ ラ ー 細 胞 の ⾜ 突 起 で あ る (66, 67)。脳 実 質 に お け る ⾎ 管 の 99%は ア ス ト ロ サ イ ト の ⾜ 突 起 に 被 覆 さ れ て お り (68)、

⼤ 部 分 の 神 経 線 維 は ⾎ 管 へ の 直 接 の コ ン タ ク ト は な く 、 ア ス ト ロ サ イ ト ⾜ 突 起 は ⾎ 管 と 神 経 線 維 の 共 通 領 域 を 構 成 し て い る (69)。こ れ は ア ス

ト ロ サ イ ト が ⽑ 細 ⾎ 管 レ ベ ル で の 物 質 輸 送 に 関 与 し て い る 可 能 性 を ⽰ す 。す な わ ち BBB の 脳 内 へ の 不 要 な 物 質 の 制 限 と 必 要 な 物 質 の 通 過 と い う 関 ⾨ と し て の 機 能 は ア ス ト ロ サ イ ト が 担 っ て い る と 予 想 さ れ る 。

⼀ ⽅ 、網 膜 に お い て ア ス ト ロ サ イ ト は 表 層 に 存 在 す る た め (70)、表 層 の

⾎ 管 の み が ア ス ト ロ サ イ ト ⾜ 突 起 に 覆 わ れ て い る 。 網 膜 に は ア ス ト ロ サ イ ト の 他 に 組 織 特 異 的 グ リ ア 細 胞 で あ る ミ ュ ラ ー 細 胞 が 存 在 す る 。 ミ ュ ラ ー 細 胞 は 網 膜 の 厚 さ 全 体 に 広 が り 、 あ ら ゆ る 種 類 の 神 経 細 胞 体 と 接 す る と 共 に 、⾜ 突 起 が 網 膜 ⾎ 管 を 覆 っ て い る (71)。ミ ュ ラ ー 細 胞 の 機 能 に つ い て は 不 明 な 点 も 多 い が 、ア ス ト ロ サ イ ト と 同 様 、iBRB 維 持 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る と 考 え ら れ て い る （ 図 2-1）。

2.1.1b ア ス ト ロ サ イ ト と ⾎ 管 バ リ ア

BBB/iBRB の バ リ ア 機 能 は 主 に 内 ⽪ 細 胞 に 存 在 す る TJ タ ン パ ク の 発 現 と 局 在 化 に よ っ て 調 整 さ れ る が （ TJ に つ い て は 第 ３ 章 で 詳 述 す る ）、

こ れ は BBB/iBRB 構 成 細 胞 が 互 い に 協 調 す る こ と に よ り 維 持 さ れ て い る 。特 に ア ス ト ロ サ イ ト は 古 く か ら ⾎ 管 内 ⽪ 細 胞 の TJ タ ン パ ク を 誘 導 す る 上 で 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と が 知 ら れ て い る (72)。

ア ス ト ロ サ イ ト は 脳 や 網 膜 表 層 に 存 在 す る グ リ ア 細 胞 の １ つ で 、 多 数 の 突 起 を 持 ち 、 こ れ ら の 突 起 の 間 に 近 傍 を ⾛ ⾏ す る 神 経 線 維 が 配 置 さ れ 、細 胞 ご と に ⾃ ら の 領 域 内 の 神 経 線 維 の 構 造 を 維 持 し て い る 。近 年 、 ア ス ト ロ サ イ ト は 神 経 線 維 を 構 造 ⾯ で ⽀ え る だ け で な く 、 神 経 伝 達 の た め の エ ネ ル ギ ー や 基 質 の 供 給 を 通 じ て 神 経 機 能 の 維 持 に 関 与 し て い る こ と が わ か っ て き た (73, 74)。ま た 、ア ス ト ロ サ イ ト ⾜ 突 起 と ⾎ 管 が 隣 接 し て い る こ と か ら ア ス ト ロ サ イ ト が ⾎ 管 バ リ ア 調 節 に 関 わ っ て い る こ と が 約 50 年 前 に 予 想 さ れ て い た (75)。そ の 後 、多 く の 動 物 実 験 に よ っ て ア ス ト ロ サ イ ト に よ る ⾎ 管 バ リ ア の 誘 導 と 調 節 が ⽰ さ れ て き た (72, 76, 77)。 ま た 、 ア ス ト ロ サ イ ト と 内 ⽪ 細 胞 の 共 培 養 に よ っ て 経 上

⽪ 電 気 抵 抗 （ TEER; Trans-endothelial electrical resistance）（ TEER に つ い て は 第 ３ 章 で 詳 述 す る ） の 上 昇 や 低 分 ⼦ 量 ト レ ー サ ー の 透 過 性 低 下 を 認 め る こ と か ら 、 ア ス ト ロ サ イ ト に よ る バ リ ア 機 能 強 化 の 可 能 性

が ⽰ さ れ た (58, 60, 78, 79)。現 在 は 研 究 が 進 み 、ア ス ト ロ サ イ ト に よ る バ リ ア 誘 導 は 、内 ⽪ 細 胞 の TJ の 数 、⻑ さ 、複 雑 さ の 向 上 に よ る こ と (80)、

