新技術説明会　様式例

(1)

医学・生物学研究と診断のための

NanoSuit

_®

Technologyの応用

Direct observations on biological wet

samples in an electron microscope using

NanoSuit

_®

technology: Aiming for the new

medical diagnosis

光尖端医学教育研究センター

ナノスーツ開発研究部

Preeminent Medical Photonics Education & Research Center

Institute for NanoSuit Research

(2)

2

研究概要

高真空を必要とする電子顕微鏡では、80％ほどの水分

を含む生物試料の形状を維持させながら固定・脱水する

という長い時間の工程が必要だった。NanoSuit

®

_法は、

生物試料周辺にナノ薄膜を、短時間の内に形成させ、濡

れたままの生物試料を観察するという技術であり、試料

そのものの形状を観察できる。生物適合性高分子溶液を

使用して、短時間で、生きたまま濡れたままの観察技術

を医療応用する点に特長がある。

An electron microscope requires a high vacuum condition, therefore, the complicated procedures have been needed to maintain the shape of biological samples containing as much as 80% of moisture. The NanoSuit®_{method is a}

technique to form a nano thin film on the surface of a biological sample using biocompatible polymer solution. It has an advantage to develop medical applications to observe wet and living samples as it is in a short time.

(3)

観察法の開発によって迎えた多くのパラダイムシフト

ヒトは視覚性動物です。見ることが理解に繋がる。

1600～　光学顕微鏡　生命科学におけるパラダイムシフト

　

細胞説の発見（全ての生き物は細胞からなる）

Paradigm shift 1930～　電子顕微鏡　1950～　生命科学でも電子顕微鏡が利用 1 nm 10 nm 100 nm 1 μm 10 μm 100 μm1 mm 10 mm 100 mm 裸眼

光学顕微鏡

電子顕微鏡（

in high vacuo

）

Prokaryotic Eukaryotic Virus Multicellular

不可欠

な機器

1838 Shleiden 1839 Shwann 生命科学におけるパラダイムシフト

　

細胞の中に細胞内小器官がある。Virusが病原体。

1986

Ernst Ruska

(4)

4

Arthropoda

(5)

1mm 1mm 500 μm

Coelenterata Platyhelminthes Arthropoda

100 μm

death

300 μm

death

200 μm

death

hydra

planarian

Mosquito larva

500 μm Arthropoda 200 μm

Live

Drosophila l

arva

(6)

6

Larva of

Drosophila melanogaster

in FE-SEM

Arthropoda

(7)

細胞外に存在するネバネバ（細胞外物質

ECS) に対して、

電子線照射をするかプラズマ照射をして成膜すると

高真空内で生命維持できた。

高分子素材の選択で、

ECSの代わりをする。

We chose amphiphilic molecules. （NanoSuit® solution）

and irradiated.

次は、ネバネバ

ECS(細胞外物質）

をもたない生物の

生命維持

ECS mimetic substance

バイオミメティックス

500 μm Arthropoda 200 μm

death

Mosquito larva

When the animal possesses Extracellular Substance（ECS) and when irradiated by

electrons or plasma, they can survive in high

vacuo.

Next, we must keep living animal which do

not possess ECS on their surface・・・

(8)

8

larva of a mosquito,

Aedes albopictus

_FE-SEM

Without

NanoSuit

With

(9)

(10)

(11)

D

E

C

30 min

control

B

0 min

A

plasma 0.3mm 0.3mm 1µm 200nm

細胞外物質（ECS）と同じように成膜する高分子溶液を開発すると

We could make self-standing ultra-thin

films from water soluble amphiphilic molecules

.

NanoSuit（-）

30 min 0 min plasma

NanoSuit

G

H

I

J

F

0.3mm 0.3mm 1µm 200nm

ECS様物質

NanoSuit（+）

Dry

Wet

蚊の幼虫をそのまま電子顕微鏡に入れると脱

水・脱気されますが, NanoSuit

®

_{溶液で前処}

理をおこなうとNanoSuit

®

_{が形成され生命維}

持が可能になります。

(12)

12 0.75cm 1.0cm 2.0cm Window

(a)

(c)

(b)

(d)

自立膜（

Self-standing Membrane

）

多様な高分子素材

から作成可能。

（資材に対してのノウハウあり）

(13)

Covered with ECS mimic solution

Irradiated by

electron beam or plasma

observation↓

↓

NanoSuit method

Living organisms ↓

Need three minutes. カップラーメン　Cup RAMEN noodle 　 First Fixation Second Fixation Dehydration Desiccation Covered by metal GA and/or PFA O_SO₄ Gold O_SO₄ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ observation

conventional SEM method

Need at least a whole day.

従来技術とその問題点

(14)

14

ナノスーツの組織・培養細胞観察への応用

濡れたままの組織を電子顕微鏡観察が可能です

組織、培養細胞

G

E

30µm 10µm

D

H

10µm 10µm

A

5mm

C

10µm Traditional Method NanoSuit Method

Tissue

Mouse

（

Peritoneum）

Cell

Human

(Fibroblast)

Wet

Dry

(15)

ナノスーツ法を用いた生体微粒子の

定量・定性法の開発

(16)

16

ナノスーツ法の病理検体への応用

(17)

病理標本観察キット（光学顕微鏡と電子

顕微鏡の併用: 観察後に再保存も可能）

ナノズーマーナノスーツ液塗布 ex.　HE染色切片カバーグラスはずすナノスーツ法の組織切片への応用光学顕微鏡観察 HE標本、免疫染色標本などの光学顕微鏡写真撮影電子顕微鏡観察ナノスーツ液塗布によって導電性付与可能スピンコートカバーグラスで封入再染色も可能チァージ無し大切なプレパラートを観察後に保存高倍観察可能

