PowerPoint プレゼンテーション

ゲノム編集技術が与える

医学へのインパクト

―遺伝子改変マウス作製への応用を中心に―

メディカルサイエンス推進研究所

遺伝子実験センター

中 島 修

1

2015.7.22 メディカルサイエンス推進研究所技術セミナー

ゲノム編集は

PCR以来のゲームチェンジャー

（

game changer:世論の動向を大きく変える出来事）

2

3

4

本日のメニュー

1. ゲノム編集の原理

2. ゲノム編集の歴史と展望

3. マウス受精卵でのゲノム編集

4. ゲノム編集の遺伝子改変マウス作製への応

用

5. 山形大学医学部遺伝子実験センターでのこ

れまでのゲノム編集による遺伝子改変マウ

スの作製の実際

6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受

託作製の手順

5

ゲノム編集技術とは？

ゲノム編集（

Genome Editing）とは、人工ヌクレ

アーゼの

Zinc Finger Nucleases（ZFNs）や

Transcription Activator-Like Effector Nucleases

（

TALENs）、CRISPR/Cas

システムを用いてゲノム上

の標的遺伝子の破壊やレポーター遺伝子のノッ

クインなどを可能にする技術である。（

Joung and

Sander, Nat Rev Mol Cell Biol, 2012; Barrangou,

Nat Biotechnol, 2012）。

6

ゲノム編集コンソーシアムHPより http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/genome_editing/index.html

ゲノム編集で利用される人工ヌクレアーゼ

人工ヌクレアーゼ

(ZFNやTALEN)は、DNAに特異的に結

合するドメインと、制限酵素

FokIのDNA切断ドメインを連

結させたキメラタンパク質である。２つの人工ヌクレアー

ゼが近接する標的配列に結合すると

DNA切断ドメイン

が２量体となり

DNAを切断する。

7

ZFN,TALEN

特異的に認識できる配列をデザインするには、何種類かのDNA結合ドメインを適切に組み 合わせた融合タンパク質をつくる必要があり、初心者は手を出しにくい系である ゲノム編集コンソーシアム_HPより http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/genome_editing/index.html

CRISPR/Cas

システムとは？

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindro

mic Repeat; クリスパー) には多くのプロトスペーサー

配列が含まれており、この配列はウィルス（ファージ）

ゲノムなどの種々の外来

DNAと相同性がある。このプ

ロトスペーサー配列をもった

RNAがCAS(Crispr

associated, an

RNA

-guided

DNA

endonuclease

associated with the

CRISPR

)に結合して、

プラスミド

や

ファージ

といった外来

DNAを識別するプローブとなって、

CRISPR/Casが外来DNAのみを切断させるため、細菌の

獲得免疫として機能している。

9 http://www.addgene.org/crispr/reference/history/ 細菌ゲノム内CRISPRが存在 CRISPRが転写され、 pre-crRNAが出来る pre-crRNAとtracrRNA がCas9に結合し、さら にRNaseIIIが結合する RNaseIIIがpre-crRNAを切断 して、crRNA:tracrRNA:Cas9 複合体を形成させる

10 http://www.addgene.org/crispr/reference/history/ PAM配列が3’側に存 在するProtospacer配 列が標的DNAとなる。 Protospacer配列がcrRNA と相補対を形成し、Cas9ヌ クレアーゼが標的配列上 位で、二本鎖切断（DSB)を 行う DSB A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Jinek M,

Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.

Figure 6-27 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)

非相同末端連結

nonhomologous

end-joining

による二本

鎖切断の修復

偶発的な二本鎖切断 切断部位の末端をヌクレア ーゼにより加工 DNAリガーゼにより末端 を連結 二本鎖切断は修復されるが、 修復部位でヌクレオチドの欠 失が生じる

Figure 6-29 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)

