技術論文 各種 HBc 抗体試薬の性能比較 低力価試料を用いた 特異性評価 岩瀬 友也 1) 脇本 幸夫 1) 大根久美子 1) 田中 靖人 1) 2) 1) 名古屋市立大学病院中央臨床検査部 ) 名古屋市立大学大学院医学研究科病態医科学 要 小池 史泰 1) 可児 里美 1)

技術論文

各種 HBc 抗体試薬の性能比較―低力価試料を用いた

特異性評価―

岩瀬　友也

大根久美子

小池　史泰

可児　里美

脇本　幸夫

田中　靖人

ても起こり得る。今回，化学発光免疫測定法（chemiluminescent immunoassay; CLIA 法）あるいは化学発光酵素免疫測定法 （chemiluminescent enzyme immunoassay; CLEIA 法）を原理とする HBc 抗体測定試薬 3 法において，基準値 1.0 C.O.I.付近の 低力価試料を対象に特異性評価を行った。その結果，HBc 抗原・抗ヒト（IgG）抗体の 2 ステップサンドイッチ法同士で は判定一致率が 96.1%であったのに対し，HBc 抗原・HBc 抗原の 2 ステップサンドイッチ法と HBc 抗原・抗ヒト（IgG） 抗体の 2 ステップサンドイッチ法との間では判定一致率が 79.2%および 80.5%と低い傾向が見られた。判定不一致例につ いて精査したところ，いずれの測定法でも偽陰性・偽陽性が存在しており，カットオフ値付近の低力価検体に対してはど の方法も判定が困難であることが示唆された。HBV 既往感染スクリーニング検査として HBc 抗体検査は有用であるが， 既に免疫抑制・化学療法などが実施されて抗体価が低下している場合には，単独での判定に限界があるものと思われた。 キーワード HBc抗体，CLIA 法，CLEIA 法，HBV 既往感染スクリーニング I　はじめに HBs抗原陰性で HBc 抗体ないし HBs 抗体が陽性 の B 型肝炎ウイルス（HBV）既往感染者において， リツキシマブなどの強い免疫抑制剤を使用すると HBVが再活性化し，劇症肝炎を発症することが報告 されている1)_{。このため，HBV 既往感染者について} も HBV 再活性化リスク群としての対策が必要であ り，「免疫抑制・化学療法により発症する B 型肝炎 対策ガイドライン（厚生労働省研究班）」が策定され た2)_{。このガイドライン策定により，HBV 既往感染} 者スクリーニングのための HBc 抗体検査が見直され ており，より高感度で特異性の高い測定法を用いて 検査することが望まれる。また，HBV 既往感染者で は免疫抑制・化学療法中あるいは治療後に，HBs 抗 体価や HBc 抗体価が低下している場合（中には陰性 化）があり，注意を要する3)。以上のことから今回 われわれは，今まで注目されていなかった判定ライ ン付近の検体に着目して，試薬間による判定の違い を検討したので報告する。 II　方 法 1．材料 当院において HBc 抗体検査が依頼された検体のう ち，現行法である全自動免疫測定装置 HISCL-2000i （以下 HISCL）とその専用試薬による測定結果が基 準値 1.0 C.O.I.付近（0.1～2.0 C.O.I.）の検体 77 例。 なお，測定まで血清は–70℃保存とした。全ての検体 は当院倫理規定のもと患者の同意を得て使用した。 （平成 27 年 6 月 13 日受付・平成 27 年 7 月 27 日受理）

