Citation [岐阜大学医学部紀要 = Acta scholae medicinalis universitatis in Gifu] vol.[51] no.[1] p.[51]-[60]

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Title ヒト乳癌細胞における,高濃度ブドウ糖および高浸透圧刺激によるアルドース還元酵素mRNA発現と細胞の形質変化との関連について : プロテインキナーゼC分子種の関与

Author(s) 丸山, 貴子; 山本, 眞由美; 奥村, 三恵

Citation [岐阜大学医学部紀要 = Acta scholae medicinalis universitatis in Gifu] vol.[51] no.[1] p.[51]-[60]

Issue Date 2003-03-31

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Version NIIによる電子化

URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/12369

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

(2)

High Glucose- or Hyperosmolality-Induced Expression of Aldose Reductase mRNA may Modify the Properties of Human Breast Cancer Cells: Reciprocal Involvement of

Protein Kinase C Isozyme Expression

Takako MARUYAMA, Mayumi YAMAMOTO, Mie OKUMURA, Toshihiro KOJIMA, Hiroya SAKUMA and Keigo YASUDA

Department of Endocrinology, Diabetes and Rheurnatology, Division of Bioregulatory Medicine, Gifu University School of Medicine

(Director: Prof. K. YASUDA)

Aldose reductase (AR) is the first enzyme in the sorbitol pathway. Expression of AR is induced by high glucose or hyperosmotic stresses and there are the functional cross talks between AR expression and protein kinase C (PKC) signaling in various metabolic conditions. Although AR is reported to be expressed in cancer cell lines, functional mechanism of AR expression is still unclear. To clarify AR function in cancer cells, we examined the effects of high glucose and hyperosmotic stress on expression of AR mRNA, cell proliferation, drug sensitivity, and expression of PKC isozymes in drug sensitive human breast cancer cells (MCF-7) and multidrug-resistant human breast cancer cells (NCVADR-RES)

.

Expression of AR mRNA measured by real time PCR in NCIJADR-RES was increased to about two hundred times compared to MCF-7. Although high glucose stimulated cell proliferation and expression of AR rnRNA significantly in MCF-7, there was no significant effect of high glucose on cell proliferation nor AR mRNA expression in NCUADR-RES. Although hyperosmotic stress-induced AR mRNA expression was dependent on duration and concentration of NaCl treatment, sensitivity for hyperosmotic stress was different between MCF-7 and NCIIADR-RES. Hyperosmotic stress induced expression of AR mRNA up to 6 . 7 times after 60 hours and 40 mM NaCl was maximum concentration for stimulation in MCF-7. In NCVADR-RES, AR mRNA was increased up to

55

times after 60-hour treatment, and increased up to 32 times with 100 mM of NaCl stimulation. Upreguration of AR may induce drug resistance in both cells. Western blot analysis showed that hyperosmotic stress downregulated levels of PKC-E in both cells and PKC-y 1-8 in NCVADR-RES. These results suggested that high glucose-induced AR mRNA expression might stimulate cell proliferation in MCF-7, and that hyperosmotic stress-induced AR mRNA expression might induce drug resistance through alteration of functional change for PKC-E, -y, -0 in both cells.

Acta Sch Med Univ Gifu 51

:

51 ^-60 (2003)

Key words : cell proliferation, drug resistance, hyperosmolality, real time PCR

(3)

52 岐阜大医紀 51；51−60（2003）

シルグリセロール（DAG），リン脂質，Caイオンを要求

するclassicalPKCs（cpKC；PKC−α，−βI，−βII，−†），リン

脂質とDAGのみに依存するnovelPKCs（npKC；PKC−8，−

e，−Tl，一0），そしてリン脂質のみに依存するatypicalPKCs

（apKC；PKC−∈，一九（t），−u）の3つのサブグループに分

類される14ト16） ^。

我々は，高濃度ブドウ糖がヒト乳癌細胞（MCF−7）の増殖をPKC−βⅠⅠのダウンレギュレーションを介して促進

すること17）や，肥満患者の血清中で増加するレプチンが，

PKC−αの活性増加を介してMCFq7細胞の増殖を促進させること18）を報告してきた。糖尿病患者では乳癌発症率が増加しているという統計的報告があり19卜21），糖尿病状態におけるPKCシグナルの変化が乳癌細胞増殖を促進

している可能性を呈示してきた。

以上，糖尿病状態でAR発現が克進していること，AR がPKCをはじめとする糖尿病状態の各種代謝異常とクロストークしていること，癌細胞の分化にAR誘導が関与していること，糖尿病状態ではPKCの変化を介して乳癌細胞増殖が促進することなどの事実から，我々は以下の仮説をたてた。すなわち，糖尿病状態で誘導された AR発現が糖尿病状態で促進される乳癌細胞増殖に関与する，という仮説である。この仮説を検証するために，