ま た 、ク ロ ー デ ィ ン 、オ ク ル デ ィ ン 、zonula occludens（ ZO）タ ン パ ク の よ う な 関 連 タ ン パ ク 発 現 の 調 節 (81, 82)お よ び 再 分 配 に よ る こ と (82, 83)が 明 ら か に な っ て き た 。さ ら に 、ア ス ト ロ サ イ ト は 多 く の 伝 達 物 質 の 特 異 的 な 輸 送 体 を 発 現 す る と 共 に (83, 84)、BBB 特 異 的 酵 素 の 局 在 調 節 に よ り ⾎ 管 バ リ ア の 関 ⾨ と し て の 機 能 を 担 っ て い る こ と (85, 86)が 報 告 さ れ て い る 。

近 年 は 、ア ス ト ロ サ イ ト は ど の よ う に TJ タ ン パ ク 、輸 送 体 、酵 素 な ど の 調 節 を ⾏ っ て い る の か の 解 明 に ⼒ が そ そ が れ て き た 。 ア ス ト ロ サ イ ト は 多 く の ペ プ チ ド , 成 ⻑ 因 ⼦ 、ケ モ カ イ ン を 分 泌 す る こ と が 知 ら れ て い る が (87)、そ の う ち の い く つ か は バ リ ア 機 能 を 調 節 す る こ と が わ か っ て い る 。例 え ば 、塩 基 性 線 維 芽 細 胞 増 殖 因 ⼦（ bFGF; basic fibroblast growth factor）は 細 胞 実 験 で バ リ ア 機 能 を 向 上 さ せ る こ と が ⽰ さ れ て い る (88, 89)。bFGF を ノ ッ ク ア ウ ト し た 動 物 実 験 で は ア ル ブ ミ ン の BBB 透 過 性 が 亢 進 し 、 ZO-1 と オ ク ル デ ィ ン の 発 現 が 低 下 し た (90)。 ま た 、 グ リ ア 細 胞 株 由 来 神 経 栄 養 因 ⼦（ GDNF; glial cell derived neurotrophic factor ） を ⾎ 管 内 ⽪ 細 胞 株 に 作 ⽤ さ せ る と 、 ク ロ ー デ ィ ン -5 の 遺 伝 ⼦ 発 現 お よ び タ ン パ ク 発 現 が 増 加 し 、 バ リ ア 機 能 が 向 上 し た 。 ⼀ ⽅ 、 抗 GDNF 中 和 抗 体 に よ っ て こ れ ら が 減 少 し た (91)。

こ こ に ⽰ し た 通 り 、こ こ ２ ０ 年 で 、⾎ 管 バ リ ア 調 節 に 関 す る ア ス ト ロ サ イ ト の 重 要 性 と バ リ ア 調 節 の メ カ ニ ズ ム に 対 す る 理 解 は 急 激 に 進 歩 し て い る 。し か し 、複 雑 な 分 ⼦ ⽣ 物 学 的 パ ス ウ ェ イ は 未 だ 未 解 明 の 部 分 が 多 い 。

2.1.1c ミ ュ ラ ー 細 胞 と ⾎ 管 バ リ ア

ミ ュ ラ ー 細 胞 は ア ス ト ロ サ イ ト と 同 様 、グ リ ア 細 胞 の １ つ だ が 、網 膜 特 異 的 に 存 在 し 、 網 膜 の 内 境 界 膜 （ ILM; internal limiting membrane）

か ら 視 細 胞 層 ま で の 広 範 囲 を １ つ の 細 胞 体 で 覆 っ て い る (71)（ 網 膜 構 造 の 詳 細 は 後 述 ）。こ の よ う な 構 造 に よ っ て 網 膜 の ⽀ 持 組 織 と し て 機 能 し

て い る と 考 え ら れ て い る が 、 そ れ 以 外 に も ア ス ト ロ サ イ ト と 同 じ よ う に 様 々 な 機 能 を 有 す る こ と が 最 近 の 研 究 で 明 ら か に な っ て き た 。 例 え ば 、変 性 網 膜 の 修 復 機 能 、神 経 細 胞 を 標 的 と す る 神 経 栄 養 因 ⼦ の 分 泌 機 能 、神 経 伝 達 物 質 の 代 謝 機 能 な ど が 着 ⽬ さ れ て い る が 、⾎ 管 バ リ ア 維 持 機 能 に 関 し て も 報 告 さ れ て い る (92)。ア ス ト ロ サ イ ト は 網 膜 の 表 層 に し か 存 在 し な い た め 、 網 膜 の 中 層 や 深 層 の ⾎ 管 は ア ス ト ロ サ イ ト で は な く ミ ュ ラ ー 細 胞 の ⾜ 突 起 に よ っ て 覆 わ れ て い る 。す な わ ち 、こ れ ら の ⾎ 管 で は ア ス ト ロ サ イ ト の 代 わ り に ミ ュ ラ ー 細 胞 が ⾎ 管 バ リ ア 機 能 の 維 持 を 担 っ て い る と 考 え ら れ る (8)。 こ れ ら の 裏 付 け と し て 、 ラ ッ ト の 前 房 に ミ ュ ラ ー 細 胞 を 注 射 す る こ と に よ る ⾎ 管 バ リ ア 機 能 の 向 上 や (93)、

