ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 を コ ン ト ロ ー ル 血 清 に 使 用 し た
MyccphlsmapneumoniaeELISA診
断 法 に つ い て
国立 予 防 衛生 研 究所 生 物 製 剤管 理 部1) 神 奈 川 県衛 生 研 究所 細 菌 病 理部2) 佐 々 木 裕 子1)岡 崎 則 男2)佐 々 木 次 雄1) (平成1年6月14日 受 付) (平成1年9月12日 受理)Key words:
Mycoplasma pneumoniae,
ELISA, Serodiagnosis,
Immunoblotting
要 旨 1,000人 以 上 の健 康 者 血 漿 を プ ー ル し て 製 造 さ れ る ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リン 製 剤 は,健 常 者 血 清 中 に見 出 さ れ る 抗 体 を 平 均 的 に 含 有 して お り,晦coplasmapneumoniae抗 体 の 存 在 もELISAお よ び イ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ン グ に よ っ て 明 ら か に な っ た 。 供 試 し た ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン製 剤10ロ ッ ト中 のM.pneumoniae-ELISAIgG抗 体 価 は,ほ ぼ 同 一 で あ っ た.そ こで,本 製 剤 をM.pneumoniae-ELISAIgG抗 体 測 定 用 コ ン ト ロ ール 血 清 と し て 用 い,健 康 者 な ら び にM .pneumoniae感 染 患 者 血 清 中 のELISA-IgG抗 体 価 を 測 定 しCFお よ びIHA抗 体 価 と比 較 検 討 し,考 察 し た.
緒
言
現 在,M.pneumoniae感
染 症 の血 清 診 断 法 と し
て 間 接 赤 血 球 凝 集(IHA)試
験,補 体 結 合(CF)
試 験 が 広 く用 い られ て い るが,ク
ラス 別 イ ム ノグ
ロ ブ リ ンを 測 定 で き るELISAも
導 入 さ れ つ つ あ
る.一 般 に 屈pneumoniae感
染 初 期 に はIgM抗
体 の上 昇 が 見 られ る こ と よ り,IgM抗
体 測 定 に よ
る 早 期 診 断 の 有 用 性 が 報 告 さ れ て い る が1)2),急
性 期 にIgM抗
体 価 が 低 値 で,IgG抗
体 価 が 高 値
を 示 す 患 者 も稀 で は な い.M.pneumoniae感
染 症
患 者 の 抗 体 価 測 定 にELISAが
普 及 す れ ば,M.
pneumoniae感
染 の 免 疫 応 答 に 関 し,よ
り多 くの
情 報 を得 る こ とが 可 能 で あ る.し か し,ELISAを
行 う際 問 題 と な る の は,健 康 者 血 清 中 に もM.
pneumoniae抗
体 が 存 在 す る こ と3),個 々 の測 定 者
に よ り結 果 の 判 定,測
定 値 の表 示 方 法 が 異 な る こ
と等 か ら デ ー タ の 相 互 比 較 の で き な い こ とで あ
る. 1,000人 以 上 の 健 康 者 血 漿 を プ ー ル し て 製 造 さ れ た ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 中 に は,M.pneumo-niae抗 体 が 存 在 し4),ロ ッ ト間 で の 差 が ほ と ん ど 無 い の で5)こ れ をM.pneumoniae-ELISAIgG抗 体 価 測 定 用 コ ン ト ロ ー ル 血 清 と し て 用 い,抗 体 価 表 示 の 標 準 化 に つ い て 検 討 し た. 材 料 と方 法 1.免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 筋 注 用 ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤(蛋 白 濃 度150 mg/ml),3メ ー カ ー,10ロ ッ トを 用 い た. 2.被 検 血 清 健 康 者 血 清115例(採 血 時 に 呼 吸 器 感 染 症 に 罹 患 し て い な か っ た 者)及 び ルr.pneumoniae感 染 患 者 血 清88例(咽 頭 か ら のM.pneumoniae分 離,単 -一血 清 のIHA抗 体 価160倍 以 上 ,CF抗 体 価40倍 以 上,ペ ア 血 清 の 抗 体 価 上 昇 率4倍 以 上 の い ず れ か 一 つ で も 満 た す 者 の 血 清)を 用 い た. 3.ELISA M.pneumoniaecelllysate(蛋 白 濃 度20μg/ml) 別 刷 請求 先:(〒141)品 川 区上 大 崎2-10-35 国 立予 防 衛 生研 究 所 生 物製 剤 管 理部 佐 々木裕 子 平 成2年4月20日488 佐 々木裕 子 他 をELISA抗 原 と し,健 康 者 血 清 は1/100∼1/800, 患 者 血 清 は1/100∼1/6,400,免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 は25μg/lnl∼800μg/ml濃 度 にPBS-0.05%, Tween20-1%牛 血 清 ア ル ブ ミ ン(PBS-Tween-BSA)に て 連 続 二 倍 希 釈 し た も の を 用 い 室 温 に て 2時 間 反 応 させ た.