C18 カラムのエンドキャッピングはここまで進化した! 耐久性を実現する技術とその性能クロマニックテクノロジーズ塚本友康小島瞬長江徳和

(1)

C18カラムのエンドキャッピングは

ここまで進化した！耐久性を実現する

技術とその性能

クロマニックテクノロジーズ

塚本友康

小島瞬

長江徳和

Email: info@chromanik.co.jp

http://chromanik.co.jp

(2)

エンドキャッピング

塩基性化合物のピーク形状の改善

手法

TMS

化、マルチステージタイプ、

ポリメリックエンドキャッピング

高温気相エンドキャッピング

Sunniest

エンドキャッピング

シラノールアクティビティコントロール

ピンポイントな

エンドキャッピング

表面を覆うような

エンドキャッピング

(3)

シラノールアクティビティコントロール

O Si H O Si O Si Si C H₃ O H Si O H O Si H O Si O O Si Si Si CH₃ 高吸着性シラノール

_Silanol

シロキサン_{結合に変換}

Activity

Control

Technology

シラノールの活性コントロール

シリカは結晶構造ではなくアモルファス

条件次第では原子を動かすことができる

Sunrise C18-SAC

(4)

シラノールによる分離の変化

■ ピリジンの溶出順とピーク形状の比較

Column size: 4.6 X 150mm

Mobile phase: CH₃OH/H₂O = 30:70

Sample: 1 = Uracil, ②= Pyridine, 3 = Phenol

■ カフェインの保持の比較

Column size: 4.6x150 mm Mobile phase:

CH3OH/20mM Phosphate buffer pH4.5 = 30:70

Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 40 °C Sample: 1 = Theobromine, 2 = Theophylline

(5)

塩基性化合物の選択性の比較

Column size: 4.6x150 mm Mobile phase:

CH₃CN/20mM Phosphate buffer pH3.0 or pH4.5 = 50:50 Flow rate: 1.0 mL/min

Temperature: 40 ºC Sample: 1 = Uracil 2 = Propranolol 3 = Nortriptyline 4 = Amitriptyline 5 = Toluene N H N H O O O O H N H C H3 C H3 N HC H3 N C H3 C H3 C H3

(6)

弊社の技術

O Si O H Si Si _O O O O Si O O Si O Si O Si Si O O O O Si O Si O _Si Si O O Si O Si Si O O O O Si O Si O O O O Si Si Si O O O O Si O Si O Si Si O O O O O O Si O Si Si O O O O O O Si O Si O Si Si O H O O O Si O Si O Si O O O O Si O H O

サニエスト結合（エンドキャッピング）技術

Hexamethyloctadecyltetrasilane (

C18 reagent A

)

の合成

シリカ表面に結合

Final TMS トルエン中で還流

(7)

シリカ表面の疎水性

既存のエンドキャッピング

Sunniest

エンドキャッピング

疎水性

低

高

End-capping layer

C18 C18 C18 C18 C18

Stationary phase

End-capping layer

C18 C18 C18 C18 C18

Stationary phase

(8)

Sunniestエンドキャッピングの効果

Column size: 4.6 x 150 mm

Particle size: 5 µm

Mobile phase:

CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0 =60/40

Flow rate: 1.0 mL/min

Temperature: 40 ºC or 22 ºC

Sample: 1 = Uracil

2 = Propranolol

3 = Nortriptyline

4 = Amitriptyline

O OH NH CH₃ CH₃ NH CH₃ N CH3 CH₃ 1 1 1 2 2

(9)

耐アルカリ性試験

0 20 40 60 80 100 120 0 200 400 600 800

通液時間(h)

ブ

チ

ルベ

ン

ゼ

ン

の相対

理論段

数

(%

)

◆Sunniest C18, pH10 – 50ºC ■Sunniest C8, pH9.2 – 40ºC Column: Sunniest C18, C8, 5 µm 4.6 x 150 mm Mobile phase:

C18: CH3OH/20mM Sodium borate/10mM NaOH=30/21/49 (pH10)

C8: CH₃OH/20mM Sodium borate (pH9.2) =30/70

(10)

カラム劣化

充填剤の劣化

酸

アル

_カリ

吸

着

・酸やアルカリによる加水分解

・物質の吸着

衝

撃

圧力

・衝撃や圧力による充填ベッド

の崩れ

充填状態の変化

段数の低下、ピーク形状の悪化、保持時間の変化

(11)

耐アルカリ性を高めるための手段

ハイブリッド基材

C H₂ Si O Si C H₂ C H₂ Si O O O Si O O O C H₂ C H₂ Si O Si C H₂ C H₂ Si O O O O C H₂ Si O

コーティング

エンドキャッピング

溶け難くする

接触を減らす

エンドキャッピングをさらに高効率に

高い耐アルカリ性カラムの製造可能

(12)