2．機器・試薬

化学発光酵素免疫測定法（CLEIA 法）を原理とす る測定機器 HISCL および専用試薬 HISCL® _HBcAb

試薬（機器・試薬ともに Sysmex 社），同じく CLEIA 法を原理とする測定機器ルミパルス Presto II（以下 Presto）および専用試薬ルミパルスプレスト® HBcAb-N（機器・試薬ともに富士レビオ社），さらに CLIA 法を原理とする測定機器 ARCHITECT アナライザー （以下アーキテクト）および専用試薬アーキテクト®・ HBc II（機器・試薬ともにアボットジャパン社）を 用いた。各測定原理の特徴として，HISCL のみ抗原 －抗原の 2 ステップサンドイッチ法であるのに対し， Prestoおよびアーキテクトでは抗原－抗ヒト（IgG） 抗体による 2 ステップサンドイッチ法となっている （Figure 1）。 3．検討内容 1）判定一致率 臨床検体 77 例の HBc 抗体を HISCL，Presto，アー キテクトを用いて測定し，HISCL とアーキテクト， HISCLと Presto，Presto とアーキテクトの各 2 法間 における判定一致率を求めた。 2）乖離検体における追加検査 各 2 法間で測定結果が乖離した検体に対し，肝炎 マーカーとして用いられる HBs 抗原，HBs 抗体， ALT検査を実施した。更に，HISCL のみ陽性の乖離 検体に対し，HBc 抗原液を用いた吸収試験を行った。 III_{結 果} 1．判定一致率 臨床検体 77 例を対象とした HBc 抗体測定 3 法の 結果は，HISCL 陽性が 27 例，Presto 陽性が 26 例， アーキテクト陽性が 29 例であった。HISCL とアー キテクトでは共に陰性が 41 例であったのに対し， HISCLのみ陽性が 7 例，アーキテクトのみ陽性が 9 例であり，判定一致率は 61/77 = 79.2%であった （Table 1）。一方，HISCL と Presto では共に陰性が 43 例であったのに対し，HISCL のみ陽性が 8 例，Presto のみ陽性が 7 例であり，判定一致率は 62/77 = 80.5% であった（Table 2）。さらに Presto とアーキテクト では共に陰性が 48 例，アーキテクトのみ陽性が 3 例，判定一致率は 74/77 = 96.1%であり，Presto とアー キテクトが高い一致率を示した（Table 3）。 2．判定不一致検体における追加検査 各方法間の判定不一致検体は 17 件あった。現行法 の HISCL で陰性判定となった不一致検体は 9 例あ り，全てが HBs 抗原陰性であった（Table 4）。9 例 中 6 例は HBs 抗体陽性であり，うち 3 例（No. 6, 7,

試薬名 HISCL HBcAb試薬 ルミパルス プレスト HBcAb-N アーキテクト ・HBcII

反応原理

CLEIA法 CLEIA法 CLIA法

反応 フロー HBc抗原・HBc抗原 2ステップサンドイッチ HBc抗原・抗ヒトIgG抗体 2ステップサンドイッチ HBc抗原・抗ヒト抗体 2ステップサンドイッチ 補足抗原 _{磁性粒子結合 HBc抗原 磁性粒子結合 HBc抗原 磁性粒子結合 HBc抗原} 標識抗原

（抗体） ALP標識 HBc抗原 ALP標識 抗ヒトIgG抗体 アクリジニウム標識 抗ヒト抗体

磁性粒子 磁性粒子 ALP ALP AMPPD 発光 AMPPD 発光 血清中の HBc抗体 HBc抗原 血清中の HBc抗体 HBc抗原 ALP標識 HBc抗原 ALP ALP ALP標識 抗ヒトIgG抗体 磁性粒子 発光 血清中の HBc抗体 HBc抗原 アクリジニウム標識 抗ヒト抗体 プレトリガー トリガー 再遊離させた アクリジニウム標識 抗ヒト抗体 各 HBc 抗体試薬の測定原理 Figure 1 

8）は 100.0 mIU/mL 以上の高値であった。

一方，HISCL で陽性となった不一致検体は 8 例あ り，8 例中 1 例（No. 1）は HBs 抗原陽性かつ HBV-DNA陽性であった（Table 5）。さらに HISCL 陽性の 不一致検体 8 例に対して HBc 抗原液による吸収試 験を行ったところ，1 例（No. 6）を除き全て HBc 抗 体の吸収を認めた。 HISCL HBc抗体とアーキテクト HBc 抗体検査の判 定一致率 HBc抗体判定 HISCL Total + − アーキテクト + 20 9 29 −  7 41 48 Total 27 50 77 判定一致率：61/77 = 79.2% Table 1  HISCL HBc抗体と Presto HBc 抗体検査の判定一 致率 HBc抗体判定 HISCL Total + − Presto + 19  7 26 −  8 43 51 Total 27 50 77 判定一致率：62/77 = 80.5% Table 2  Presto HBc抗体とアーキテクト HBc 抗体検査の判 定一致率 HBc抗体判定 Presto Total + − アーキテクト + 26  3 29 −  0 48 48 Total 26 51 77 判定一致率：74/77 = 96.1% Table 3  IV_{考 察} 今回われわれは，「免疫抑制・化学療法により発症 する B 型肝炎対策ガイドライン」に基づく B 型肝炎 既往感染例のスクリーニング検査として HBc 抗体検 査の重要性に着目し，カットオフ値（1.0 C.O.I）付 近における 3 法の比較を行った。免疫学的検査にお いては測定法が同一であっても，反応フローの違い や，標識物質，標識された抗原または抗体の種類に より，反応性に差が出ると言われている4)。われわ れが実施したカットオフ値付近の検体に対する HBc 抗体検査においても，方法間で異なる判定結果が観 察された。Presto とアーキテクトの判定一致率が 96.1%と満足できる結果であったのに対し，HISCL とアーキテクト，HISCL と Presto ではいずれも 80% 程度であり，HISCL のみ HBc 抗原・HBc 抗原の 2 ステップサンドイッチ法（他 2 法は HBc 抗原・抗ヒ ト（IgG）抗体の 2 ステップサンドイッチ法）とい う反応フローの違いによる影響が推察された。今回 使用した Presto 試薬ルミパルスプレスト HBcAb-N は，IgM 型 HBc 抗体が上昇する急性肝炎と IgG 型が 主体となる慢性肝炎とを鑑別するため，IgG 型 HBc 抗体のみを検出する構成となっている。HISCL およ びアーキテクトでは IgM 型の HBc 抗体も検出され ている可能性はあるが，Presto とアーキテクトの一 致率が高いことから不一致の原因としては否定的で あった。今回の全不一致例 17 例のうち，12 例は術 前あるいは輸血前感染症検査として，5 例について は化学療法前の HBV 既往感染スクリーニング検査 として依頼されていた。これら 17 例に対する追加検 HISCL陰性の不一致例における追加検査 No. HBcAb（C.O.I） 他マーカー検査結果

