博 士 （ 農 学 ） 和 久 田 真 司
学 位 論 文 題 名
植物の病傷害応答に関与するp −glucosidase の 酵素機能ならびに生理機能に関する研究
学位論文内容の要旨
糖 質加 水分 解 酵素 撒多 様な 構 造や 機能 を持 つ糖 質 の代謝に関わ る．その主な生理機能の1っ とし て植物ホルモン配糖体の活性化が挙げられる．幾っかの植物ホルモン(abscisic acid，gibberellin, auxm， c皿obnin，brassmost．er。id等）には配糖体が存在し、アグリコンとの相互変換はglucosyltransferase とp‐glucosidaseが担う ，シグナル物質の生合成に は数段階の酵素反応を必要と するが，配糖体は安 定な非活性体として貯蔵 され，必要に応じてp・glucosidaseによる一段の反応に より脱配糖化されて 活性体として供給される ，また，細胞内における活 ´陸化物質の濃度調整も担う と考えられている．
し か し な が ら ， 植 物 ホ ル モ ン 配 糖 体p‐glucosidaseと し て の 機 能 は 未 知 の 部 分 が 多 い ． tuberomcacid（TA）お よびその配糖体（tuberonjcacidp＿glucoside：TAG）は ，塊茎形成を誘導す る化 合物 とし て バレ イシ ョか ら 単離 され ，病 傷害 ス トレ スの 防御 応答 に 関与 する植物ホルモ ンの jasnlomcacid（JA） から 合成 されるこ とが知られている．近年，TAはシロイヌナズナやトマト にお いてJA生 合成 ・ 代謝 関連 遺伝 子の発現 を調節することが報告され， バレイショ以外の植物にお いて も生 理機 能が 示 され た． 加え て，TAは 傷害時に傷害葉から非傷害葉 に輸送される．これらのこ とは TAの 輸 送 が 防 御 応 答 に お け る 重 要 な 機 能 を 担 う こ と を 示 唆し てい る． こ れま でTAからTAGを生 成す る酵 素は 同 定さ れて いる が ，TAGを分 解 してTAに 変換するp‐glucosidaseについては存在 すら 明ら かに され て いな かっ た． 本研究で はTAGplglucosidaseを同定し ，酵素機能および生理機能 を解 明することを目的とした．
1． TAGpーglucosidaseの 精製
TAGがTAに 加 水 分 解 さ れ る こ と を 重 水 素 標 識 のTAG (TAG‑d5)を 用 い た 代 謝 実 験 で 明 ら か に し た ． す な わ ち ，u｝LC‑MS/MSに よ りTAG‑d5処 理 し た 登 熟 期 の イ ネ で はTAG‑d5とTA‑d5が 検出 さ れた ，
次 に ， 活 性 本 体 で あ るTAG p‑glucosidase (OsTAGG)を 精 製 し た ．TAG加 水 分 解 活 性 は ，CM Sepharoseカ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ イ ー に よ り 低 濃 度NaClに 溶 出 す る 画 分OsTAGGlと高 濃度NaCl に 溶 出 す る 画 分OsTAGG2に 分 離 され た ．前 者を5種 類の カラ ムク ロ マト グラ フイ ー に供 し， 精製 倍 率4300倍 でOsTAGGl 0.065 mgを 得た ．ま た， 後者 を6種類のカラ ムクロマトグラフイーに供し ， 精 製倍 率2800倍 でOsTAGG2 0.025 mgを 得た ．
―1362―
2． TAGpーglucosidaseの 同 定
OsTAGGlはSDS‑PAGEに よ り 分 離 さ れ る42 kDaお よ び25 kDaの2本 の ポ り ペ プ チ ド 鎖 か ら な り ，OsTAGG2は40kDaお よ び26kDaの2本 の ポ り ペ プ チ ド 鎖 か ら な る ，N末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 解 析 お よ びpepndemassfhlgerp血 血 g解 析 の 結 果 ，OsTAGG1お よ び OsTAGG2は そ れ ぞ れ Os0490474900お よ びOs0490474800に コ ー ド さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 と 一 致 し た ． ま た ，OsTAGGlお よ びOsTAGG2は そ れ ぞ れGり355お よ びGly359のN末 端 側 で 切 断 さ れ る こ と が 明 ら か に な っ た ， 0sTAGG1お よ びOsTAGG2の ア ミ ノ 酸 配 列 は85％ 一 致 し ，glycosidchydrolasefarnjり1（ （m1）に 属 す るp．