劣化の仕方の違い

O Si O H Si Si _O O O O Si O O Si O Si O Si Si O O O O Si O Si O _Si Si O O Si O Si Si O O O O Si O Si O O O O Si Si Si O O O O Si O Si O Si Si O O O O O O Si O Si _Si O O O O O O Si O Si O Si Si O H O O O Si O Si O Si O O O O Si OH O O Si O H Si Si _O O O O Si O O Si O Si O Si Si O O O O Si O Si O _Si Si O O Si O Si Si O O O O Si O Si O O O O Si Si Si O O O O Si O Si O Si Si O O O O O O Si O Si _Si O O O O O O Si O Si O Si Si O H O O O Si O Si O Si O O O O Si OH O

酸での劣化

アルカリでの劣化

アルカリ性下における劣化は

シリカに対する加水分解

酸性下における劣化は

C18

の結合部に対する加水分解

C18

基やエンドキャプの脱離

シリカの溶解

(13)

アルカリ性移動相による劣化

O Si O H Si Si _O O O O Si O O Si O Si O Si Si O O O O Si O Si O _Si Si O O Si O Si Si O O O O Si O Si O O O O Si Si Si O O O O Si O Si O Si Si O O O O O O Si O Si Si O O O O O O Si O Si O Si Si O H O O O Si O Si O Si O O O O Si O H O

アルカリ性下における劣化

はシリカに対する加水分解

結果としてシリカが

溶け出す。

理論段数の低下、ピークの広がり

(14)

シリカへの結合

Mixture of reagent A and C

Si OMe OMe O Si O Si O Si Cl MeMeMeMe Me Me Si OMe O O Si O Si O Si Cl MeMeMeMe Me Me Si O Si O Si Cl MeMeMe MeMeMe

Mixture of reagent A and B

Si OMe OMe O Si O Si O Si Cl MeMeMeMe Me Me Si OMe O O Si O Si O Si Cl MeMeMeMe Me Me Si Si Me Me

OMe OMeOMe

A

と

B

の混合比率

（

2:1

）（

1:1

）（

1:2

）

A

と

C

の混合比率

（

2:1

）（

1:1

）（

1:2

）

シリカゲル

5 μm,

340 m

2

_/g

シリカゲル

5 μm,

340 m

2

_/g

Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2010-52986 トルエン中で還流トルエン中で還流 Finally end-capping TMS Finally end-capping TMS

(15)

耐アルカリ性評価

試薬比率

炭素含有量

通液時間

カラムの凹み量

段数

(

相対値

)

従来

C18

A

15.6%

14 時間

1.3 mm

90%

Prototype 501

A:B=2:1

15.8%

34 時間

2.7 mm

83%

Prototype 502

A:B=1:1

16.1%

34 時間

2.2 mm

90%

Prototype 504

A:B=1:2

14.7%

34 時間

4.3 mm

62%

Prototype 505

A:C=2:1

15.7%

34 時間

3.0 mm

85%

Prototype 507

A:C=1:1

16.3%

34 時間

2.0 mm

91%

Prototype 508

A:C=1:2

14.9%

20 時間

3.3 mm

82%

Prototype 513

A:

D

=1:1

16.3%

50 時間

1.0 mm

92%

Column dimension: 150 x 4.6 mm

Mobile phase:

CH

₃

OH/50mM Sodium phosphate buffer 10 / 90 (pH11.5)

Flow rate: 1 mL/min

，

Temperature: 40 ºC

Mobile phase: CH

₃

CN/H

₂

O=70/30

Flow rate: 1 mL/min

Temperature: 40 ºC

Sample: 1 = Butylbenzene

アルカリ性移動相の通液

カラム性能の確認（凹み量）

試薬

B,C

を使用した方法では

限界

がある

新たな方法を使用した結果

耐久性が向上した

(16)

pH10.5，60℃での安定性評価

Durable test condition

Column dimension: 50 x 2.1 mm

Mobile phase:

CH

₃

OH/10mM Ammonium

bicarbonate (pH 10.5)=30/70

Flow rate: 0.8 mL/min

Temperature: 60 ºC

Measurement condition

Column dimension: 50 x 2.1 mm

Mobile phase: CH

₃

CN/H

₂

O=60/40

Flow rate: 0.2 mL/min

Temperature: 40 ºC

Sample: 1 = Butylbenzene

0 20 40 60 80 100 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

R

e

la

ti

v

e

p

la

te

o

f

b

u

ty

lb

e

n

z

e

n

e

/%

Elution volume /mL

Prototype 513

Kinetex EVO C18

PoroShell C18 HPH

他社ハイブリッドタイプのカラムと比較しても

それ以上の耐久性を示した

◆ Prototype 513

■

Company P C18 Hybrid type

▲

Company A C18 Hybrid type

(17)

ギ酸ピークの比較

0 1 2 3 4 5 6

Retention time/min

1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3

Company S C18 (2.7

µ

m)

SunShell C18 (2.6

µ

m)

Company T C18 (2.7

µ

m)

Company A C18 Hybrid type (2.7

µ

m)

TF=1.45

TF=1.86

Not detect

TF=3.21

TF=1.46

Company P C18 Hybrid type (5

µ

m)

