ニ ッケ ル 内 標 法 を 用 い た 生 体 試 料 中 白 金 の 原 子 吸 光 分 析
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(2) ニ ッケル内標法 を用 いた生体試料中白金 の原子吸光分析. 在,生 体 試 料 中 白金 の簡 便 で 高 感度 な分 析 法 の. 硝 酸:有. 害 金 属 測 定 用 硝 酸(和. 光 純 薬 製)を. 道 水 を 蒸 留 後,更. に イオ ン交 換 処. 使用。. 確立 が 強 く望 まれ て い る。 と ころ で,白 金 の分 析 法 に は,こ れ ま で種 々 の 方法 が 報 告 され て い るが2),原. 子吸光 法 に よ. る方 法 が,現 在 一般 的 で,生 体 試 料 中 の 白 金 の 分析 に つ い て は フ レー ム レス 原 子吸 光 法 に よ る 方 法 が 若 干 報 告 され て い る に過 ぎな い3〜6)。 し. 蒸 留 水:水. 理 で 精 製 して使 用 。 CDDP:名. その 他 の試 薬 はす べ て市 販 の特 級 試 薬 を用 い. か し これ らの 方 法 は,一 般 に,多 量 の 試 料 を必. た。. 要 とす る,前 処 理 が 煩 雑 で あ る,ま た は 濃 縮 が. 2.生. で きな い な どの 点 で,白 金 錯 体 の 代 謝 研 究 を行 な うた め に は不 十 分 で あ る。. て 直 接 白金 を測 定 で きれ ば,用. い る試 料 も少 な. くて 済 み,前 処 理 も簡 便 に な る と考 え,内 標 法 を組 み 合 わ せ た生 体 試 料 中 の 白金 の フ レ ー ム レ ス 原 子 吸 光 分 析 を研 究 して,実 用 で きる方 法 を 確 立 した の で 報 告 す る。. 体 試 料 及 び動 物. 日本 白 色 ウ サ ギ(雄,体 ental. 今 回 著 者 等 は,試 料 の 酸 分 解 の濃 縮 液 にっ い. 古 屋 市立 大 学 薬 学 部 分 析 化学 教 室. か ら提 供 し て い た だ い た 。. Yeast. RC‑4及. た 。 血 液 は1mlに 添 加 し,冷. つ き500単. 位 の ヘパ リンを. 蔵 保 存 した 。 各 組 織 は 屠 殺 後直 ちに. 生 理 食 塩 水 で 灌 流 し 分 取 し た 。 各 組 織 は‑20℃ で 冷 凍 保 存 し,用 CDDPの. 時 に 解 凍 使 用 した 。. 投 与 は,CDDPを5%デ ,ウ. つ き3.8mgのCDDPを,飼. 法. 問飼 育. し た 後,エ ー テ ル 麻 酔 下,頸 動 脈 よ り脱 血 屠 殺 し. ー ス溶 液 に 溶 解 し. 方. 重 約2.5kg)をOri‑. び 水 道 水 で 約2週. キ ス トロ. サ ギ の 体 重1kgあ. た りに. 育 した ウ サ ギ の. 耳 静 脈 内 に 注 射 した 。. 1.試 薬. 3.装. 置. 白 金 及 び ニ ッケ ル 標 準 溶 液:市 販 の 白金 及 び ニ ッケ ル の 原 子 吸 光 分 析 用 標 準 液(1000ppm ,. 日 立GA‑2形. 半 井 化 学 製)を,使. 続 し,フ. 用 に際 して1M硝. 酸溶液 で. 適 宜 希 釈 して使 用 した 。 TableI. 156. Analytical. 白 金 は,日. 立308型2波. 長 原 チ吸 光 光 度 計 に. グ ラ フ ァ イ ト ア トマ ィザ ー を 接. レ ー ム レス 原 子 吸 光 光 度 計 と して 測 定. し た 。 キ ュ ベ ッ ト及 び ロ ッ ドは 口 立GA‑2形 conditions of Pt. 用.