第 二 抗 体 に は,ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 標 識 抗 ヒ トIgGヤ ギ 血 清(ICNIm・ munobiologicals,LotNo.E609),基 質 は0.1% p-Nitrophenylphosphate(SigmaChemicalCo., USA)を 用 い,室 温 で45分 間 反 応 さ せ た.吸 光 度 の 測 定 はELISAAnalyzer(ETY-96,Toyo SokkiCO.,Ltd,Tokyo)に よ り405nmで 行 っ た. 測 定 す る プ レ ー ト毎 に,血 清 の 希 釈 列 と 同 時 に 免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 の 各 濃 度 液 を 測 定 し,製 剤25 μg/ml濃 度 液 の 示 すELISA-OD値 を カ ッ ト値 と し,そ の 値 を 示 す 最 大 の 希 釈 倍 数 の 逆 数 を も っ て ELISA抗 体 価 と し た. 4.SDS-PAGEと イ ム ノ ブ ロ ッ テ ィ ン グ M.pneumoniaecelllysatesを40,000×gで60 分 間 遠 心 し,得 ら れ た 膜 画 分 を5μg/ml蛋 白 濃 度 に な る よ うにsamplebuffer(0.0625MTris-HCI, 2%SDS,5%2-Mercaptoethanol,10%Glycer-ol,pH6.8)に 加 え,100℃ で3分 間 可 溶 化 し た. こ の 抗 原 を8.75%濃 度 ゲ ル に ウ ェル あ た り20μl を,Laemmli6)の 方 法 で 泳 動 し た.泳 動 後,Towbin ら7)の 方 法 で ゲ ル か ら ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 (HAWP314FO,Millipore)へ 転 写 し た.転 写 後, ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を1%ス キ ム ミル ク/PBSに 2時 間 浸 し ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た.抗 体 と し て, ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤,M.pneumoniae感 染 患 者 血 清 お よ び 健 康 者 血 清 を 用 い た.製 剤 はIgG濃 度 を500μg/lnlと1,000μg/mlに,血 清 はPBS-Tween-BSAに て400倍 に 希 釈 し,ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 と 室 温 で1時 間 反 応 さ せ た.PBSで 洗 浄 後, 二 次 抗 体 と し て ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 抗 ヒ トIgG ヤ ギ 抗 体(CappelLab.Lot#20434,USA)1,000 倍 希 釈 液(PBS-Tween-BSAに て 希 釈)を 用 い, 室 温 で2時 間 反 応 さ せ た.PBSで 洗 浄 後,基 質 液 (0.5%4-Chloro-1-Naphthpl,0.75%H2O2,Citrate buffer,pH6.0)中 に て 発 色 さ せ た. 結 果 1.イ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ン グ に よ る ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 中 のM.pnemoniae抗 体 の 証 明 ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 中 な ら び に 財.pneumo-niae感 染 患 者 血 清 中 に はM.pneumoniaeの 特 異 抗 体169,60,55お よ び41-kDa・ ミン ドが 認 め られ た(Fig.1).ま た,ELIsA抗 体 価1,600倍 の 健 康 者 血 清 中 に,細 胞 付 着 に 関 与 す るP1蛋 白(169 KDa)に 対 す る 抗 体 が,わ ず か で は あ る が 存 在 し, 近 い 過 去 にM.pneumoniae感 染 の あ っ た こ と が 示 唆 さ れ た. 2.ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リン 製 剤 濃 度 と抗M.pneu-moniaeELISA吸 光(OD)値 と の 関 係 ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 濃 度25μg/mlか ら800 μg/mlに お い て 製 剤 濃 度 とELISA-OD値 の あ い だ に 良 好 な 直 線 関 係 が 見 ら れ た(Fig.2).供 試 し た10ロ ッ ト と も,同 じ 条 件 下 で ほ ぼ 同 じ値 を 示 し た.そ こ で,25μg/ml濃 度 の ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 のOD値 を カ ッ ト値 と し,そ の 値 を 示 す 被 検 血 清 の 最 大 希 釈 倍 率 の 逆 数 を も っ てELISA抗 体
Fig. 1 Anti-Mycoplamsa pneumoniae antibodies
found in human-normal immunoglobulin product
by Western blotting
Lane 1: marker, 2: M. pneumoniae membrane
proteins stained with coomassie brilliant blue, M.