相同組換え

による

二本鎖切断の

修復

相同なDNA二重らせん 二本鎖切断 ヌクレアーゼによる5’末端の消化 鎖の侵入 _分岐点 DNA合成と分岐点の移動 分岐点の移動とDNA合成の進行 DNA連結 二本鎖DNA切断は精確に修復される（欠失はない） DNAが複製された直後に 始まる ←複製された２つの二本 鎖が互いにまだ、近くに あるため 相同組換えは、様々な DNA損傷に利用できる汎 用的な修復機構 ←無傷の相同染色体があ れば、可能 ←同一染色体は染色体複 製のたびにつくられる

（

NHEJ）

小さい欠失等が生じる

（

HR）

二本鎖DNA切断（DSB) 二本鎖DNA切断（DSB) 相同染色体を使って欠失を起こさず修復 相同染色体

細胞の中で起こった

DNA二本鎖切断の2通りの修復

京都大_HPより 13 相同な_{DNAが存在する場合のみ起こる} ヌクレアーゼにより5’末端 の一部が消化され削られる 相同染色体（DNA）を 鋳型にして修復される ヌクレアーゼによ り5’末端の一部が 消化され削られる

14

http://www.addgene.org/crispr/guide/

15

http://www.addgene.org/crispr/guide/ Single or double strand Donor DNA

16

1本鎖ガイドRNA（sgRNA）による

CRISPR/CAS9システムの開発

sgRNA

細菌の

CRISPR/CASシステムではcrRNAと

tracrRNAの二種のRNAがCas9の遺伝子座へ

のターゲティングには必要であるが、

1本に

つなげたキメラ

RNA（sgRNA）をデザインして、

sgRNAとCas9の2者複合体でヌクレアーゼ活

性を発揮させることが可能になった

Science Vol. 337 pp. 820 （2012）

CRISPR/CAS9システム用オールインワンベクターpX330

17 U6:全身性U6プロモーター。U6遺伝 子はスプライソソームを構成する₅ つの核内低分子リボ核タンパク質 （snRNP）の一つ CBh:全身性トリβアクチンハイブリッ ドプロモーター 標的遺伝子座に対するガイドシークエンス20bpをク ローニングすると、目的の_{sgRNAとCas9 mRNAを同時に} 発現させることが可能な、哺乳類細胞での発現ベク ターとなる。これを細胞の中に入れれば、二本鎖切断 が起こせる http://www.addgene.org/

CRISPR/CASによるゲノム編集とは

ゲノムの任意の遺伝子座で、遺伝子破壊と任意の

変異の導入（編集）を行う技術

１．非相同末端連結

Non Homologous End Joining (NHEJ)による修復が

起こる場合

⇒当該遺伝子で欠失が生じ、

exon上で起こった場合はフレームシフト変

異となる可能性が高いため、

遺伝子破壊

ができる。

２．人工的に任意の変異を導入した相同遺伝子断片（ドナー

DNA）を修

復時に同時に存在させた時に、相同組換え修復

Homologous

Recombinant Repair (HRR)による修復が起こる場合

⇒当該遺伝子には、ドナー

DNAに由来する

変異が導入

される（編集され

る）

18

CRISPR/CASにより生じた二本鎖切断に対して

本日のメニュー

1. ゲノム編集の原理

2. ゲノム編集の歴史と展望

3. マウス受精卵でのゲノム編集

4. ゲノム編集の遺伝子改変マウス作製への応

用

5. 山形大学医学部遺伝子実験センターでのこ

れまでのゲノム編集による遺伝子改変マウ

スの作製の実際

6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受

託作製の手順

19

20

Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M. & Nakata, A. J. Bacteriol. 169,5429–5433 (1987).

21

Jinek, M. et al. Science 337, 816–821 (2012).

点変異や短い配列の挿入を起 こす場合は_{1本鎖DNAでも可能} 欠失が多いが小さな置換など も起こりうる 点変異導入や元々ない配 列の挿入が可能 タカラバイオ_HPより 22

23 ヌクレアーゼ活性を持たないDead Cas 転写制御 エピゲノム修飾 イメージング 染色体レベルで の遺伝子改変

CRISPR/Cas9の応用

24

https://en.wiki pedia.org/wiki/ Epigenome_edi ting

25

26

Oye, K. A. et al. Science 345, 626–628 (2014).