高濃度ブドウ糖や高浸透圧刺激によるARの発現変化，

細胞増殖の変化，薬剤感受性の変化，PKC分子種の発現変化について，ヒト乳癌細胞（MCF−7）を用いて検討

した。

材料と方法

1）材料

細胞培養液（RPMI1640）および，fbtalbovine serum

（FBS）は，Gibco−BRL（Gaithersburg，MD，USA）から購入，使用した。その他の試薬は，すべて研究用特級グ

レードを使用した。

2）培養細胞

実験には，薬剤感受性ヒト乳癌細胞（MCF−7）および

多剤耐性ヒト乳癌細胞（NCI／ADR−RES）を用いた22）23）。

我々は，乳癌細胞増殖のブドウ糖やレプチンに対する反

応の違いをMCF−7とNCI／ADR−RES細胞で比較検討することにより，その細胞内情報伝達機構の違いを明らかに

してきた17）18）

。今回も両細胞を用いて，細胞内情報伝達

機構をより明らかとすることを目的とした。MCF−7細胞

はUniversityofCincinnati，CollegeofPharmacy（Cincinnati，

OH，USA）のP．B．Desai博士より，NCI／ADR−RES細胞

はNationalCancerInstitute（Bethesda，MD，USA）のK．

H．Cowan博士より提供を受けた。細胞培養液は，10mM

のブドウ糖を含むRPMI1640mediaに，5％ FBS，50 units／mlのpenicillin Gと50トLg／mlのstreptomycin sulfate

（Gibco−BRL）を加えたものを用いた。細胞は，37℃で 5％CO2含気，加湿環境下で，約3日毎に培養液を交換しながら直径3cmのシャーレで培養，実験に倶した。

緒

アルドース還元酵素（aldosereductase；AR）は，NADPH

を補酵素としブドウ糖をソルビトール（ポリオール）に変換する酵素である。ソルビトールは，続いてソルビトール脱水素酵素（SDH）によりフルクトースに変換され，

糖代謝の副路ポリオール経路を構成する。ラットの腎髄質細胞においては，ARは高浸透圧下で誘導され，本酵素により生成される細胞内ソルビトールは，浸透圧調節にあたるオスモライト（有機溶質）の一員として働くとされる1）。ARの発現が高濃度ブドウ糖や高浸透圧によ

り誘導されることは以前から報告されていたが2），この AR誘導に関わるARの機能遺伝子が第7染色体に位置

し，その上流約1．1kbpにはosrnOtic response element

（ORE）と呼ばれる領域が同定され，さらにその結合蛋白も同定されている1）3）。ARはポリオール経路の構成酵素であるばかりでなく，ステロイド代謝や，神経組織におけるカテコールアミンやセロトニン由来のアルデヒド体の代謝分解，さらには，生体内で生成するアルデヒド

化合物の解毒を触媒するなど，生体内で多様な生理機能

を有していると考えられている。ヒトのAR遺伝子を高発現させたトランスジェニック糖尿病マウスでは，運動神経伝導速度の低下や神経線椎の萎縮がみられ，ARと

糖尿病神経症との関係が確認されている射。また，本酵

素の活性部位に結合して活性部位を変形させる既存の

AR阻害剤によって，糖尿病神経症の改善がみられ，臨床の現場で使用されていることは周知の事実である5）。

ARのmRNAは，腎髄質や糖尿病合併症の標的器官である水晶体，網膜，末梢神経に多量に発現しているばかり

でなく，副腎，生殖器，中枢神経系や筋など，生体内組

織に広く分布しており2），ARの生体内での役割につい

ては依然不明な点も多い。AR遺伝子の発現が，酸化ス

トレス6やある種のサイトカイン（TNFα）7jによって誘導

されることや，血管内皮細胞では非酵素的糖化後期反応

生成物（advanced glycation end−prOducts；AGEs）によっても誘導されること削が報告されている。さらに近年，

血管平滑筋細胞9や腎10）ではポリオール代謝経路とプロテインキナーゼC（PKC）シグナルとの関与が明らかとなり，ポリオール代謝系には，浸透圧の上昇以外に酸化ストレス，一酸化窒素（nitric oxide；NO）の産生低下，

PKCの活性異常，AGEの産生など，種々の代謝異常が

相互に関係し合い，クロストークが存在することが注目されつつある。ラット肝癌細胞では，AR蛋白ならびに遺伝子が発現しており薬剤耐性の獲得にARの発現増加が関与していることが示された⊥1）。さらに，肝癌細胞を高浸透圧下で培養してARを誘導すると，薬剤耐性の性質に変換することも示されだ2）。