(18)

18

微量液滴装置によるマーキング

光学顕

微鏡像

電子顕

微鏡像

H&E

再染色像

(19)

ナノスーツ（+）ナノスーツ（-）

炭素蒸着

含水状態でより立体的な3-D像

肺組織

ナノスーツによるチャージ軽減効果

ナノスーツ(-)

ナノスーツ(+)

(20)

20

真菌

原虫

細菌

ウイルス

H&E染色

FE-SEM観察

光学・電子顕微鏡、NanoSuit

®

_{法病原体観察}

（Correlative Microscopy）

：核

：胞子

：食胞

：収縮胞

：ウイルス粒子

(21)

癌細胞観察(Correlative Microscopy)

核染色法の開発

悪性中皮腫

胃癌

乳癌

H&E

SEM:

反射電子

mode

SEM:

反射電子＋2次電子

mode

(22)

22

悪性中皮腫

胃癌

乳癌

骨格筋

腎臓

タコ足細胞

組織間細線維

：M line

：ミトコンドリア

：Z line

組織微細構造の観察

(23)

DAB染色部位の光学顕微鏡およびSEM観察

大腸（β-actin免疫染色（DAB染色））

ナノスーツ法を用いることでDAB染色部位を走査型電子顕微鏡で観察可能とする

光学顕微鏡

SEM(増感(+))

SEM(増感(-))

(24)

24

乳癌

HER2

Score 3+

HER2

Score 0

金粒子による抗原部位同定

DAB染色

SEM

FE-SEM

(25)

NanoSuit method combined with EDS.

To detect elements.

（

E

nergy

D

ispersive X-ray

S

pectrometry ）

NanoSuit®法を用いると

(26)

26 H&E染色反射電子 mode EDX EDX

肝臓

組織

（鉄沈着） H&E染色反射電子 mode EDX EDX H&E染色反射電子 mode EDX EDX

肺

組織

（炭粉沈着)

ナノスーツによるパラフィン切片の元素分析

ナノスーツ法を用いることで金属元素は勿論、Cなどの軽元素の同定も可能

(27)

l 光学顕微鏡とSEMで同一部位を簡単に観察可能

l SEM観察後でもH&E標本をもとの状態にもどすことが可能

l 病原体などをSEMで高倍率で観察することが可能

l 組織の微細構造を観察することが可能

l SEM観察における細胞核の同定が可能

l DAB染色における部位特定が可能

l 蛋白発現量の測定ができる可能性がある

l パラフィン組織切片の元素分析が可能

想定される用途と可能性

ナノスーツ法によってパラフィン切片観察で可能になったこと

(28)

28

(29)

(30)

30

実用化に向けた課題

®現在、ナノスーツ溶液について組織、切片、

生体微粒子が観察可能なところまで開発済

み。しかし、高解像度の電子顕微鏡の小型

化が未解決である。

®観察技術として実用化レベルとなった。今

後は、より多くの試料の観察により、ノウ

ハウの一層の蓄積することが必要。

(31)

本技術に関する知的財産権

®発明の名称：病理組織標本または細胞診標本の電

子顕微鏡による観察方法

®出願番号：特願2018-160921

®出願人：浜松医科大学

®発明者：針山孝彦、河崎秀陽

(32)

32

新技術説明会 様式例

医学・生物学研究と診断のための

NanoSuit

®

Technologyの応用

Direct observations on biological wet

samples in an electron microscope using

NanoSuit

®

technology: Aiming for the new

medical diagnosis

光尖端医学教育研究センター

ナノスーツ開発研究部

Preeminent Medical Photonics Education & Research Center

Institute for NanoSuit Research

研 究 概 要

高真空を必要とする電子顕微鏡では、80％ほどの水分

を含む生物試料の形状を維持させながら固定・脱水する

という長い時間の工程が必要だった。NanoSuit

法は、

生物試料周辺にナノ薄膜を、短時間の内に形成させ、濡

れたままの生物試料を観察するという技術であり、試料

そのものの形状を観察できる。生物適合性高分子溶液を

使用して、短時間で、生きたまま濡れたままの観察技術

を医療応用する点に特長がある。

観察法の開発によって迎えた多くのパラダイムシフト

ヒトは視覚性動物です。見ることが理解に繋がる。

細胞説の発見（全ての生き物は細胞からなる）

光学顕微鏡

電子顕微鏡（

in high vacuo

）

不可欠

な機器

細胞の中に細胞内小器官がある。Virusが病原体。

1986

Ernst Ruska

death

death

death

hydra

planarian

Mosquito larva

Live

Drosophila l

arva

Larva of

Drosophila melanogaster

in FE-SEM

細胞外に存在するネバネバ（細胞外物質

ECS) に対して、

電子線照射をするかプラズマ照射をして成膜すると

高真空内で生命維持できた。

高分子素材の選択で、

ECSの代わりをする。

We chose amphiphilic molecules. （NanoSuit® solution）

and irradiated.

次は、ネバネバ

ECS(細胞外物質）

をもたない生物の

生命維持

ECS mimetic substance

バイオミメティックス

death

When the animal possesses Extracellular Substance（ECS) and when irradiated by

electrons or plasma, they can survive in high

vacuo.

Next, we must keep living animal which do

not possess ECS on their surface・・・

larva of a mosquito,

Aedes albopictus

FE-SEM

Without

NanoSuit

With

D

E

C

control

B

新技術説明会　様式例

_®

_®

研究概要

_法は、

_FE-SEM

_{溶液で前処}

_{が形成され生命維}

ナノスーツ（+）ナノスーツ（-）