“CRISPR Gene drive”

27

28

ヒト胚（ただし、前核が

3つある異常受精卵）に対する

CRISPR/Cas9を介したゲノム編集

Cell Cycle Ahead of Print DOI: 10.1080/15384101.2015.1046791

ヒト幹細胞での

ゲノム編集によ

る

HIVに対する

遺伝子治療

CCR5 found on the surface of white

blood cells acts as a co-receptor for

HIV entry to the host cells.

筋ジストロフィ患者由来

iPSに対する

ゲノム編集による遺伝子治療

ゲノム編集によるヒト胚に対する遺伝子治療の論点

• 精確さ

inaccurate editing and

off-target

（二本鎖切断が起

こる目的外遺伝子座）

mutations

•

Monogenic disease such as Huntington’s disease

• 胚に対するゲノム編集は現実的に困難

•

IVF embryos using preimplantation genetic diagnosis (PGD)

•

PGDによる胚の選別による代替可能なケースが多い

• ホモ接合体の胚（例：同一遺伝子変異の聾者同士の胚）

の場合は

PGD代替不可

•

Reducing the risk of common diseases like APOE ε4 variant

(Alzheimer’s disease and cardiovascular disease), PCSK9

(myocardial infraction)

33

本日のメニュー

1. ゲノム編集の原理

2. ゲノム編集の歴史と展望

3. マウス受精卵でのゲノム編集

4. ゲノム編集の遺伝子改変マウス作製への応用

5. 山形大学医学部遺伝子実験センターでのこれ

までのゲノム編集による遺伝子改変マウスの

作製の実際

6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受託

作製の手順

34

マウス受精卵でのゲノム編集の報告

35

36

A

ES細胞での５重遺

伝子破壊クローン

の作成

B

マウス受精卵で

の二重遺伝子破

壊マウスの作製

マウス受精卵で

の二重相同組み

換え体の作製

Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.

37

Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.

Ten-eleven translocation family members

Tet1, Tet2, Tet3での標的配列

エキソン内にある制限 酵素サイトを切断する デザイン

38

一組

の

CRISPR/CAS9 mRNAのマウス受精卵細胞質への

マイクロインジェクションにより変異遺伝子座（切断・非相同

末端連結による欠失）の

ホモ

接合体が高確率で作出

70～90％の産子はホモ接合体

Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.

39 実際に出来る変異遺伝子座は数bp~数十bpの欠失が多いが、挿入の場合もある 制限酵素サイトが 無くなるので、検出 される断片が長くな る バンドが1本なので ホモが多い

40

二種の

CRISPR/CAS9 mRNAのマウス受精卵前核への

マイクロインジェクションによる

二重遺伝子破壊マウスの作出

41

二種の

CRISPR/CAS9

mRNA・1本鎖ドナー

DNAのマウス受精卵

前核へのマイクロイン

ジェクションによる

二重

2塩基変異導入

マ

ウスの作出

相同組換えのホモ 相同組換えと欠失のヘテロ 相同組換えと欠失のヘテロ 相同組換えと欠失のヘテロ Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.

42

http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/CRISPRデザイン法20131219.pdf

大阪大学微生物病研究所 伊川正人先生のプロトコール

43

44

http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/CRISPRデザイン法20131219.pdf

45

CRISPR/Cas9 vector

環状のCRISPR/Cas9 vectorとdonor oligo DNAを導入

問題点：ベクターのゲノム挿入が起こりうる。RNAインジェクションではこの点は回避

できる。

CRISPR/Cas9プラスミドベクターの

C57BL/6Jマウス受精卵への導入

Donor oligo pX330 CBh Flag-NLS-hSpCas9-NLS pA U6 target gRNA 筑波大学基礎医学系 高橋智教授 _{H26山形大学大学院講義資料より一部改変}

NHEJ:

非相同末端連結

HR:

相同組換え修復

CRISPR/CASによる個体でのゲノム編集の利点

• 汎用性が高く、簡便で低コスト（

↔ ZFN・TALEN , ES細

胞）

• 受精卵が得られればどんな生物種でも可能（実施例：

ラット、ウサギ、豚、ゼブラフィッシュ、アクソロートル、

サル）

• もちろん、マウス系統も

C57BL/6に限らない

• 遺伝子改変マウスが比較的短期間で作出可能

• 多重遺伝子破壊が簡便にできる

•

1回の実験でホモ変異体の作出が期待できる（交配

不要）

• 単純遺伝子破壊のみならず、ドナー

DNA次第で様々

な遺伝子改変が可能

48

Off-target問題

•

Few studies using whole genome analysis

already showed that the mutation rates induced

with Cas9 endonucleases are not systematically

higher than spontaneous (non-induced) natural

mutations

•

Off-target remains ultimately much less critical

for mice as for human genome engineering, as it

is easily diluted out amongst generations

49

Delerue and Ittner, Clon Transgen 2015, 4:1 http://dx.doi.org/10.4172/2168-9849.1000135

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れまでのゲノム編集による遺伝子改変マウ

スの作製の実際

6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受

託作製の手順

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51

Science 5 SEPTEMBER 2014 • VOL 345, 1184-1188

筋ジストロフィーマウス受精卵に対する

CRISPR/Cas9を介したゲノム編集による

52

53

54

ゲノム編集マウスでのジストロフィンタンパク質発現の回復

55

ゲノム編集マウスでの血清クレアチンキナーゼの低

下と前足握力の回復

56

成体遺伝性チロシン血症マウスに対する

sgRNA/Cas9mRNA/donor DNA尾静注による治療

（肝機能の回復）

Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):551-3.

fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)

57

成体遺伝性チロシン血症マウスに対する

sgRNA/Cas9mRNA/donor DNA尾静注による治療

（肝機能の回復）

58

Cell 159, 440–455, October 9, 2014

Rosa locus（すべての組織で発現）へのCas9 Knock-inマウスの確立と

59

Rosa26領域

Rosa26領域にβガラクトシダーゼ遺伝子が挿入されたマウス

の系統は

全身すべての細胞が

X-gal染色陽性

となるため，移

植実験のコントロールとしてきわめて有用であった．さらに

β

ガラクトシダーゼ遺伝子を他のマーカー遺伝子と置換しても

全身にマーカーを発現されることが可能で，レポーターコン

ストラクトの挿入に頻用されている

すなわち、どの組織でも発現するということは、組織特異的

なエピジェネティックな抑制制御を受けない遺伝子座といえ

る。

https://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/keyword/474.html Cell 159, 440–455, October 9, 2014

Schematic of the Cre-dependent Cas9 Rosa26 targeting vector

60

In Vivo Genome Editing in the Brain of

Cre-Dependent Cas9 Mice

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1. ゲノム編集の原理

2. ゲノム編集の歴史と展望

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スの作製の実際

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託作製の手順

61

62

1本につなげたキメラRNA（sgRNA）をオリゴハウスでRNA合成するには

長すぎるため、組換え実験が必要となる

Science Vol. 337 pp. 820 （2012）

遺伝子実験センターでは組換え実験を省略するため

crRNA/tracrRNA/Cas9のシステムを利用

（

crRNA/tracrRNA/Cas9 mRNAをco-injection）

75nt 共通で使える _{sgRNA 101nt} 42nt 個別の実験で デザインする

遺伝子実験センターでのゲノム編集

マウス受託作製の手順

1. 依頼者：ガイドRNA（crRNA）の配列のデザイン

2. 依頼者：オリゴRNA/ドナーDNAの注文

3. センター：ガイドRNA(crRNA)を介したDNA切断活

性のin vitroでの確認

4. センター：マウス受精卵前核へのCRISPR/CAS9

mRNA, ss donorDNAの導入

5. 依頼者：ゲノム解析による変異個体の確認

63

1.1 ガイドRNA（crRNA）の配列のデザイン

• 標的配列は、

PAM配列（NGG）の上流（5’側）に、

20ntを設定する

•

DSBはPAM上流3bpで起こる（図）

• ガイド

RNAの配列決定にはOff-Target（目的外の遺

伝子座）での切断の可能性の排除と

PAM配列の検

索のため、

http://crispr.dbcls.jp/

などで配列候補

を検索する

5’-TGTATGAGACCACNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNAGG-3’ 3’-ACATACTCTCCTGNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNTCC-5’ 切断個所（PAMより3nt上流） 64 PAM 20nt 標的配列