PKCは，少なくとも11の分子種からなるプロテイン

キナーゼファミリーで，細胞機能維持（増殖や分化）に

関わる重要な細胞内情報伝達シグナルとして，各分子種

が重要な役割を担っている13J。PKCは，その活性にジア

(4)

丸山ほか：乳癌細胞におけるアルドース還元酵素発現と細胞の形質変化 53

サンプルとして使用した。蛋白定量はLowry法25）による

DCproteinassaykit（Bio−Rad，Hercules，CA，USA）を

用いて，BSAを標準として測定した。RAPIDASminislab

（ATTO，Japan）を用いて10％（w／v）polyacrylamide gel のそれぞれのレーンに同量の蛋白をアプライし，Sulねte−

polyacrylamideresoIvinggelselectrophoresis（SDS−PAGE）を

行なった。その後polyvinylidenedifluoride（PVDF）mem−

branes（Hybond−P⑧，AmershamPharmaciaBiotech，Bucking−

hamshire England，UK）上に転写した。転写膜をTris−

bufftredsaline（TBS；20mMTris−HCl，500mMNaCl，PH 7．40）で洗浄後，非特異的bindingsitesを阻害するため，5％

driedmilkを含む0．05％Tween−20含有TBS（TBS−T）と，

室温で約1時間インキエペートした。TBS−Tで洗浄，

PKC−α，−βI，−βII，−Y，−8，−e，−∈，−0，一入（t），Cdk2の蛋白に特異的なウサギ由来IgG抗体（SantaCruZBiotechnology，Inc．

SantaCruZ，CA，USA）と常温で3時間反応後，再度TBS−

Tで洗浄，horseradishperoxidase−1inkedgoatanti−rabbitIgG

（Santa CruZ）を30分間反応させた。その後，TBS−Tで

洗浄，Chemiluminescense system（ECL plus，Amersham PharmaciaBiotech）で発光させ，ECLmini−CameraRPN2069

（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて，instant black

＆whitenlmFPL3000B（FUJIFILM，Japan）に感光，Im−

agequantsoftware（NationalInstitutesofHealth，Bethesda，

MD，USA）を用いて各バンドのdensityを測定，それぞれの発現量の違いを検討した。

6）RNA発現量の測定（リアルタイムPCR）

ARのmRNAは，リアルタイムPCR法で量的に比較した。細胞（MCF−7およびNCI／ADR−RES）を，高濃度ブドウ糖（30mM），高浸透圧刺激（0〜100mM塩化ナトリウム，ラフイノース）などで刺激後，培養液を吸

引，RNAeasy（QIAGEN，Valencia，CA，USA）を使用し RNAを抽出した。すなわち，βメルカプトエタノール

を添加した600け1RLTバッファーで細胞をホモジナイズ，同量の70％エタノールを添加，ホモジナイズした。

これをカラムにアプライしRWlバッファーで洗浄後，

RPEバッファーでRNAを抽出，濃度を測定した。抽出

したRNAは，LightCycler−FastStart DNA Master SYBR GreenIキット（RocheDiagnostics，Germany）で，キヤピ

ラリーPCR法へ倹した。増幅されたPCR産物はSYBR GreenIと結合，蛍光によって検出され，LightCyclerwork Station（RocheDiagnostics，Germany）でリアルタイムPCR 定量解析を行った。なお，ARのプライマーにはすでに

報告されているデザイン，5，−ACTGCCATTGCAAAGGC

ATCGTGGT−3 （sense）および5，−CCCCCATAGGACTG GAGTTCTAAGC−3 （anti−SenSe）2）を使用した。また，ハ

ウスキーピング遺伝子にはglyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase（G3PDH）を使用した。

3）DNA合成の解析

細胞増殖の変化は，DNA合成の測定と，後述するウエスタンプロット法によるcdk2の発現変化とをあわせて検討した。DNA合成は，［3H］標識チミジンの細胞内への取り込みを測定することにより計測した。細胞

（MCF−7およびNCI／ADR−RES）を直径3cmのシャーレに用意し，低濃度ブドウ糖（10mM），高濃度ブドウ糖

（30mM），および高浸透圧（高張塩化ナトリウム（100 mM），ラフイノース（100mM））の4環境下で，24時間培養した。最後の1時間で，1．0什Ci／wellの［3H］−チ