(3) 臨 床 化 学 ・第13巻 ・第3号(1984). Table. II Analytical. conditions. of Ni. を 使 用 し,キ ュベ ッ トは50検 体 測 定 毎 に,ロ ッ ド は100検 は,日. 立170‑10形. 原 子 吸 光 光 度 計 を用 い て 行 な. っ た 。 各 測 定 条 件 をTable 4.操. 結. 果. 体 測定 毎 に交 換 した 。 ニ ッケ ル の 測 定. I,IIに. 示 した 。. まず,本 法 の 前 処 理 操 作 で 得 られ る湿 式 分 解 液 中 の 共 存 物 質 が 白金 及 び ニ ッケル の 測 定 に及 ぼ す 影 響 を検 討 した 。 フ レ ー ム型 で 測 定 した ニ. 作. ッケ ル の 場 合 は,分 解 濃 縮 液 の4倍 以 上 の 希 釈 ケ ル ダ ー ル 分 解 フ ラ ス コ(30ml)内 の 約1ml又. は1gを. 精 密 に 秤 取 し,10. ニ ッ ケ ル 溶 液1ml,硝 の 沸 騰 棒(約1φ で120℃. に試 料. 酸5ml及. ×1cm)を. ppm. そ こで,ニ. び ガ ラス製. 加 え,分. 解用電気炉. 以下 で加 熱 す る。 フ ラス コ 内 の試 料 が. 十 分 溶 解 し た 後,分. 解 温 度 を120℃. 液 で は全 く共 存 物 質 の 影 響 は見 られな か っ た。. 以 上 に上 げ. ッケ ルの 添 加 量 は,ニ. ッケル の 吸光. 感 度 及 び 希 釈 率 を考 慮 して10μgと た,フ. した 。 ま. レ ー ム レス型 で 測 定 した 白金 の場 合 は,. 原 子 吸 光 段 階 で の灰 化 温 度 と灰 化 時 間が 白金 の 測定 に 大 き く影 響 した 。 そ の結 果 をFig.1及. 強 熱 す る 。 フ ラ ス コ 内 の 溶 液 が0.5ml程. 度 に. びFig.2に. な っ た ら加 熱 を や め,放. 解 フ. に つ い て,灰 化 温度 を1170℃ か ら2170℃ ま で変. ラ ス コ に 硝 酸2ml及 mlを. 加 え,内. 冷 す る 。 冷 後,分 び30%過. 酸 化 水 素 水0.5. 容 量 が0.5ml程. 強 熱 す る 。 こ の 操 作 を5回. 度 に な る まで. 繰 り返 し,最. 度 とす る。. こ の 分 解 溶 液 を 共 栓 の10ml遠. 沈 管 に洗 い. 〜70℃. る 。 残 渣 に1M硝. に 加 温 しな が ら 減 圧 留 去 す 酸0.5mlを. 不 溶 解 物 は3000rpmで5分. 加 え溶 解 す る 。 間 遠 心 し 除 去 し,. 上 澄 液 を と る 。 上 澄 液 の 一 部 は 蒸 留 水 で10又 20倍 に 希 釈 し,ニ. 化 させ た とこ ろ,灰 化 温 度 が1720℃ 以下 で は ピ ー ク高 さ は一 定 で あ った が,1720℃ 以上 で は ピ. 終的 に. 分 解 フ ラ ス コ 内 の 液 量 を0.5ml程. 込 み,60°. それ ぞれ 示 した 。ま ず標 準 白金 溶 液. は. ッケ ル を 定 量 す る 。 残 りの 上. 澄 液 は 白 金 を 定 量 す る 。 白 金 の 定 量 で はD2ラ ン プ を用 い て バ ッ ク グ ラ ウ ン ド補 正 を 行 な っ た 。 ま た,白. 金 及 び ニ ッケ ル の 吸光 度 は記 録 計. 上 で 得 られ る ピ ー ク 高 さ と し て 測 定 し た 。. Fig.1. Influence of ashingt. emperature. on. peak height of Pt in flameless atomic absorption spectrophotometry. Pt;2 ppm in 2M HNO3, Ashing time; 40 sec..