glucosidascに お い て 保 存 性 が 高 い 領 域 が 認 め ら れ た ． ま た ，OsTAGG1お よ ぴOsTAGG2は ， GH1酵 素 の 触 媒 残 基 （ 一 般 酸 塩 基 触 媒 残 基 お よ び 求 核 触 媒 残 基 ） ， す べ て のGHlの メ ン バ ー で 保 存 さ れ て い る グ リ コ ン と の 結 合 を 担 う ア ミ ノ 酸 残 基 も 保 存 さ れ て い た ， 以 上 の こ と か ら ，0sTAGG1 お よ び OsTAGG2は （ m1に 属 す る 酵 素 群 の 共 通 構 造 を 有 す る こ と を 明 ら か に し た ．
3． TAGp一glucosidaseの酵素機能解析
OsTAGGlお よ びOsTAGG2の 基 質 特 異 性 を 調 べ る た め に ， 種 々 の 配 糖 体(TAG，MeTAG，jasmonyl i‑p‑glucoside，salicylic acid glucoside，zeatin glucoside，linamarin，pNPp・glucoside，pNPp‐galactoside， pNpp‐mannoside， お よ びPNPp￣cellobioside） に 対 す る 活 性 を 測 定 し た ． そ の 結 果 ，OSTAGG1お よ びOsTAGG2は ，m岬p．glucosideに 対 し て 最 も 高 い 活 性 を 示 し た ， 天 然 の 配 糖 体 で はTAGに 対 す る 活 性 が 最 も 高 か っ た ．0sTAGG1のTAGに 対 す る 聡 は31．7叫 で あ り ， 臨 ー は14．7岬101／min′mg で あ っ た ． 一 方 ，OsTAGG2の 轟 は146uMで あ り ， 臨 ‥ は38．0岬01/min/mgで あ っ た ． こ の こ と から，OsTAGGlのTAGに対する親和性は0sTAGG2よりも高いことが明らかになった．
OsTAGG1お よ びOsTA（iG2の 細 胞 内 局 在 性 を 解 析 し た と こ ろ ， 両 酵 素 は 細 胞 膜 に 不 均 一 に 存 在 し た ． ま た ， 細 胞 質 に お い て 網 目 状 の シ グナ ル も 観 察 さ れた こ と か ら ，endoplasrnicrぬclnumにも 存 在 することが判明した．
4． 病 傷 害 応 答 に お け る JA，TAお よ び TAGの 代 謝 お よ び TAGp−glucos idaseの 生 理 機 能 TAお よ びTAGの 代 謝 お よ び 生 理 機 能 に 関 す る 知 見 は 少 な い ， し か し ，JAと 同 様 に 病 傷 害 応 答 に 関 与 す る と 予 想 さ れ ， 病 傷 害 ス ト レ ス に 対 す るJA，TAお よ びTAGの 内 生 量 の 変 化 を 解 析 し た ． 傷 害 に 対 す るJA類 の 内 生 量 を 定 量 し た ． 傷 害 後0.5時 間 でJAが 検 出 さ れ ， そ の 内 生 量 は 傷 害 後 1時 間 で 最 大 と な っ た(3.29士0.66 nmol/g FW).ま た ，TAお よ ぴTAGの 内 生 量 を 調 ぺ た ． 両 化 合 物 はJAが 減 少 す る に っ れ て 徐 々 に 蓄 積 し ，4時 間 後 にTAの 内 生 量 が 最 大 と な っ た(1.03士0.19 nmoUg FW).ま た ， TAGは 8時 間 後 に 内 生 量 が 最 大 と な っ た (9.95士 0.41 nmol/g FW).
い も ち 病 菌 接 種 に 対 す るJA類 の 内 生 量 を 定 量 し た ． 胞 子 散 布 後 ，JAの 内 生 量 は 徐 カ に 増 加 し ， 72時 間 後 に 最 大 と な っ た(0.16士0.018 nmol/g FW).ま た ，TAお よ びTAGの 内 生 量 に つ い て は ， TAの 内 生 量 が 感 染 に よ り わ ず か に 上 昇 し ，TAGの 内 生 量 はJAと ほ ば 同 様 の 蓄 積 パ タ ー ン を 示 し た ， 72時 間 後 にTAGの 内 生 量 が 最 大 と な っ た(4.49士0.77 nmol/g FW).