ミジン（PerkinElmerLifeSciences，Inc．Boston，MA，USA）

を添加し培養した。培養液を吸引し，細胞を4℃の phosphate−bufftred saline（PBS）で2回，メタノールで

1回洗浄後，酸可溶性成分を除去するため5％トリクロロ酢酸（TCA）と室温で20分間インキュベートし，再度メタノールで1回洗浄した。1N水酸化ナトリウムで細胞を溶解，同量の1Nの塩酸で中和後測定チューブに移

し，ACSII⑧（Amershamcorporation，ArlingtonHeights，

IL，USA）カクテルを加えた。multi−PurPOSe SCintillation counterLS6500（BeckmanInstrumentSInc．CA，USA）で，

細胞内に取り込まれた［3H］の放射活性を測定した。

4）薬剤感受性の測定

乳酸脱水素酵素（1actose dehydrogenase；LDH）は，L

−乳酸＋NAD＋こピルビン酸＋NADH＋H＋の可逆反応を触媒する酵素であるが，細胞が毒性を受けると培養液中にLDHが放出される。従って，培養液中のLDH濃度を測定することにより細胞毒性を評価することができ

る12）。37℃，5％CO2環境下で，抗痛剤であるdaunorubi−

cinhydrochloride（Sigma−Aldorich，Japan）（100pg／ml）で細胞（MCF−7およびNCI／ADR−RES）を3時間処理後，

コントロール（低濃度ブドウ糖（10mM））条件下および高浸透圧（高張塩化ナトリウム（100mM））条件下での培養液上清のLDH活性の変化を，日本臨床化学会標準化対応法であるシカリキッドLDHJ⑧（関東化学，東京）を用いて測定した。

5）ウエスタンプロット解析

各種細胞情報伝達物質の蛋白レベルの解析は，ウエス

タンプロット法により解析した。細胞（MCF−7およびNCI

／ADR−RES）を，低濃度ブドウ糖（10mM），高濃度ブドウ糖（30mM），高浸透圧刺激（高張塩化ナトリウム（100 mM），ラフイノース（100mM））の4条件下，37℃，5％

CO2環境下で48時間培養後，検討した。培養液を吸引後，

Laemmli法24）に準じ，1ysis buffer（50mM Tris／HCl（pH

7．2），150mMNaCl，1％（w／v）glycerol，1％NP−40（non−

ylphenoxypolyethoxyethanol），1％sodiumdeoxycholate，

1mMNaF，2．5％SDS（sodiumdodecylsulfate），1mM Na2VO4，1mMPMSF（phenylmethylsulhnylfluoride），10

ug／mlleupeptin，andlOトLg／mlaprotinin）を加えて細胞を溶解した。これをスクレイパーでかきとってチューブに

とり，氷上で5秒間ソニケーション後に4℃，12000 叩m，10分間遠心し，上清を細胞質画分と膜画分を含む

(5)

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control glucose NaCl raffinose control glucose NaCl rafflnose

Fig.

1

Eflect of high glucose and hyperosmolality on DNA synthesis measured by ['HI-thymidine incorporation in drug sensitive human breast cancer cells (MCF-7) (a) and multidrug resistant human breast cancer cells (NCI/ADR-RES) (b). Cells were plated in 6-well plates in RPMI 1640 media containing 5 % FBS with low glucose (10 m ~, high glucose ) (30 mM) , or hyperosmolar condition (100 mM of NaCl or raffinose) for

24

hours. Incorporation of

["HI

-thymidine was measured as described in "materials and methods." Data are shown as a percent change of control; low glucose condition.

Data are the means k SD for triplicate determinations. In MCF-7,

['HI

-thymidine incorporation was increased by high glucose, and decreased by hyperosmolar condition significantly (low glucose; 100 -t 16.2 %, high glucose; 123.3 $-

1 0 . 1 % , NaCl; 76.1&11.4%, raffinose; 5 0 . l t 3 . 6 % ) . In NCIIADR-RES, however, no condition had significant effect on DNA synthesis (low glucose; 100 $- 26.9%, high glucose;

82.4+12.9%, NaCl; 75.5+34.0%, raffinose; 1 3 7 . 2 k 2 4 . 8 % ) . * p

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control glucose NaCl raffinose control glucose NaCl raff~nose

Fig. 2 EfSect of high glucose and hyperosmolality on protein level of cdk2 in MCF-7 (a) and NCI/ADR-RES (b). Cells were incubated with low glucose (10 mM) , high glucose (30 m ~, ) or hyperosmolar condition (100 mM of NaCl or raffinose).

Immunoreactivity of cdk2 was analyzed by Western blot analysis as described in "materials and methods." Data are shown as percent change of control; low glucose condition. In MCF-7, high glucose increased the expression of protein level of cdk2 and hyperosmolality decreased it. On the other hand, these condition had not striking effect in NCIIADR-RES.