pneumoniae membrane proteins reacted with 3:
healthy human serum, 4: patient' serum of M.
pneumoniae
infection,
5: human
normal
im-munoglobulin product 500ug/ml, 6: human
nor-mal immunoglobulin product 1,000ug/m1
Fig. 2 ELISA activity of human normal im-munoglobulin product (human IgG) against Mycoplasma pneumoniae
human lgG〔μg/ml)
Fig. 3 Relationship
between
ELISA
OD and
ELISA titers of patients' sera diluted to 1/100 and
1/800
Mean of ELISA OD of M. pneumoniae patients'
sera diluted to 1/100 (S), 1/800 (A) and human
normal immunoglobulin
product
(human IgG)
(A). Each bar indicates the 95%confidence limits
at the mean.
ELlSA titer 価 と し た. 3.ELISAOD値 に お け る 患 者 血 清 の 希 釈 倍 数 と ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 濃 度 と の 関 係 そ れ ぞ れ のELISA抗 体 価 血 清 を1/100及 び1/ 800に 希 釈 し,そ れ ら の 平 均ODと 平 均OD値 の 95%信 頼 限 界 をFig.3に 示 し た.Fig.3に は,同Fig. 4 Differences in ELISA titers of 115 healthy human sera by age in years
□: sera from under five years old, ■: sera from more than 6 years old
ELISA titer
Table 1 Comparison of antibody titers for M. pneumoniae by CF, ELISA and IHA
ND: not done 時 に 測 定 し た25∼200μg/ml濃 度 の ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 の 平 均OD値 を 示 した.ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ソ 製 剤 濃 度 とOD値 と の 間 に は 相 関 が あ り, 800倍 希 釈 血 清 のOD値 で 比 較 し た 場 合,25μg/m1 の ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 のOD値 に 匹 敵 す る ELISA抗 体 価 は800倍,同 様 に25μg/ml<OD <50 μg/miは1,600倍,50μg/ml<OD< 100μg/m1は 3,200倍 のEHSA抗 体 価 に 相 当 し た. 4.健 康 者 血 清 中 のM.pneumoniae-ELISA IgG抗 体 価 の 年 齢 別 比 較 健 康 者 血 清115例 に つ い て 年 齢 別M, pneumo-niae-ELISAIgG抗 体 価 を 調 べ た.5歳 以 下 と6 歳 以 上 の 年 齢 層 を 比 べ る と,被 検 血 清 の う ち5歳 以 下 で はM.pneumoniae-ELISAIgG抗 体 価 が 400倍 以 上 を 示 す も の は 存 在 し な か っ た が,6歳 以 平成2年4月20日
490
佐 々木裕子 他
上 で は72.9%が400倍 以 上 の 抗 体 価 を 示 し た(Fig. 4).
5.CFお よ びIHAとELISA抗 体 価 と の 比 較 H. pneumoniae感 染 症 患 者 血 清 のELISA IgG 抗 体 価 は,100倍 以 下 と低 い も の か ら,12,800倍 以 上 ま で 分 布 し,800倍 以 上 の 抗 体 価 を 示 す 血 清 の 割 合 は80.7%で あ っ た.こ れ は,CF抗 体 価40倍 以 上 の 占 め た87.5%に つ ぎ,IHA抗 体 価80倍 以 上 の 61.4%よ り高 値 で あ っ た(Table1). 考 察 ELISAは 抗 体 検 出 感 度 が 高 く,操 作 も簡 便 で, さ ら に 抗 体 の ク ラ ス,サ ブ ク ラ ス 毎 の 測 定 も 可 能 な こ と よ り,臨 床 的 に 種 々 の 感 染 症 の 診 断 に 用 い ら れ て い る.M. pneumoniaeの 血 中 抗 体 は,生 後 数 年 間 は 低 く学 齢 期 に な る に つ け 高 く な る こ と は,す で に 報 告 さ れ て お り8)9),患 者 数 の 年 齢 層 別 分 布 に お い て も 学 齢 期 に 分 布 の 多 い こ と が 知 ら れ て い る.感 染 か ら肺 炎 症 状 に 到 る ま で の 過 程 に つ い て は 十 分 明 ら か に さ れ て い る と は 言 い 難 く,血 清 抗 体 測 定 にEHSAを 用 い る こ と は 診 断 に 有 用 な だ け で な く,本 症 の 発 症 機 構 を 知 る 上 で も 意 義 深 い. 