Mobile phase:

CH

₃

CN/0.1% H

₃

PO

₄

=2/98

Flow rate: 1.0 mL/min

Temperature: 40 ºC

Detection: UV@210nm

Sample:

1 = Formic acid,

2 = Acetic acid,

3 = Propionic Acid

TF=1.79

Company W C18 (2.7 µm)

1 2 3

SunArmor C18 (5 µm)

2 3

Not detect

(18)

Mobile phase: Acetonitrile/10mM ammonium acetate pH6.8=(40:60) Column dimension: 150 x 4.6 mm, Flow rate: 1.0 mL/min, Temp.: 40o_C

塩基性化合物アミトリプチリンの比較

Sample: 1=Uracil, 2=Propranolol, 3= Nortriptyline, 4=Amitriptyline

1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 Retention time/min

TF=1.20

TF=1.89

TF=3.59

TF=2.73

TF=3.24

Company P C18 Hybrid type (5

µ

m)

Company S C18 (2.7

µ

m)

SunShell C18 (2.6

µ

m)

Company A C18 Hybrid type (2.7

µ

m)

Company T C18 (2.7

µ

m)

TF=3.12

_{Company W C18 (2.7 µm)}

2

3

4

N CH₃ CH3

Amitriptyline

SunArmorC18 (5 μm)

TF=1.18

(19)

SunArmor RPAQUAの耐久性

0 20 40 60 80 100 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

R

e

la

ti

v

e

p

la

te

o

f

b

u

ty

lb

e

n

z

e

n

e

/%

Elution volume /mL

SunArmor RPAQUA

有機溶媒を用いない

pH10

の移動相でも高い耐アルカリ性

Durable test condition

Column dimension: 50 x 2.1 mm

Mobile phase:

10mM Ammonium bicarbonate(pH 10)

Flow rate: 0.2 mL/min

Temperature: 40 ºC

Measurement condition

Column dimension: 50 x 2.1 mm

Mobile phase: CH

₃

CN/H

₂

O=70/30

Flow rate: 0.2 mL/min

Temperature: 40 ºC

Sample: acenaphthene

(20)

NH

₂

カラムの耐久性比較

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

100

200

300

400

500

600 保持時間

/%

通液時間/hour

SunArmor NH2 Company A NH2 Company B NH2

Durable test condition

Column size: 250 x 4.6 mm

Mobile phase: CH

₃

CN/water,

=75/25

Flow rate: 1 mL/min

Temperature: 40 ºC

Detection: RI, Sample: Sucrose

一般的なアミノプロピルカラムの二倍の

耐久性を実現

(21)

SunArmorNH

₂

の耐久性

0

20

40

60

80

100

0

100

200

300

400

500

600 R

e

la

ti

v

e

r

e

te

n

ti

o

n

t

im

e

/

%

Time / h

0.75 0.5

75/25

50/50

Durable test condition

Column size: 250 x 4.6 mm

Mobile phase: CH

₃

CN/water,

=75/25 or 50/50

Flow rate: 1 mL/min

Temperature: 40 ºC

Detection: RI, Sample: Sucrose

移動相中の水の割合が増えても耐久性を

維持

(22)

Column: SunArmor NH₂, 5 µm 250 x 4.6 mm Mobile phase:

Acetonitrile:10mM ammonium acetate=70:30 Flow rate: 1.0 mL/min

Temperature: 40 o_C Detection: RI

アプリケーション

0 5 10 15 20

糖の分離に！

スクロースとパラチノースの分離 1. Sucrose 2. Palatinose Column: SunArmor NH₂, 5 µm 250 x 4.6 mm Mobile phase:

Acetonitrile/50 mM ammonium acetate=75/25 Flow rate: 1.0 mL/min

Temperature: 40 o_C Detection: RI 1 2 Retention time/min 0 5 10 2 1 3 Retention time/min 1. L-Leucine 2. L-Isoleucine 3. L-Valine

アミノ酸の分離に！

分岐鎖アミノ酸の分離

(23)

0 5 10 15 20 1 3 2 4 5

アプリケーション2

1. Grycerine Retention time/min 2. Erythritol _{3. Xylitol} 4. Sorbitol 5. Mannitol Column: SunArmor NH₂, 5 µm 250 x 4.6 mm Mobile phase: Acetonitrile:Water = 80:20 Flow rate: 1.0 mL/min

Temperature: 40 o_C Detection: RI

糖アルコールの分離に！

0 2 4 6 8 10 12 14 Retention time/min Column: SunArmor NH₂, 5 µm 250 x 4.6 mm Mobile phase: Acetonitrile/Water = 60/40 Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 25 o_C

Detection: RI, Sample: 1= α-Cyclodextrin, 2= β-Cyclodextrin, 3=γ-Cyclodextrin

C18 カラムのエンドキャッピングは ここまで進化した! 耐久性を実現する 技術とその性能 クロマニックテクノロジーズ塚本友康小島瞬長江徳和