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control glucose NaCl raffinose control glucose NaCl raffinose

Fig. 3 EfSect of high glucose and hyperosmolality on the ex- pression of aldose reductase (AR) mRNA analyzed by real time PCR in MCF-7 ( a ) and NCUADR-RES ( b ) cells. Cells were stimulated with low glucose (10 r n ~ ) , high glucose (30 mM) , or hyperosmolar condition (100 mM of NaCl or raffinose), and mRNA levels of AR were measured by real time PCR as described in "materials and methods." Data were shown as ratio of the AR rnRNA to G3PDH, a house keeping gene ( AR mRNA 1 G3PDH X lo3)

.

Data are the mean

*

^SD

for triplicate determinations. In MCF-7, the expression of AR mRNA was increased significantly with high glucose and exposure of hyperosmolar condition (low glucose; 0.62 f 0.47, high glucose; 1.41

*

0.07, NaC1; 5.07f 0.17, raffinose;

3.11

f 0.20), In NCVADR-RES, the expression of AR mRNA was increased significantly with hyperosmolar treatment, however, high glucose did not have significant effect on the expression of AR mRNA (low glucose; 132.67k45.54, high glucose;

118.13

f 24.00, NaCl; 2219.33 f 561.54, raffinose; 750.

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188.25). The expression of AR mRNA in NCIIADR-RES was about two hundred times and hyperosmolality-induced increase of AR mRNA expression was 2 times compared to in MCF-7. * p

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0.01 vs. control (low glucose), n =

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T~me (hrs) Time (hrs)

Fig. 4 Correlation between the mRNA expression of AR and the length of treatment time of NaCl in MCF-7 ( a ) and NCI/

ADR-RES ( b ) cells. Cells were treated with 100 mM of NaCl for various times. The mRNA expressions of AR were measured by real time PCR as described in "materials and methods." Data were expressed as the ratio of mRNA level of AR to G3PDH (AR mRNA 1 G3PDH X lo3). Data were shown as percent change of control (before treatment). The mRNA expressions of AR increased with time in both cells. The expression increased up to 6 . 7 times of control after 60-hour treatment in MCF-7. In NCIIADR-RES, the expression increased up to 7.4 times of control by 12-hour treatment, 54.8 times after 60 hours.

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Fig.

5

Correlation between the mRNA expression of AR and the concentration of NaCl in MCF-7 ( a ) and NCUADR-RES (b) cells. Cells were treated with various concentration of NaC1, and the mRNA expressions of AR were measured by real time PCR as described in "materials and methods." Data were shown as percent change of control (without treatment).

In MCF-7, mRNA expression of AR reached plateau at 40 mM of NaC1. In NCUADR-RES, mRNA level of AR was get- ting higher depending on the concentration of NaC1.

(7)

mRNA

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Fig.6 Alteration of drug sensitivity accompanied with hyperosmolality-induced expression of AR mRNA. Cells were treated with normoosmolar (10 mM glucose) or hyperosmolar condition (100 mM ~ a ~ 1 ) , and withlwithout daunorubicin hydrochloride (100 yg/ml). The LDH activities of media were measured as described in "materials and methods." In MCF-7 cells, LDH activity was increased up to 8 times of control with treatment of daunorubicin (10 mM glucose; 66.7 i 3 . 1 IUJ1, 100 pg/ml daunorubicin; 523.7 i 58.2 1~11) , however, increase of LDH activity in media was suppressed to

4 times of control treated with hyperosmolar condition (100 mM NaC1; 70.3 -t

5.8

IUJ1, 100 mM NaCl f 100 yg/ml daunorubicin; 282. Of 33.0 1 ~ 1 1 ) . In NCIIADR-RES, LDH activity was suppressed to 4 times of control compared to MCF-7 cells (10 mM glucose; 11.0 If: 1 . 0 IUJ1, 100 yglml daunorubi- cin; 44.7 rf: 10.2 1 ~ 1 1 ) . Furthermore, exposure to hyperosmolar condition diminished LDH release completely (100 mM NaCl; 14.0 t- 1 . 0 IU/1,100 mM NaCl i- 100 pglml daunorubicin; 14.3 i 3 . 2 1~11). Hyperosmolality-induced overexpres- sion of AR mRNA might alter drug sensitivity in both of MCF-7 and NCIIADR-RES cells. **p

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6 MCF-7 NCIIADR-RES C G N R C G N R

Fig. 7 EfSect of high glucose and hyperosmolality on im- munoreactivity o f PKC isozyme in MCF-7 and NCI/ADR-RES cells. Cells were incubated with low glucose (10 m ~, high ) glucose (30 m ~, and hyperosmolar condition (100 mM of ) NaCl or raffinose)

.