ミ ュ ラ ー 細 胞 が 産 ⽣ す る GDNF に よ る BRB 機 能 維 持 な ど が 報 告 さ れ て い る (94)。

2.1.2 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 の メ カ ニ ズ ム の 概 要

⾎ 管 バ リ ア は 前 述 の 通 り 数 種 類 の 細 胞 に よ っ て 構 成 さ れ て い る が 、 低 酸 素 は ⾎ 管 バ リ ア の 機 能 維 持 に 必 要 な こ れ ら の 構 造 を 破 壊 す る 主 要 な 要 因 と し て 知 ら れ て い る 。 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 は ⽔ や イ オ ン の 分 配 変 化 、炎 症 、酸 化 ス ト レ ス 、浮 腫 、末 梢 免 疫 細 胞 の 浸 透 、⾎ 液 タ ン パ ク の 組 織 へ の 漏 出 な ど の 重 ⼤ な 引 き ⾦ と な る (57, 95)。

低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 の メ カ ニ ズ ム は 盛 ん に 研 究 さ れ て お り 、多 く の 異 な る 分 ⼦ レ ベ ル で ⽣ じ て い る こ と が 明 ら か に な っ て い る 。 特 に TJ は 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 の 主 要 な 標 的 だ と 考 え ら れ て い る 。 低 酸 素 は TJ を 構 成 す る タ ン パ ク 質 で あ る ク ロ ー デ ィ ン 、オ ク ル デ ィ ン 、ZO- 1、 の 発 現 調 節 と 再 分 配 を ⾏ い 、 こ れ に よ り TJ の 機 能 が 制 御 さ れ て い る (44, 96-99)。 TJ タ ン パ ク の 再 分 配 は お そ ら く セ リ ン 、 ト レ オ ニ ン 、 チ ロ シ ン 残 基 の リ ン 酸 化 に よ る と 考 え ら れ 、 PKC（ protein kinase C）、

ミ オ シ ン 軽 鎖 キ ナ ー ゼ 、 RhoA な ど を 介 し て 調 節 さ れ て い る (100)。 こ の よ う な ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に は 活 性 化 し た ア ス ト ロ サ イ ト お よ び ミ ュ ラ ー 細 胞 が 関 わ っ て い る こ と が 知 ら れ て い る (101, 102)。な お 、ア ス ト ロ サ イ ト /ミ ュ ラ ー 細 胞 に よ る 低 酸 素 環 境 で の ⾎ 管 バ リ ア へ の 影 響 は 第 ３

章 で 詳 述 す る 。

2.1.3 低 酸 素 に よ る ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化

神 経 系 組 織 に お け る マ ク ロ フ ァ ー ジ 様 細 胞 と し て 知 ら れ る ミ ク ロ グ リ ア は 、抗 原 提 ⽰ 、異 物 に 対 す る ⾃ 然 免 疫 応 答 、死 細 胞 な ど の 貪 ⾷ 、神 経 回 路 形 成 へ の 関 与 な ど 多 彩 な 役 割 を 持 ち 、 組 織 の 恒 常 性 維 持 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る (103, 104)。正 常 時 に お け る ミ ク ロ グ リ ア は ⼩ さ な 細 胞 体 か ら 多 数 の 突 起 を 伸 ば し て い る 形 態 を し て お り 「 ラ ミ フ ァ イ ド 型 」と 呼 ば れ る 。傷 害 、感 染 、低 酸 素 な ど に 反 応 し て ミ ク ロ グ リ ア は 活 性 化 し 、短 縮 し た 突 起 と 肥 ⼤ 化 し た 細 胞 体 を 有 す る「 ア メ ボ イ ド 型 」と な り 、 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン を は じ め 様 々 な 液 性 因 ⼦ の 産 ⽣ 放 出 を 引 き 起 こ す (103)。こ の よ う な 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア は 神 経 系 組 織 に お け る 病 態 メ カ ニ ズ ム に ⼤ き く 寄 与 し て お り 、 そ の 活 性 調 節 は 治 療 薬 開 発 に お け る 有 望 な タ ー ゲ ッ ト と し て 注 ⽬ さ れ て い る (105-107)。

2.1.4 マ ウ ス 網 膜 の 構 造

マ ウ ス の 網 膜 層 構 造 は ヒ ト と 同 じ く 10 層 か ら な り 、硝 ⼦ 体 側（ 表 層 ） か ら 内 境 界 膜 、 神 経 線 維 層 （ NFL; nerve fiber layer）、 神 経 節 細 胞 層