今 回 我 々 は,M. pneumoniae感 染 症 の 血 清 診 断 に お け るELISA抗 体 測 定 法 の 標 準 化 を 目 的 と し て,ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 を コ ン ト ロ ー ル 血 清 と し て 使 用 す る こ と に 着 目 し 検 討 を 行 っ た 結 果, ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 中 にM. pneumoniae特 異 抗 体 が 平 均 的 に,ロ ッ ト間 の 差 な く 存 在 す る こ と がELISA,イ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ン グ に よ っ て 明 ら か に な っ た.こ の グ ロ ブ リ ン 製 剤 は,1,000人 以 上 の 健 康 者 血 漿 を 集 め て 製 造 さ れ,IgG含 有 量95% 以 上 と精 製 度 が 高 く,容 易 に 入 手 で き,4℃ に て 長 期 間 安 定 で あ る こ と よ り,こ の 製 剤 をM. pneumoniaeの み な ら ず 各 種 病 原 体 に 対 す る ELISA抗 体 価 測 定 用 コ ン ト ロ ー 血 清 と し て 使 用 す る こ と が 可 能 と考 え られ る. 今 回 の 方 法 で 測 定 し たELISA抗 体 価 の 陽 性 基 準 と し て は,M. pneumoniae感 染 患 者 の80.7%を と ら え る 抗 体 価800倍 に 注 目 し た.こ の 基 準 で は5 歳 以 下 の 健 康 者 は す べ て 陰 性 で,6歳 以 上 の 健 康 者 の13.5%が 陽 性 で あ っ た.従 っ て,EHSA抗 体
価800倍 以 上 を 示 す 患 者 はM. pneumoniae感
染
の 可 能 性 が 高 く,こ の 抗 体 価 を 陽 性 基 準 とす るの
が 適 当 で あ る と考 え られ る.
正 確 なELISA抗
体 価 を 知 るた め に は,段 階 希
釈 を して 抗 体 価 を 求 め る必 要 が あ るが,血 清 希 釈
点 を 数 多 く と る こ とは煩 雑 で あ る.ヒ
ト免 疫 グ ロ
ブ リン製 剤 濃 度 とOD値
との 間 に 相 関 が 認 め られ
た の で,こ
のOD値
と一 点 希 釈 血 清 のOD値
との
比 較 に お い て 抗 体 価 を 推 定 で き る.今 回,100傍 希
釈 血 清 と800倍 希 釈 血 清 を 用 い,陽 性 基 準 値 に相 当
す るOD値
を 比 較 し た 結 果,100倍
希 釈 血 清 で は
OD値
が全 体 に高 い た め,抗 体 価 の 高 い血 清 や,使
用 す る第 二 抗 体 の 力 価 の高 い 場 合 に判 読 可 能 限 界
を越 えて し ま う可 能 性 が あ った.そ れ に比 べ て800
倍 希 釈 血 清 のOD値
は,検 出 可 能 な範 囲 に あ り,
一 点 希 釈 の場 合
,100倍
よ り も800倍 が 適 して い る
と考 え ら れ た.800倍
希 釈 血 清 のELISA抗
体 価
800倍 を示 すOD値
は,ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リン製 剤 の
25μg/ml濃
度 のOD値
に 相 当 した.
これ らの こ とよ り,ヒ
ト免 疫 グ ロ ブ リン製 剤 は
ELISAに
よ るM. pneumoniae抗
体 価 測 定 に お
け る コ ン トロー ル血 清 と して使 用 可 能 で あ り,こ
れ を 用 い てELISA抗
体 価 を 表 す こ と に よ って,
各 測 定 者 に よ るELISA抗
体 価 の 相 互 比1較が 可 能
に な る こ とが 示 唆 され た.
文
献
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ELISA
Diagnosis
for Mycoplasma
pneumoniae
Infection
with Human
Normal
Immunoglobulin
Products
as Control
Sera
Yuko SASAKI & Tuguo SASAKI
Department of Biologics Control, National Institute of Health
Norio OKAZAKI
Department of Bacteriology and Pathology, Kanagawa Prefectural Public Health Laboratories
It was found that the human
normal
immunoglobulin
G product,
prepared
from pooled plasma
of
at
least
1,000 normal
human
donors,
contained
some
specific
IgG antibodies
to Mycoplasma
pneumoniae
by Western
blotting.
M. pneumoniae-ELISA
OD values
increaed
linearly
from 25 to 800
μg/ml