HISCL Presto アーキテクト HBsAg（IU/mL） HBsAb（mIU/mL） ALT（U/L） 1 0.6（−） 0.8（−） 1.00（+） 0.00（−） 23.9（+） 48 2 0.4（−） 0.8（−） 1.06（+） 0.01（−） 0.5（−） 11 3 0.3（−） 1.4（+） 1.16（+） 0.00（−） 16.1（+） 13 4 0.9（−） 1.1（+） 1.50（+） 0.00（−） 0.2（−） 37 5 0.4（−） 1.1（+） 1.60（+） 0.00（−） 11.7（+） 33 6 0.5（−） 2.4（+） 2.19（+） 0.00（−） 289.9（+） 25 7 0.4（−） 2.7（+） 2.98（+） 0.01（−） 121.2（+） 20 8 0.4（−） 3.0（+） 3.34（+） 0.00（−） 496.6（+） 15 9 0.6（−） 4.3（+） 3.78（+） 0.00（−） 0.1（−）  9 Table 4 

査の結果では，HISCL で陰性と判定された 9 例のう ち 3 例で HBs 抗体が 100 mIU/mL を超える陽性を示 しており，ワクチンの接種歴も無かった。すなわち この 3 例においては，アーキテクトおよび Presto の 判定結果の通り B 型肝炎既往感染例の可能性が高 く，HISCL の偽陰性と考えられた。一方，HISCL で 陽性と判定された不一致例は 8 例であったが，うち 1例は HBV-DNA 定量検査で陽性を示し，さらに 1 例では B 型肝炎既往感染例であることが確認でき た。すなわち，少なくともこれら 2 例については HBc抗体陽性であり，アーキテクトと Presto におけ る偽陰性と思われる。特に DNA 定量陽性を示した 1例は化学療法前であり，HBs 抗体検査は陰性であっ た。最近，HBV 既往感染の B 細胞性非ホジキンリ ンパ腫患者において，治療開始時の HBc 抗体単独陽 性（HBs 抗体陰性）症例で約 20%に再活性化が発生 するとの報告があり5)，HBc 抗体検査の重要性が更 に高まっている。 B型肝炎既往感染例のスクリーニングとして HBc 抗体検査は有効ではあるが，カットオフ値付近を含 めた測定結果にはバラツキが生じることを考慮しな くてはならない。特に免疫抑制状態ではいずれの抗 体も偽陰性となる可能性があり，B 型肝炎の再活性 化を防止するためには，ガイドラインに沿って HBc 抗体と HBs 抗体とを同時に測定することが重要であ る。また，最近では HBV-DNA 定量検査にも匹敵す るほど高感度な HBs 抗原検査が開発されつつあ る6),7)。免疫抑制剤の使用により抗体産生が低下して HBc抗体や HBs 抗体が偽陰性を示す症例もあるた め，今後は高感度 HBc 抗体測定の開発に加えて，超 高感度 HBs 抗原測定を活用するなどの検討も必要と 考えられる。 V_{結 語} 今回われわれは，カットオフ付近の検体を対象に HISCL，Presto，アーキテクト 3 種の HBc 抗体測定 試薬の比較検討を行った。HBc 抗体検査は HBV 既 往感染のスクリーニングとなるが，このように測定 結果にバラツキがみられるため，ガイドラインに沿っ て HBc 抗体と HBs 抗体の同時測定を行うことが重 要である。また，免疫抑制剤の使用により，HBc 抗 体偽陰性となる症例もあり，超高感度 HBs 抗原測定 などの他法での検討も必要である。 ■文献

 1) Kusumoto S et al.: “Reactivation of hepatitis B virus following rituximab-plus-steroid combination chemotherapy,” J Gastroenterol, 2011; 46: 9–16.