（ GCL; ganglion cell layer）、 内 網 状 層 （ IPL; inner plexiform layer）、

内 顆 粒 層 （ INL; inner nuclear layer）、 外 網 状 層 （ OPL; outer plexiform layer）、 外 顆 粒 層 （ ONL; outer nuclear layer）、 外 境 界 膜 、 視 細 胞 層 、 網 膜 ⾊ 素 上 ⽪ 層 で あ る 。網 膜 に は ５ 種 類 の 神 経 細 胞 が 確 認 さ れ て お り 、 そ れ ぞ れ 神 経 節 細 胞 層 に は 神 経 節 細 胞 、 内 顆 粒 層 に は ア マ ク リ ン 細 胞 と 双 極 細 胞 、外 顆 粒 層 に は 双 極 細 胞 と 視 細 胞 の 核 が そ れ ぞ れ 存 在 す る 。 ま た 、内 境 界 膜 か ら 視 細 胞 層 ま で を 貫 く よ う に ミ ュ ラ ー 細 胞 が 、NFL に は ア ス ト ロ サ イ ト が 存 在 し 、そ れ ぞ れ ⾜ 突 起 を 伸 ば し 、周 囲 の ⾎ 管 を 覆 っ て い る 。さ ら に IPL と OPL を 中 ⼼ に ミ ク ロ グ リ ア が 存 在 す る（ 図 2- 2a）。

ま た 、マ ウ ス 網 膜 に は 解 剖 学 的 に ３ 層 の ⾎ 管 叢（ VPL; vascular plexus layer） を 認 め 、 表 層 ⾎ 管 叢 （ superficial VPL; SVPL） は NFL と GCL

に 、 中 層 ⾎ 管 叢 （ intermediate VPL; IVPL） は IPL と INL の 境 界 に 、 深 層 ⾎ 管 叢 （ deep VPL; DVPL） は IPL と OPL の 境 界 に そ れ ぞ れ 存 在 す る （ 図 2-2b）。

2.1.5 本 章 の ⽬ 的

我 々 は 、低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 モ デ ル マ ウ ス を 作 成 し 、脳 お よ び 網 膜 に お け る 低 酸 素 の ⾎ 管 バ リ ア へ の 影 響 に つ い て 形 態 学 的 変 化 を 含 め て 詳 細 に 調 べ た 。 特 に 網 膜 に お い て は 、 そ れ ぞ れ の VPL で ⾎ 管 を 取 り 囲 む グ リ ア 細 胞 の 種 類（ ア ス ト ロ サ イ ト も し く は ミ ュ ラ ー 細 胞 ）が 異 な る こ と か ら 、 各 VPL で ⾎ 管 の 低 酸 素 刺 激 に 対 す る 感 受 性 は 異 な る と 考 え 、 低 酸 素 の ⾎ 管 バ リ ア へ の 影 響 を 各 VPL で ⽐ 較 し た 。

ま た 、 デ キ サ メ タ ゾ ン は 低 酸 素 に よ る 中 枢 神 経 系 に お け る 組 織 の 浮 腫 を 、VEGF や 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン を 抑 制 す る こ と に よ り 軽 減 す る こ と が 知 ら れ て い る (45, 108, 109)。 そ こ で 我 々 は 、 作 成 し た モ デ ル マ ウ ス に お い て デ キ サ メ タ ゾ ン が 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 を 軽 減 す る か ど う か を 調 べ た 。

さ ら に 、 低 酸 素 に よ り ミ ク ロ グ リ ア が 活 性 化 す る こ と で ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 を 誘 導 す る こ と が 知 ら れ て い る 。そ こ で 我 々 は 、ミ ク ロ グ リ ア 減 少 モ デ ル マ ウ ス を 作 成 し 、 低 酸 素 性 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 に 関 す る ミ ク ロ グ リ ア の 影 響 に つ い て 調 べ た 。

第２節 材料と⽅法

2.2.1 実 験 動 物

以 下 、 本 研 究 に お け る 全 て の 動 物 実 験 は 防 衛 医 科 ⼤ 学 校 倫 理 に 関 す る ガ イ ド ラ イ ン と ARVO Statement for Use Animals に 則 っ て 実 施 し た 。 実 験 動 物 と し て 野 ⽣ 型 C57BL/6 マ ウ ス を SLC（ 静 岡 ） よ り 購 ⼊ し た 。 マ ウ ス は 通 常 の 概 ⽇ リ ズ ム（ 明 暗 各 12 時 間 サ イ ク ル ）の 下 で 飼 育 さ れ 、

⾃ 由 に ⾷ 事 と ⽔ を 与 え ら れ た 。実 験 動 物 は イ ソ フ ル ラ ン（ Wako, ⼤ 阪 ） の 吸 ⼊ ⿇ 酔 下 で 、 過 量 の ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル （ ソ ム ノ ペ ン チ ル ®; 共 ⽴ 製 薬 , 東 京 ）を 腹 腔 内 注 射 す る こ と で 安 楽 死 さ せ た 。全 て の 実 験 に お い て 8〜 10 週 齢 の 雄 マ ウ ス の み を 使 ⽤ し た 。 各 実 験 で は 各 群 ３ 〜 ８ 匹 の マ ウ ス を ⽤ い た 。