Immunoreactivity of PKC-a, -PI, -PII, -y,

-6,

^-E,

-5,

-0, and - h ( t ) in whole cell lysates were analyzed by Western blot analysis as described in "materials and methods." PKC-E was decreased by hyperosmolality in both cells.

PKC-y and -0 were decreased by hyperosmolar condition only in NCIIADR-RES.

(8)

丸山ほか：乳癌細胞におけるアルドース還元酵素発現と細胞の形質変化 57

件（10mMブドウ糖）に村して，塩化ナトリウム（100 mM）で8．2倍，ラフイノース（100mM）で5．0倍の増

加であったのに比べ，NCI／ADR−RES細胞では塩化ナト

リウム（100mM）で16．7倍，ラフイノース（100mM）

で5．7倍の発現量の増加を示し，塩化ナトリウムでのAR 遺伝子の誘導は薬剤耐性株の方が約2倍であった。さら

に，高浸透圧刺激に対するAR遺伝子の誘導は，いずれも濃度，時間依存性であったものの，NCI／ADR−RES細胞において，より大きな増加を示した。MCト7細胞では 40mM塩化ナトリウムで約3倍にまで増加しプラトー

に達したのに村し，NCI／ADR−RES細胞では100mMで 32倍にまで増加した。また，MCト7細胞では高浸透圧刺激開始36時間後に増加し始め，60時間で6．7倍まで増加したが，NCL（ADR−RES細胞では刺激12時間に7．4倍まで増加し，60時間では55倍まで増加した。

Leeら12）は，ヒト肝癌細胞で，100mM塩化ナトリウムの高浸透圧刺激でARmRNA発現が約15倍まで増加したことを報告しているが，乳癌細胞での検討はこれまでなく，薬剤感受性，耐性の性質の違いによってAR遺伝子発現の差を詳細に検討した報告は他にない。この結果

より，我々は，高浸透圧刺激でAR遺伝子が増加することが，薬剤耐性の増強と相関するのではないかと考え検討したところ，高浸透圧によってAR遺伝子発現が増加すると，抗癌剤であるダウノルビシン（100帽／ml）に

よる細胞障害が阻害されることも明らかとなった。以前，

Leeら12）ならびにTakahashiら11）が，AR遺伝子発現の増加に伴い薬剤耐性の性質が出現する可能性を肝癌細胞で示唆したが，我々の結果を支持するものと考えられる。

AR遺伝子発現の増加と薬剤耐性の間に深い関係があることを示したが，細胞増殖とはどのような関係があるのかを，さらに検討した。乳癌細胞の増殖に関しては，

既に我々が報告したように17），高濃度ブドウ糖（30mM）

刺激はMCF−7細胞の増殖を促進したが，NCI／ADR−RES 細胞に村し有意な影響を与えなかった。MCト7細胞にお

けるAR遺伝子の誘導は，高濃度ブドウ糖刺激時，塩化ナトリウムやラフイノースによる高浸透圧刺激に比べる

と少ないが，1．8倍増加した。しかし，NCI／ADR−RES細

胞では有意の影響を認めなかった。

血管平滑筋細胞の細胞増殖の調節に，AR遺伝子の誘導が大きな役割を担っていることが報告されており，血清やトロンビンによる増殖促進27）や，血管損傷後の細胞増殖促進時28）にAR遺伝子が増加する。動脈硬化症の進展には血管平滑筋細胞の異常か曽殖促進が重要とされる

が，高濃度ブドウ糖が血管平滑筋細胞の増殖を促進させ

ること29）と，糖尿病（高血糖）状態では各組織において AR遺伝子発現が増加していること2）を考えると，AR遺伝子の高濃度ブドウ糖による誘導が，細胞増殖と何らかの関連を有しているものと思われる。高濃度ブドウ糖によるAR遺伝子の誘導は，ブドウ糖による浸透圧の上昇を介してではなく，高濃度ブドウ糖による酸化ストレス

の増大6）や，糖代謝産物（Methylglyoxal）30）を介している

れた。

高濃度ブドウ糖および高浸透圧刺激によるPKC分子種の蛋白発現量への影響

細胞の薬剤耐性の違いに伴う浸透圧刺激によるAR発現誘導の差異が，どのような細胞情報伝達の違いと関連

しているかを検討するため，各PKC分子種（PKC−α，−

βⅠ，−βⅠⅠ，−γ，−8，一己，−∈，−0，一入（t））の蛋白発現量を検討した（Fig．7）。これら9種のPKC分子種の中で，PKC−

Eは，MCF−7でもNCI／ADR−RESでも，塩化ナトリウムとラフイノースによる高浸透圧刺激で減少した。しかし NCI／ADR−RESでは，同種の高浸透圧刺激によって，PKC−

eのみでなく，PKC−γやPKC−0の発現の減少を認めた。

この両細胞間での，高浸透圧刺激によってダウンレギュレーションを来したPKC分子種の違いが，AR発現量変化の差異と関連している可能性が示唆された。なお，

PKC−αおよび−βⅠ発現量のおよその違いをバンド面積から比較すると，NCI／ADR−RESではMCF−7に比べ両PKC 分子種とも2〜3倍に増加していたが，両細胞とも高浸透圧刺激によって発現量は変化しなかった。