 2) 坪内 博仁，他：「厚生労働省『難治性の肝・胆道疾患に関す る調査研究班』劇症肝炎分科会および『肝硬変を含めたウイ ルス性肝疾患の治療の標準化に関する研究班』合同報告」， 肝臓，2009; 50: 38–42.

 3) Awerkiew S et al.: “Reactivation of an occult hepatitis B virus escape mutant in an anti-HBs positive, anti-HBc negative lymphoma patient,” J Clin virol, 2007; 38: 83–86.

 4) 喜多 美文，他：「CLIA を測定原理とするアーキテクト・HBc IIの性能評価」，日本臨床検査自動化学会会誌，2012; 37: 298–302.

 5) Shigeru K et al.：“Monitoring of hepatitis B virus (HBV) DNA and risk of HBV reactivation in B-Cell lymphoma: A prospective observational study,” Clinical Infectious Diseases, 2015; DOI: 10.1093/cid/civ344

 6) Shinkai N et al.: “Application of a newly developed high-sensitivity HBsAg chemiluminescent enzyme immunoassay for hepatitis B patients with HBsAg seroclearance,” J Clin Microbiol, 2013; 51: 3484–3491.

 7) Takeda K et al.: “High-sensitive detection of hepatitis B virus surface antigen by a semi-automated immune complex transfer chemiluminescent enzyme immunoassay,” J Clin Microbiol, 2013; 51: 2238–2244.

HISCL陽性の不一致例における追加検査

No. HBcAb（C.O.I） 他マーカー検査および吸収試験結果

HISCL Presto アーキテクト HBsAg（IU/mL） HBsAb（mIU/mL） ALT（U/L） HISCL HBcAb 吸収試験（C.O.I） 特記事項 1 3.7（+） 0.2（−） 0.71（−） 0.06（+） 0.0（−） 13 0.2 HBV-DNA（+） 2 1.1（+） 0.2（−） 0.45（−） 0.00（−） 2.2（−） 31 0.1 B型肝炎既往 3 3.0（+） 0.7（−） 1.15（+） 0.00（−） 44.8（+） 13 0.3 — 4 2.2（+） 0.1（−） 0.16（−） 0.00（−） 0.0（−） 24 0.0 — 5 1.1（+） 0.1（−） 0.23（−） 0.00（−） 4.3（−） 19 0.2 — 6 2.9（+） 0.1（−） 0.39（−） 0.01（−） 0.0（−） 21 2.4 — 7 1.9（+） 0.2（−） 0.39（−） 0.00（−） 0.0（−） n.t. 0.0 — 8 1.2（+） 0.1（−） 0.41（−） 0.00（−） 0.0（−） 51 0.2 — Table 5 

Technical Article

Comparison of performance between several anti-hepatitis B core

antibody (HBcAb) assays: Value of HBcAb test specificity in low-titer

samples

Tomoya IWASE1)_{Kumiko OONE}1)_{Fumiyasu KOIKE}1)_{Satomi KANI}1)2)

Yukio WAKIMOTO1)_{Yasuhito TANAKA}1)2)

1)Department of Clinical Laboratory, Nagoya City University Hospital(1, Kawasumi, Mizuho-cho, Mizuho-ku, Nagoya-shi, Aichi 467-8602, Japan)

2)Department of Virology & Liver Unit, Nagoya City University Graduate School of Medical Sciences

Summary

Hepatitis B virus (HBV) reactivation may occur not only in hepatitis B surface antigen (HBsAg)-positive patients but also in patients with resolved HBV infection who are seronegative for HBsAg but seropositive for the anti-hepatitis B core antibody (HBcAb) and/or anti-hepatitis B surface antibody (HBsAb). The detection of HbcAb is important before chemotherapy. In this study, we compared the sensitivity and specificity of HBcAb in 77 low-titer samples with nearly 1.0 cut-off index (C.O.I) using 3 kits for the detection of HBcAb, namely, HISCL [chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA)], Presto (CLEIA) and Architect [chemiluminescent immunoassay (CLIA)]. The rate of agreement between Presto and Architect was 96.1% owing to the use of the same hepatitis B core antigen (HbcAg)-anti-human IgG antibody sandwich assay. However, because only HISCL was applied to the HBcAg-HBcAg sandwich assay, the rates of agreement between HISCL and Presto and HISCL and Architect were 79.2% and 80.5%, respectively. As shown by additional information, each assay had false-positive and -negative data, suggesting that it is difficult to determine which of the three is better, particularly in low-titer samples. To detect the low titers of HBcAb, a more sensitive HBcAb assay or a highly sensitive HBsAg assay is required to manage HBV reactivation.

Key words: anti-hepatitis B core antibody (HBcAb), chemiluminescent immunoassay, chemiluminescence ezyme immunoassay, screening for HBV infected patients