2.2.1a デ キ サ メ タ ゾ ン 投 与 実 験

マ ウ ス を 以 下 の 通 り ４ つ の グ ル ー プ に 分 け た 。１ ）Air-PBS 群：空 気 曝 露 ＋ リ ン 酸 緩 衝 ⽣ 理 ⾷ 塩 ⽔ （ PBS; Phosphate- buffered saline） 腹 腔 内 注 射 、 ２ ） Air-Dex 群 ： 空 気 曝 露 ＋ デ キ サ メ タ ゾ ン 腹 腔 内 注 射 、 ３ ） Hypox-PBS 群 ： 低 酸 素 曝 露 +PBS 腹 腔 内 注 射 、 ４ ） Hypox-Dex 群 ： 低 酸 素 曝 露 ＋ デ キ サ メ タ ゾ ン 腹 腔 内 注 射 。そ れ ぞ れ の 群 に お い て 、100 μ l の PBS も し く は デ キ サ メ タ ゾ ン （ デ カ ド ロ ン ®, Aspen Japan, 東 京 ） 16.5 μ g を 腹 腔 内 注 射 し た 後 、 室 内 の 空 気 も し く は 低 酸 素 混 合 ガ ス に 24 時 間 曝 露 し た 。 デ キ サ メ タ ゾ ン の 投 与 量 は 脳 浮 腫 に 対 す る ヒ ト へ の 投 与 量 を 基 準 に 決 定 し た (110)。

2.2.1b コ ロ ニ ー 刺 激 因 ⼦ １ 受 容 体 阻 害 薬 投 与 実 験

マ ウ ス を 以 下 の 通 り ４ つ の グ ル ー プ に 分 け た 。１ ）Air-cont 群：空 気 曝 露 ＋ 通 常 餌 、２ ）Air-PLX 群：空 気 曝 露 ＋ PLX5622 含 有 餌 、３ ）Hypox- cont 群：低 酸 素 曝 露 ＋ 通 常 餌 、４ ）Hypox-PLX 群：低 酸 素 曝 露 ＋ PLX5622 含 有 餌 。 PLX 群 は 、 コ ロ ニ ー 刺 激 因 ⼦ １ 受 容 体 （ CSF1R; Colony stimulating factor 1 receptor） 阻 害 薬 （ PLX5622, Chemgood LLC, VA,

USA)を 餌 に 1200 ppm 混 ⼊ し ９ ⽇ 間 投 与 す る こ と で ミ ク ロ グ リ ア を 減 少 さ せ た 。 そ の 際 、 薬 剤 を dimethyl sulfoxide（ DMSO） に 溶 解 さ せ た が 、DMSO 濃 度 は 2%未 満 と し 、cont 群 の 餌 に も 同 濃 度 の DMSO を 混

⼊ し た 。餌 投 与 開 始 後 、９ ⽇ ⽬ か ら 10 ⽇ ⽬ に か け て 室 内 の 空 気 も し く は 低 酸 素 混 合 ガ ス に 24 時 間 曝 露 し た 。

2.2.2 低 酸 素 曝 露

Hypox 群 の マ ウ ス を 、6%酸 素 94%窒 素 混 合 ガ ス シ リ ン ダ ー に 接 続 さ れ た 透 明 な プ ラ ス チ ッ ク 性 の 常 圧 低 酸 素 チ ャ ン バ ー（ 幅 25 cm×奥 ⾏ き 26 cm×⾼ さ 23 cm） 内 で 24 時 間 飼 育 す る こ と に よ り 低 酸 素 曝 露 を ⾏ な っ た （ 図 2-3a）。 な お 、 1 回 に つ き 2〜 4 匹 の マ ウ ス に 対 し 低 酸 素 曝 露 し た 。そ の 間 、Air 群 の マ ウ ス は 通 常 の 室 内 空 気 で 飼 育 し た 。低 酸 素 チ ャ ン バ ー 内 の 酸 素 お よ び ⼆ 酸 化 炭 素 濃 度 は 、2 時 間 ご と に ガ ス 検 知 管

（ Gastec, 神 奈 川 ）（ 図 2-3b）に よ り 測 定 さ れ 、そ れ ぞ れ 6.0-6.5%お よ び 0.1%以 下 に 維 持 さ れ た （ 図 2-3c）。

2.2.3 エ バ ン ス ブ ル ー ⾊ 素 漏 出 実 験

エ バ ン ス ブ ル ー ⾊ 素（ EB; Evans blue）が ⾎ 清 ア ル ブ ミ ン と 結 合 す る 性 質 を 利 ⽤ し て (111)、脳 お よ び 網 膜 の ⾎ 管 か ら の 漏 出 量 を 、既 報 (112) を 参 考 に 測 定 し た 。 デ キ サ メ タ ゾ ン 投 与 実 験 に お け る 各 群 の マ ウ ス に イ ソ フ ル ラ ン の 吸 ⼊ ⿇ 酔 下 で ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル （ 50 mg/kg） の 腹 腔 内 注 射 を ⾏ い 、 空 気 も し く は 低 酸 素 曝 露 の 1 時 間 前 に EB(20 mg/ml, 0.15 ml; Sigma-Aldrich, MO,USA)を 尾 静 脈 注 射 し た 。 空 気 も し く は 低 酸 素 曝 露 直 後 に 再 び ⿇ 酔 を か け 、 0.1〜 0.2 ml の ⾎ 液 を 左 ⼼ 室 か ら 採 取 し た 。PBS を 灌 流 し た 後 、リ ン 酸 緩 衝 1%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド（ PFA;

paraformaldehyde）で 灌 流 固 定 を ⾏ い 、脳 お よ び 網 膜 を 摘 出 し た 。こ れ ら の 組 織 の 乾 燥 重 量 を 測 定 し た 後 、ジ メ チ ル フ ォ ル マ マ イ ド に 75 ℃ で