考察

ARは種々の細胞に発現しており，その遺伝子のプロモーター領域上流にはosmoticresponseelement（ORE）

領域が存在するため，高浸透圧刺激でARの発現誘導が増加する3）。今回我々は，ヒト乳癌細胞（MCF−7）においてもAR遺伝子が発現しており，高浸透圧刺激により AR遺伝子の発現が誘導されることをはじめて明らかに

した。高浸透圧刺激には高張塩化ナトリウムを使用したが，浸透圧コントロールとして使用したラフイノースで

も同様にAR遺伝子の発現増加が認められ，NaイオンやClイオンの影響でないことを確認した。さらに，この浸透圧刺激によるAR遺伝子の誘導は，時間依存性，

濃度依存性であった。我々は，これまでに，MCF−7とNCI

／ADR−RESの細胞間で高濃度ブドウ糖環境下やレプチン

存在下における細胞増殖調節機構に差があり，MCF−7は

ブドウ糖やレプチンの濃度依存性に細胞増殖が増加する

が，NCI／ADR−RESはこれら外的環境に左右されないことを明らかにしてきた17）18）。同様にAR遺伝子の誘導も，

薬剤感受性株（MCF−7細胞）と薬剤耐性株（NCI／ADR−

RES細胞）との間で大きな差が存在することが明らかとなった。まず，生理的浸透圧条件（10mMブドウ糖）

下で，AR遺伝子の発現量はMCト7細胞が0．62±0．47

（ARmRNA／G3PDHXlO3）であったのに村し，NCI／ADR−

RES細胞では132．67±45．54（ARmRNA／G3PDHXlO3）

と，薬剤耐性株で213倍に増加していた。Hyndmanら26）

は各種celllineのARの発現について報告しているが，

MCF−7細胞ではその発現は低く，NCI／ADR−RES細胞で高いという結果で，我々の結果と一致するものであった。

また，MCF−7細胞とNCI／ADR−RES細胞を比べると，高浸透圧刺激に村するAR遺伝子誘導の感受性も大きく異

なっていた。すなわち，MCF−7細胞では生理的浸透圧条

(9)

58

ことが示されている。今回の我々の検討でも，MCF−7で

の高濃度ブドウ糖によるAR遺伝子の誘導は，塩化ナト

リウムやラフイノースの高浸透圧刺激による誘導と比べると約3分の1と小さく，OREを介さない機序によるものと思われる。高濃度ブドウ糖によるAR遺伝子の誘導は，細胞増殖を促進させたが，高浸透圧刺激で認められたような抗癌剤に対する耐性を誘導しなかった。

高浸透圧刺激ではOREを介して著明にAR遺伝子が

誘導増加されるが，この条件下ではMCF−7では細胞増殖はむしろ抑制，NCI／ADR−RESでも不変であった。

MCF−7では，100mMという高浸透圧環境が細胞にとっては非生理的で細胞毒性が出現したのか，AR遺伝子の過剰な増加が細胞増殖にむしろ抑制的に働くのかは，今回の検討では不明であった。しかし，乳癌細胞において

も，AR遺伝子はOREを介して増加する機序および，

高濃度ブドウ糖による他の機序の，二つの異なる誘導メカニズムが存在する可能性が示唆された。さらに，ORE を介する機序は細胞の薬剤耐性を促進させる機能と関連

し，高濃度ブドウ糖を介する機序は細胞増殖を促進させる機序と関連することが推測された。一方，薬剤耐性を有する細胞では，AR遺伝子は薬剤感受性株に対して200 倍も増加しており，高濃度ブドウ糖では有意な変化が認め難くなっていると推察された。高浸透圧刺激による