65

1.2 ガイドRNA（crRNA）の配列のデザイン

•

crRNA配列は検索した20nt（PAM配列は除く）の3’側に

GuuuuaGAgcuaugcuguuuUGを付加した42nt RNA（図）とな

る。

•

ただし、点変異を導入する場合、切断個所は点変異導入

箇所により近い方が好ましいため、候補が限られる。

•

tracrRNAはセンター側で用意したものを実験に用いる。

68

crRNA配列 42nt RNA

5’-XXXXXXXXXXXXXXXXX

GuuuuaGAgcuaugcuguuuUG

PAM配列を除いた20ntを

22nt

につなげる

tracrRNA 75nt RNA

5’-

aaacagcauagcAAGUuaaaaU

aaggcuaguccguuaucaacUUGAAaaaGUGgcaccgaGucggu

gcUUUuuuU

2. オリゴRNA/DNAの注文

•

1.でデザインしたcrRNA(42mer)を依頼者が注文する。

• ドナー

DNAを利用する場合、変異導入塩基の両側45ntずつの相同

領域を含む

1本鎖オリゴDNA

(~90mer)を設計し（図）、センターでの

切断活性試験の結果をみてから注文する。

（切断活性が無い場合は

crRNAデザインを変更した方が良い場合があ

るため）

• 現時点で、

crRNA（HPLC精製グレード）は株式会社ジーンデザイン

URL:

http://www.genedesign.co.jp/

で、ドナーDNA（PAGE精製グ

レード）はIDT URL

https://sg.idtdna.com/site

（日本代理店MBL)で

合成されたもので実験可能なことを確認している。実績があれば、

オリゴハウスはどこでも可

73

1本鎖ドナーDNA 45nt+Mutation+45nt

5’-XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX

M

XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX

loxPなど短い配列（40~50nt）を挿入する場合、相同領域として、前後に>60ntずつ繋

げる

• 依頼者は、2.のcrRNAと増幅し

た標的遺伝子座のPCR産物を

遺伝子実験センターに送付す

る

• 遺伝子実験センターにおいて、

これらに、CAS9タンパク質,

tracrRNAを加え、37℃でイン

キュベート後、電気泳動により

二本鎖切断反応がin vitroで起

こることを確認する（図)

• 切断が確認されない場合は、

crRNAの塩基配列の再検討を

行う。

(-)

Int

3/

int

5

Int

3

Int

5

19.3kb 7.7kb 6.2kb 4.3kb 3.5kb 1.9kb 2.7kb 0.9kb 0.4kb

3. ガイドRNA(crRNA)を介したDNA切断活性のin vitroでの

確認

5. ゲノム解析による変異個体の確認

•

産子の尾を依頼者に送付する。

•

ゲノムDNAを抽出し、PCRによる標的遺伝子領域の増幅後、制限酵素処理や塩

基配列解析、電気泳動などにより、標的遺伝子座での変異を、依頼者が確認す

る。変異のある個体を、遺伝子実験センターから依頼者へ譲渡する。

伊川 正人 領域融合レビュー, 3, e008 (2014)より 75

4. マウス受精卵前核へのCRISPR/CASベクターの導入

• 依頼者から送られたcrRNA,ドナーDNAに、tracrRNA, Cas9 mRNAを

加えた混合液を、遺伝子実験センターにおいて、C57BL/6受精卵前

核へ導入する。

76

マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法

エレクトロポーレーションによる受精卵への遺伝子導入

77

マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法

エレクトロポーレーションによる受精卵への遺伝子導入

78

マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法

卵管でのエレクトロポーレーションによる遺伝子導入

79

Scientific Reports | 5:11406 | DOI: 10.1038/srep11406

マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法

卵管でのエレクトロポーレーションによる遺伝子導入

81

ゲノム編集受託作製負担金は

1系統40万円（ただし、学内