⼀ 晩 処 理 す る こ と で EB を 溶 出 し た 。 18,800 G で 15 分 間 の 遠 ⼼ を ⾏ い 、上 清 の 吸 光 度（ 740 nm-620 nm）を 測 定 し た 。⾎ 液 サ ン プ ル は 4000 G で 15 分 間 の 遠 ⼼ を ⾏ い 、 上 清 を 1000 倍 に 希 釈 し た 後 、 同 様 に 吸 光

度 を 測 定 し た 。組 織 EB 量 は EB ス タ ン ダ ー ド 曲 線 を 元 に 算 出 し 、⾎ 管 透 過 性 を 以 下 の 計 算 式 を ⽤ い て 定 量 化 し た 。

［ 組 織 EB(μ g)/組 織 重 量 (mg)］ /［ ⾎ 液 EB 濃 度 (mg/ml)×循 環 時 間 ］ 脳 お よ び 網 膜 に お け るEB⾊ 素 の ⾎ 管 か ら の 漏 出 の 様 ⼦ を 観 察 す る た め に 、同 様 の ⽅ 法 で 、各 群 の マ ウ ス に EB を 尾 静 脈 注 射 し た 。空 気 も し く は 低 酸 素 曝 露 直 後 に 、 過 量 の ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル に よ る 深 ⿇ 酔 を ⾏ い 、リ ン 酸 緩 衝 4%PFA で 灌 流 固 定 し た 。脳 を 採 取 し 、⾁ 眼 で ⾊ 調 の 変 化 を 観 察 し た 。ま た 、網 膜 を 採 取 し 、ス ラ イ ド ガ ラ ス 上 で 伸 展 標 本 を 作 成 し 、蛍 光 顕 微 鏡 (Keyence BZ-8000, ⼤ 阪 )の Z ス タ ッ ク 機 能 を ⽤ い て 観 察 し た 。

2.2.4 遺 伝 ⼦ の 発 現 解 析

空 気 ま た は 低 酸 素 曝 露 後 に 、 イ ソ フ ル ラ ン 吸 ⼊ お よ び 過 量 の ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル に よ る 深 ⿇ 酔 下 で 、 各 群 の マ ウ ス か ら 脳 お よ び 網 膜 を 採 取 し 、RNeasy Mini Kit（ Qiagen, Venlo, Netherlands）を ⽤ い て 全 RNA を 抽 出 し た 。続 い て SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase Kit（ Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA）を ⽤ い て RNA に 対 応 す る cDNA を 作 成 し た 。 使 ⽤ し た プ ロ ー ブ （ Applied Biosystems, Massachusetts, USA） は 以 下 の 通 り で あ る 。 VEGF (Vegfa, Mm00437304_m1)、 tumor necrosis factor α (TNFα ) (Tnf, Mm00443260_g1) 、 IL-1β (Il1b, Mm00434228_m1)、monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1) (Ccl2, Mm00441242_m1)（ CSF1R 阻 害 薬 投 与 実 験 に お い て は IL-1β の み 測 定 し た ）。ま た 、18S rRNA（ Rn18s, Mm03928990_g1）を 内 在 性 コ ン ト ロ ー ル と し て ⽤ い た 。

7900HT Fast Real-Time PCR System （ Applied Biosystems, Massachusetts, USA）を ⽤ い て Δ Δ CT 法 に よ り 逆 転 写 ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 （ RT-PCR; reverse transcription- polymerase chain reaction） 解 析 を ⾏ な っ た 。 各 因 ⼦ の mRNA レ ベ ル は 18S rRNA を 基 準 と し た 相 対 発 現 量 で ⽰ し た 。

2.2.5 ヘ マ ト キ シ リ ン /エ オ ジ ン 染 ⾊

空 気 ま た は 低 酸 素 曝 露 後 に 、各 群 の マ ウ ス を イ ソ フ ル ラ ン 吸 ⼊ 下 、過 量 の ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル に よ る 深 ⿇ 酔 下 で 、リ ン 酸 緩 衝 4%PFA で 灌 流 固 定 し た 。脳 お よ び 眼 球 を 摘 出 し 、眼 球 か ら ⾓ 膜 と ⽔ 晶 体 を 除 去 し た 後 、 同 じ 固 定 液 に 4℃ で ⼀ 晩 浸 漬 固 定 し た 。次 に 標 本 を パ ラ フ ィ ン 包 埋 し た 後 、 5 μ m な い し 10 μ m 厚 の 切 ⽚ を 作 成 し 、 ヘ マ ト キ シ リ ン /エ オ ジ ン（ HE; hematoxylin and eosin）染 ⾊ と 後 述 の 免 疫 組 織 科 学 染 ⾊（ IHC;

immunohistochemistry）に 供 し た 。網 膜 各 層 の 厚 さ を ３ 箇 所（ 視 神 経 乳 頭 か ら 250 μ m、300 μ m、400 μ m）で 測 定 し 、こ れ ら の 平 均 値 を デ キ サ メ タ ゾ ン 投 与 実 験 に お け る 各 群 で ⽐ 較 し た 。