AR遺伝子の誘導増加は薬剤耐性獲得によってさらに高度となり，薬剤耐性もより高度となったと考えられる。

以上のように，癌細胞におけるAR遺伝子の発現誘導機序が，ブドウ糖と高浸透圧刺激で異なる可能性がはじめて明らかとなった。

ところで，血管平滑筋細胞では，TNFαやbasic fibro−

blastgrowthfactor（bFGF），angiotensin−II（Ang−II），Platelet−

derived growth factor（PDGF）などによる細胞増殖促進作用は，ARとPKCを介することが示されており31），AR の作用発現にPKCシグナルが関与することが推察される。そこで我々は，AR遺伝子発現を変化させる高濃度ブドウ糖と高浸透圧刺激の，PKC分子種発現に対する影響を検討した。

すでに我々は，MCF−7細胞増殖の変化にはPKC−β17）と PKC−α1日）が重要な機能を果たしていることを報告してき

たが，今回の検討でもMCF−7細胞に比べ，NCI／ADR−RES 細胞のPKC−αとPKC−βIの発現は有意に増加しており，

二つの性質の異なる細胞でPKC分子種の発現量に大き

な違いがあった。これほ，乳癌細胞の種類によりPKC 分子種の発現に差があることを示したNievesENeiraらの報告32〕に一致するものであった。乳癌細胞においてPKC−

αは細胞の生存，アポトーシス調節に重要であるといういくつかの報告33ト35）とも一致する。

乳癌細胞において，セラミドによるNFKBの抑制が PKC活性の抑制を介すること36や，PKCがNFkBの活性化をコントロールしながら細胞の生存をコントロール

していること37）などが報告されている。血管平滑筋細胞増殖をコントロールしているARの機能がNFKBと

岐阜大医紀 51；51−60（2003）

PKCを介している31）ことや，腎のメサンギウム細胞では高濃度ブドウ糖によるARの誘導にPKC−8や−Eが関与

している1…ことから推察すると，乳癌細胞においても，

おそらくNFkBなどの因子を介してAR遺伝子の誘導と PKCの機能がリンクしている可能性がある。

今回の我々の検討において，高浸透圧刺激はPKC分

子種のうち両細胞でPKC−Eを，NCI／ADR−RES細胞で

PKC−γとPKC−0を有意にダウンレギュレートさせた。

乳癌細胞における各PKC分子種に特異的な役割については，まだ解明しつくされていない。乳癌細胞の転移や形質転換に関わる細胞の性質変化にPKC−8が重要であ

ることこう8ト勅や，細胞の浸潤にPKC−けが関与しているこ

と′11），増殖因子のシグナル伝達にatypicalPKCが重要であること42），タモキシフェンの抗癌作用発現にPKC一己が関与していること43）などの報告が散見されるにすぎない。今回の検討で，高浸透圧刺激に特異的な変化がPKC一己やPKC−†，−0でみられたことは，それぞれの分子種が

それぞれの細胞で特異的な役割を有しており，各細胞に特異的なAR遺伝子発現の特徴がPKC−E，−†，−0に依存

していることを示唆する。MCト7細胞が多薬剤耐性を獲得する際に重要な役割を有するmultidrug resistance

（MDR）遺伝子のプロモーター領域の転写はPKC−αと−0 によって調節されており，多薬剤耐性獲得に伴ってその発現量が大きく変化するという報告44）は，乳癌細胞の形質変化に伴ってPKC分子種の役割や発現量が変化する

という今回の結果を支持するものである。糖尿病状態のように高血糖が長時間続くと，ARが誘導されて乳癌細胞の増殖が促進され続けることとなり，さらにAR遺伝子が誘導される状況が長時間継続すると，それに伴う PKCの発現や機能変化が生じて，細胞の性質が変化しやすくなると考えられる。このことは，糖尿病患者で乳

癌の発生率が高い19ト2いことの一因ではないかと予想でき

る。

近年，AR阻害剤によって，糖尿病状態における異常な血管内皮細胞接着45）や血管平滑筋細胞の遊走46）を阻止

しようとする試みがなされている。また，PKC分子種

に特異的な阻害剤も，異常な細胞機能を抑制する治療的

作用が期待されている抑。今回の我々の検討は，AR阻害剤やPKC阻害剤の，乳癌治療への応用の可能性をも示唆しているものと思われる。

以上，乳癌細胞における高濃度ブドウ糖と高浸透圧刺激によるAR発現の変化と，それに伴う細胞性質の変化

にPKC分子種のPKC−E，−γ，−0が特異的に関与している可能性を報告した。

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Citation [岐阜大学医学部紀要 = Acta scholae medicinalis universitatis in Gifu] vol.[51] no.[1] p.[51]-[60]

Title ヒト乳癌細胞における,高濃度ブドウ糖および高浸透圧刺激 によるアルドース還元酵素mRNA発現と細胞の形質変化と の関連について : プロテインキナーゼC分子種の関与

Author(s) 丸山, 貴子; 山本, 眞由美; 奥村, 三恵