さ ら に ， 病 傷 害 ス ト レ ス に よ るOs TAGG1お よ びOs TAGG2の 転 写 産 物 へ の 影 響 を り ア ル タ イ ム PCRに よ っ て 解 析 し た ． そ の 結 果 ， 傷 害 時 のOs TAGG1の 発 現 は 傷 害 前 に 比 べ て 抑 制 さ れ ，Os TAGG2 の 発 現 は 誘 導 さ れ た ． ま た ， い も ち 病 菌 が 感 染 す る こ と に よ り ，Os TAGGお よ びOs TAGG2の 転 写
産物はいずれも徐々に増加することが明らかになった．
いもち病菌の感染により，Os TAGG1の発現が誘導されたことから，GUS染色による、いもち病 菌感 染によるイネ組織のOsTAGG1の発現を解析した．その結果，いも ち病菌の感染により，
OsTAGG1
は病斑付近の維管束で誘導されることが明らかになった，導管もしくは篩管で，TAが輸 送されることから，OsTAGGl
は病害時に維管束細胞内でTAGを分解し，TAを木部もしくは師部 ーと輸送する働きを担うと推定された．学 位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査 副査
教授 客員教授 准 教 授 准 教 授 助教
松井 今井 松浦 森 佐分利
博和 亮三 英幸 春英
亘
学位論文 題名
植物の病傷害応答に関与する p ―glucosidase の 酵素機 能ならび に生理 機能に関する研究
本論 文 は， 図
44
， 表16
，引 用文献119
を含み，4
章から なる総べー ジ112
の和 文論 文 で ある ． 別に 参 考論 文2
編 が 添え ら れて い る 。糖質加水分解酵素は多様な構造や機能を持つ糖質の代謝に関わる．その主な生理機能の
1
っとして植物ホルモン配糖体の活性化が挙げられる．幾っかの植物ホルモン(abscisicacid
，gjbberellin，auxin
，cytokinin，brassinosteroid等）には配糖体が存在し、アグ リコンとの相互変換はglucosyl transferase
とp―glucosidaseが担う．シグナル物質の生 合成には数段階の酵素反応を必要とするが，配糖体は安定な非活性体として貯蔵され，必 要に応じてpーglucosidaseによる一段の反応により脱配糖化されて活性体として供給され る．また，細胞内における活性化物質の濃度調整も担うと考えられている．しかしながら，植 物 ホ ル モ ン 配 糖 体
B
−glucosidase
と し て の 機 能 は 未 知 の 部 分 が 多 い ．tuberonic acid (TA)
およぴその配糖体(tuberonic acidp―glucoside：TAG）は，塊茎 形成を誘導する化合物としてバレイショから単離され，病傷害ストレスの防御応答に関与 する植物ホルモンのjasmonicacid
（JA）から合成されることが知られている．近年，TA はシロイヌナズナやトマトにおいてJA生合成・代謝関連遺伝子の発現を調節することが報 告され，バレイショ以外の植物においても生理機能が示された．加えて，TAは傷害時に傷 害葉から非傷害葉に輸送される．これらのことはTA
の輸送が防御応答に韜ける重要な機能 を担うことを示唆している．これまでTAからTAGを生成する酵素は同定されているが，TAG を分解してTAに変換するp
−glucosidaseについては存在すら明らかにされていなかった．本研究では
TAGp
−glucosidaseを同定し，酵素機能およぴ生理機能を解明することを目的 とした．イ ネの 植 物 体内 に おい て
TAG
がTAに 加水 分 解さ れ る こと を 重水 素 標識のTAG (TAG
一d5) を 用 い た代 謝実験で 明らかに した．続い て，活性 本体であ るTAGp
―glucosidase (OsTAGG1 お よ ぴOsTAGG2)
を 精 製 し た ．OsTAGGl
お よ ぴOsTAGG2
は そ れ ぞ れOs0490474900
お よ ぴOs0490474800
に コードさ れるアミ ノ酸配列 と一致した ：OsTAGGl
はSDS−PAGEに より分離 さ れ る42 kDa
お よ ぴ25 kDa
の2
本 の ポ り ベ プ チド 鎖 か らな り ，OsTAGG2は40 kDa
お よ ぴ26kDa
の2
本 の ポり ベ プチ ド 鎖 から な る こと を 明ら か に した ． また ，OsTAGGl