2.2.6 パ ラ フ ィ ン 切 ⽚ の 免 疫 組 織 化 学 染 ⾊

ア ス ト ロ サ イ ト /ミ ュ ラ ー 細 胞 は グ リ ア 細 胞 特 有 の 中 間 径 フ ィ ラ メ ン ト タ ン パ ク 質 の １ つ で あ る GFAP(glial fibrillary acidic protein)を 発 現 し て お り 、 環 境 の 変 化 に 応 じ て GFAP 強 陽 性 を 特 徴 し た 活 性 化 を ⽰ す た め 、 GFAP は 両 細 胞 の 活 性 化 マ ー カ ー と し て 広 く ⽤ い ら れ て い る (113)。

ま た ミ ク ロ グ リ ア の マ ー カ ー と し て ionized calcium binding adapter molecule 1（ Iba-1）(114)、CD11b、CD45、CX3CR1、F4/80、CD68、

CD40 な ど が 知 ら れ て い る が 、活 性 化 の 有 無 に 関 わ ら ず 恒 常 的 に 発 現 し 、 多 く の 研 究 で ミ ク ロ グ リ ア の 形 態 変 化 の 観 察 に 利 ⽤ さ れ て い る こ と か ら 、我 々 は Iba-1 を ミ ク ロ グ リ ア の マ ー カ ー と し て ⽤ い た 。な お 、Iba- 1 は ア ク チ ン 構 造 再 編 成 の 調 節 に 作 ⽤ し 、ミ ク ロ グ リ ア の 細 胞 運 動 能 を 制 御 す る 分 ⼦ で あ る こ と が 知 ら れ て い る (115)。

各 群 か ら 得 ら れ た パ ラ フ ィ ン 切 ⽚ を ⽤ い て 、GFAP お よ び Iba-1 を ⽤ い た IHC を ⾏ な っ た 。 パ ラ フ ィ ン 切 ⽚ を キ シ レ ン で 脱 パ ラ フ ィ ン し た 後 、 脱 マ ス キ ン グ 剤 (Vector, CA, USA)に 浸 し 、 １ 分 間 オ ー ト ク レ ー ブ

（ 120 ℃ ） を ⾏ な っ た 。 冷 却 と PBS で の 洗 浄 の 後 、 内 因 性 ペ ル オ キ シ タ ー ゼ 阻 害 剤（ Dako, Golstrup, Denmark）と 共 に 15 分 間 、続 い て 2.5%

ウ マ ⾎ 清 と 共 に 45 分 間 、室 温 で イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。１ 次 抗 体 反 応 は 、

抗 GFAP 抗 体 （ Thermo Fisher Scientific, MA, USA）（ 1:250 希 釈 ） お よ び 抗 Iba-1 抗 体 （ Wako,⼤ 阪 ）（ 1:1000 希 釈 ） を ４ ℃ で ⼀ 晩 ⾏ っ た 。 PBS で 洗 浄 し た 後 、ス ラ イ ド を ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 結 合 ポ リ マ ー 2 次 抗 体

（ ImmPRESS reagent; Vector, CA, USA） と 共 に 室 温 で 45 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し 、3,3ʼ-ジ ア ミ ノ ベ ン ゼ ン で 発 ⾊ さ せ 、核 を ヘ マ ト キ シ リ ン で 対 ⽐ 染 ⾊ し た 。

2.2.7 網 膜 伸 展 標 本 の 免 疫 組 織 化 学 染 ⾊

上 述 と 同 様 の ⽅ 法 で デ キ サ メ タ ゾ ン 投 与 実 験 に お け る 各 群 か ら 眼 球 を 摘 出 し 、 網 膜 を 採 取 し た 。 網 膜 を 0.1% tween-20 含 有 PBS（ PBT）

で 洗 浄 し 、 2.5%ウ マ ⾎ 清 と 共 に 3 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 1 次 抗 体 反 応 は 、Iba-1 抗 体（ 1:2000 希 釈 ）を ４ ℃ で 3 ⽇ 間 ⾏ な っ た 。PBT で 洗 浄 し た 後 、FITC 結 合 2 次 抗 体 (Vector)（ 1:200 希 釈 ）と 共 に 暗 所 で 1 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。標 本 を PBT で よ く 洗 浄 し た 後 、Fluoromount- G（ Southern Biotech, AL, USA）を 乗 せ た ス ラ イ ド ガ ラ ス 上 で 伸 展 さ せ 、 蛍 光 顕 微 鏡 (Keyence BZ-8000)を ⽤ い て 観 察 し た 。

