6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受託 作製の手順
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マウス受精卵でのゲノム編集の報告
Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918. 35
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A ES
細胞での５重遺 伝子破壊クローン の作成B
マウス受精卵で の二重遺伝子破 壊マウスの作製
マウス受精卵で の二重相同組み 換え体の作製
Cell. 2013 May 9;
153(4): 910–918.
Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918. 37
Ten-eleven translocation family members Tet1, Tet2, Tet3 での標的配列
エキソン内にある制限 酵素サイトを切断する デザイン
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一組の
CRISPR/CAS9 mRNA
のマウス受精卵細胞質へのマイクロインジェクションにより変異遺伝子座（切断・非相同 末端連結による欠失）のホモ接合体が高確率で作出
70
～90
％の産子はホモ接合体Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.
実際に出来る変異遺伝子座は数bp~数十bpの欠失が多いが、挿入の場合もある 39
制限酵素サイトが 無くなるので、検出 される断片が長くな る
バンドが1本なので ホモが多い
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二種の CRISPR/CAS9 mRNA のマウス受精卵前核への
マイクロインジェクションによる 二重遺伝子破壊マウスの作出
Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.
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二種の
CRISPR/CAS9 mRNA
・1
本鎖ドナーDNA
のマウス受精卵 前核へのマイクロイン ジェクションによる二重
2
塩基変異導入マ ウスの作出相同組換えのホモ 相同組換えと欠失のヘテロ
相同組換えと欠失のヘテロ 相同組換えと欠失のヘテロ Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.
http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/CRISPRデザイン法20131219.pdf 42
大阪大学微生物病研究所 伊川正人先生のプロトコール
http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/CRISPRデザイン法20131219.pdf 43
http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/CRISPRデザイン法20131219.pdf 44
Single Strand Annealing
http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/CRISPRデザイン法20131219.pdf 45
CRISPR/Cas9 vector
環状のCRISPR/Cas9 vectorとdonor oligo DNAを導入
問題点：ベクターのゲノム挿入が起こりうる。RNAインジェクションではこの点は回避 できる。
CRISPR/Cas9
プラスミドベクターのC57BL/6J
マウス受精卵への導入Donor oligo
pX330
CBh Flag-NLS-hSpCas9-NLS pA U6 target gRNA
筑波大学基礎医学系 高橋智教授 H26山形大学大学院講義資料より一部改変
NHEJ:
非相同末端連結 HR:
相同組換え修復
熊本大HPより
CRISPR/CAS による個体でのゲノム編集の利点
• 汎用性が高く、簡便で低コスト（ ↔ ZFN ・ TALEN , ES 細 胞）
• 受精卵が得られればどんな生物種でも可能（実施例：
ラット、ウサギ、豚、ゼブラフィッシュ、アクソロートル、
サル）
• もちろん、マウス系統も C57BL/6 に限らない
• 遺伝子改変マウスが比較的短期間で作出可能
• 多重遺伝子破壊が簡便にできる
• 1 回の実験でホモ変異体の作出が期待できる（交配 不要）
• 単純遺伝子破壊のみならず、ドナー DNA 次第で様々 な遺伝子改変が可能
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Off-target 問題
• Few studies using whole genome analysis
already showed that the mutation rates induced with Cas9 endonucleases are not systematically higher than spontaneous (non-induced) natural mutations
• Off-target remains ultimately much less critical for mice as for human genome engineering, as it is easily diluted out amongst generations
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Delerue and Ittner, Clon Transgen 2015, 4:1 http://dx.doi.org/10.4172/2168-9849.1000135