およ ぴOsTAGG2 は そ れ ぞ れGly355
韜 よ ぴGly359
のN
末 端 側 で 切 断 さ れ る こ と が 示 さ れ た ・OsTAGGl
お よ ぴOsTAGG2
の ア ミ ノ 酸 配 列 は85%
一 致 し ，glycoside hydrolase family1(GHl)
に属 す るB
−glucosidase
に お いて 保 存性 が 高 い領 域 が 認め ら れた．ま た，OsTAGGl
お よ ぴOsTAGG2
は，GH1
酵素の触 媒残基（ 一般酸塩基 触媒残基 およぴ求 核触媒残 基），す べ て のGH1
の メン バ ーで 保 存 され て いる グ リ コン と の結 合 を 担う ア ミ ノ酸 残 基も 保 存 され て い た ． 以 上 の こと か ら ，OsTAGGl
お よぴOsTAGG2
はGH1
に 属 する 酵 素 群の 共 通構 造 を 有 することを明らかにした．OsTAGGl
お よぴOsTAGG2
の基 質 特 異性 を 調べ る た めに ， 種々 の 配 糖体(TAG
，MeT
．AG
，jaSmony11
−p
―gluCOSide，SaliCyliCaCidgluCOSide，ZeatingluCOSide，1inamarin
，ANPp
―glucoside，j心旧p−ga．lactoSide，j母mp−mannOSide，およぴj心PD−CellobioSide）に対 す る活性を 測定した ．その結 果，0sTAGG1およ ぴ0sTAGG2
は，p NPp−gluC0sideに対して最 も 高 い 活性 を示した ．天然の 配糖体ではTAG
に対する 活性が最 も高かっ た．また ，0sTAGGl お よ ぴOsTAGG2
の 細 胞内 局 在 性を 解 析 したとこ ろ，両酵 素は細胞 膜に不均 一に存在 した．ま た ， 細胞 質におい て網目状 のシグナル も観察さ れたこと から，・
end6plasmicreticulum
に も 存 在 す る こ と が 判 明 し た ． こ れ ら の こ とか ら ，OsTAGG1
お よ びOsTAGG2は 細胞 内 でTAG
．p−glucosidaseと．して機能すると考えられた．TA
お よ ぴTAG
の 代 謝お よ ぴ 生理 機 能 に関する 知見は少 ない．し かし，JA
と 同様に病 傷害 応 答 に 関与 す る と予 想 され ， 病 傷害 ス トレスに 対するJA，TA
およびT．AG
の内生量 の変化 を 解 析 した ． そ の結 果 ，． 傷 害 に対 し てJA
だけで なくTA，お よぴTAG
が蓄 積するこ とが明 ら か に な っ た ． また ， い もち 病 菌に 対 し てJAと 共に ，TA
お よ び1、AGが蓄 積 す るこ と が 示 さ れ た ． さ ら に， 病 傷 害ヌ ト レス に よ るぬ 弼 鯔お よ ぴ 飴弼G
餾 の 転写 産 物 への 影 響 を 解 析 し た． そ の 結果 ， 傷害 時 の 伽弼 謡j
の 発現 は 傷 害前 に 比べ て 抑 制され， 仏鰯6偬の 発 現 は 誘 導さ れた．ま た，いも ち病菌が感 染するこ ．とによ り，仏鰯 粥および 仏黝卿の 転写 産物はいずれも徐々に増加することが明らかになった．い もち 病菌 の感染に より，伽 黝岱jの発現 が誘導さ れたこと から，
GUS
染 色による いもち 病 菌 感 染に よ る イネ 組 織の 飴 弼 簡の 発 現を 解 析 した ． その 結 果 ，い もち病 菌の感染 によ り ， 仏 弼闘 は 病 斑付 近 の維 管 束 で誘 導 され る こ とが 明 らか に な った ．導管 もしくは 篩管 で ，TA
が 輸送 されるこ とから，0sTAGG1
は病害時に 維管東細 胞内でT AGを分解し ，TAを木 部もしくは師部へと輸送する働きを担うと推定された．本 研究 に よ って ，
0sTAGGl
お よ ぴ0sTAGG2
の 酵 素機 能 た らぴ に 生理 機能に 関する新 たな 知 見 が 得 ら れ た ． さ ら に ，0sTAGGl
お よ ぴOsTAGG2
がTA
の 輸 送に 関 与 する 可 能性 を 見 出 し ， イ ネ の 防 御 機 構 に お け るOsTAGGl
お よぴ0sTAGG2
の役 割 の 解明 に 大 きく 近 づぃ た といえる・