2.2.8 透 過 型 電 ⼦ 顕 微 鏡 観 察 と ラ ン タ ン ト レ ー サ ー 実 験 ⾎ 管 バ リ ア 破 綻 の 様 ⼦ を 画 像 で 確 認 す る た め に 、 ⾼ 電 ⼦ 密 度 の ラ ン タ ン 塩 を ⾎ 管 内 ト レ ー サ ー と し て ⽤ い た 透 過 型 電 ⼦ 顕 微 鏡 （ TEM;

transmission electron microscope） 観 察 を ⾏ な っ た 。

空 気 ま た は 低 酸 素 曝 露 後 に 、 デ キ サ メ タ ゾ ン 投 与 実 験 に お け る 各 群 の マ ウ ス を イ ソ フ ル ラ ン 吸 ⼊ 下 、 過 量 の ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル に よ る 深

⿇ 酔 下 で 既 報 (116)を 参 考 に 灌 流 固 定 し た 。ま ず 、1% NaNO3(2ml)を 灌 流 し 、 次 に 10 ml の ラ ン タ ン 溶 液 (20 mM La(NO3)3・ 6H2O、 80 mM NaCl、 3.5 mM KCl、 1.0 mM CaCl2、 1.0 mM MgCl2、 1.0 mM glucos；

pH 7.4)を 10 分 か け て 灌 流 し た 。 続 い て 硫 酸 塩 （ 43 mM Na2SO4、 16 mM NaHCO3、 10 mM sodium acetate、 3.5 mM KCl、 1.0 mM CaCl2、 1.0 mM glucose 、 1.6 mM Na2HPO4、 0.4 mM NaH2PO4, 、 33 mM sucrose；pH 7.4）を 含 む 10 ml の 2%グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド お よ び 2%PFA

で 灌 流 固 定 し た 。眼 球 を 摘 出 し 、⾓ 膜 と ⽔ 晶 体 を 除 去 し た 後 、同 じ 固 定 液 に 4℃ で ⼀ 晩 浸 漬 固 定 し た 。次 に 2%四 酸 化 オ ス ミ ウ ム ⽔ 溶 液 中 で 1.5 時 間 固 定 し た 。 Epon812 に 包 埋 し た 後 、 酢 酸 ウ ラ ニ ル で 染 ⾊ し た 超 薄 切 ⽚ を TEM（ Type 1400plus; JOEL,東 京 ） で 観 察 し た 。

2.2.9 眼 底 の 観 察

空 気 ま た は 低 酸 素 曝 露 後 に 、 デ キ サ メ タ ゾ ン 投 与 実 験 に お け る 各 群 の マ ウ ス を イ ソ フ ル ラ ン 吸 ⼊ 下 、ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル（ 50 mg/kg）の 腹 腔 内 注 射 を ⾏ い 、 0.5%ト ロ ピ カ ミ ド 点 眼 （ ミ ド リ ン -P®; 参 天 製 薬 , ⼤ 阪 ）を ⽤ い て 散 瞳 し た 。ヒ ド ロ キ シ エ チ ル セ ル ロ ー ス ゲ ル（ ス コ ピ ゾ ル

®; 千 寿 製 薬 , ⼤ 阪 ） を 眼 に 点 ⼊ し 、 網 膜 イ メ ー ジ ン グ 顕 微 鏡 （ Micron

Ⅳ ®; Phoenix Research Laboratories, CA, USA）で 眼 底 写 真（ FP; fundus photography）を 撮 影 し た 。そ の 後 、FITC（ 100 mg/ml）（ Fluorescite®;

ノ バ ル テ ィ ス フ ァ ー マ , 東 京 ）を 0.05 ml 腹 腔 内 注 射 し 、蛍 光 眼 底 ⾎ 管 造 影 （ FFA; fluorescein fundus angiography） を 施 ⾏ し た 。 FFA で 得 ら れ た 画 像 を 元 に 、視 神 経 乳 頭 か ら 等 距 離（ 視 神 経 乳 頭 の 直 径 の ２ 倍 ）に お け る 乳 頭 周 囲 の ⾎ 管 径 （ 太 い 順 に ８ 本 ） を 測 定 し た 。

2.2.10 Iba-1 陽 性 細 胞 （ ミ ク ロ グ リ ア ） の 数 の 測 定

空 気 ま た は 低 酸 素 曝 露 後 に 、上 述 と 同 様 の ⽅ 法 で CSF1R 阻 害 薬 投 与 実 験 に お け る 各 群 マ ウ ス か ら 脳 と 網 膜 を 採 取 し 、 Iba-1 の IHC を ⾏ な っ た 。１ つ の 脳 サ ン プ ル（ 右 ま た は 左 半 球 ）か ら ３ つ の エ リ ア（ 海 ⾺ 周 辺 、⼩ 脳 、⼤ 脳 ⽩ 質 ）の 画 像 を 取 得 し 、各 画 像 内 の Iba-1 陽 性 細 胞 の 数 を 測 定 し た 。

2.2.11 統 計 解 析

全 て の 統 計 解 析 に は jmp pro14（ SAS institute inc., NC, USA） を 使

⽤ し た 。デ ー タ は 平 均 値 ±標 準 偏 差 で ⽰ し た 。平 均 値 の ⽐ 較 は 、対 応 の な い ⼀ 元 配 置 分 散 分 析 に よ り 有 意 性 を 確 認 し た の ち 、 多 重 ⽐ 較 に は Tukey 検 定 を ⽤ い た 。 有 意 ⽔ 準 は 5%未 満 と し た 。