(4) ニ ッケル 内標法 を用いた生体試料中白金の原子吸光分析. Fig.2. Influence height absorption ●‑●;Pt2. of. of. ashing. Pt. in. time. on. flameless. peak Fig.3. atomic peak. spectrophotometry. ppm. In. acid. digest. of. blood(rabbit) ○‑○;Pt. free. acid. Influence. digest. of. of. HNO3. heights. of. concentrationon Pt. and. Ni.. ●‑●;Pt. 2ppm,○‑○;Pt. blank. ▲‑▲;Ni. 1ppm,△‑△;Ni. blank. blood. (rabbit) Ashing. temperature;1500℃. ー ク高 さの 減 少 が み られ た(Fig. .1)。 この こ と. は,灰 化 温 度 が1720℃ 以 上 で は 灰 化 段 階 で炭 素 炉 内 か ら白金 が 揮 散 す るた めだ と考 え られ る。 そ こで灰 化 温 度 は,1500℃ に設 定 した 。次 に 白金 2ppmを. 含 む よ うに 調 製 した ウ サ ギ 血 液 の湿. 式 分解 濃 縮 液 と 白金 を含 まな い 湿 式 分解 濃 縮 液 に つ い て,灰 化 時 間 を20秒 か ら80秒 ま で変 化 さ せ た とこ ろ,灰 化 時 間が40秒 以 下 で はD2ラ. ン. プ に よ るバ ッ ク グ ラ ウ ン ト補 正 を行 な って い る に も拘 らず大 きな ブ ラ ン ク吸 収 が 見 られ た。 し. Fig.4. Influence peak. various. ブ ラン ク吸収 の な い 精 度 の 良 い 定 量 が で きた。. Atomizing ○……. atomizing of. absorption. か し,灰 化 時 間 を50秒 以 上 とす る こ とに よ って この 他 同様 の検 討 を ウサ ギ の血 漿,尿,胆 汁,肝. of. height. Pt. temperature in. spectrophotometry atomizing. ○:. 6. on. flameless. atomic at. time.. time;●‑●:. 8. sec,. sec〓‑〓:. 4. sec. 臓 及 び腎 臓 の 湿 式 分 解 濃縮 液 に つ い て行 な った と ころ,い ず れ の 検 体 にお い て も1500℃ で50秒. とな った 。 この 現 象 は 他 の 金 属 の 場 合 と同様. の灰 化 で十 分 白金 を測 定 す る こ とが で きた。. に,原 子 吸 光 で の 灰 化 段 階 で 白金 が 蒸 気 圧 の 低. 白金 及 び ニ ッケ ル の 吸 光 感 度 に及 ぼ す 硝 酸 濃 度 の影 響 を検 討 した 結 果 をFig.3に が,ニ. 示 した. ッケ ル の 場 合 は,硝 酸 濃 度 が0〜4Mの. い 酸 化 物 を 形 成 して 吸光 感 度 が 減 少 した こ と が 一 つ の 理 由 と考 え られ る。 また,硝 ブ ラ ン ク吸 収 は0〜4Mの. 酸によ る. 範 囲 で み られ な か っ. 範 囲 で 吸光 感 度 は 全 く影 響 を受 けず,硝 酸 に よ. た。 そ こで,湿 式 分 解 液 の減 圧 留 去 で得 られ る. る ブ ラ ン ク吸収 もみ られ な か った 。 白金 の 場 合. 残 渣 は1M硝. で は,硝 酸濃 度 が0〜0.5Mの. 範 囲 で ピー ク高. さが 減 少 した が,硝 酸 濃度 が1M以 158. 上 で は一定. 酸 で 溶 解 す る こ と と した 。. 次 に 白金2ppmを. 含 む よ うに調 製 した ウ サ. ギ血 液 の 湿 式 分 解 濃 縮 液 を用 い て,原 子 化 の条.
(5) 臨 床 化 学 ・第13巻 ・第3号(1984) TableIII. Determination. n=4 Sample;blood,liver. of Pt in biological materials. or kidney(rabbit). 件 を 温 度 及 び 時 間 に つ い て 検 討 した 。 そ の 結 果 をFig.4に. 示 す 。 原 子 化 温 度 を 高 め るに従. い ピ ー ク 高 さ も増 加 し,本. 装 置 で 設 定 可 能 な最. 高 温 度 の 時 にピ ー ク 高 さ も最 高 とな っ た 。 こ の こ と は,白. 金 の 蒸 気 圧 が 低 い た め に2800℃. お い て も原 子 化 効 率 が100%と め と考 え ら れ る。 ま た,原 で は,ピ. に. な って い な い た. 子 化 時 間 は6秒. 以下. ー ク高 さ も低 く な り再 現 性 も悪 くな っ. た 。 そ こ で 原 子 化 の 条 件 は,2800℃‑8秒. と定. めた。 次 に ウ サ ギ 血 液1mlに 0.5,1.0,2.0μg添. curve. for. Pt. by. internal. method.. Regression line;Y=0.5X+0.01 Relative coefficient; 0.998. 示 す。 白金 濃 度 に対 し. ッケ ル と 白 金 の ピ ー ク 高 さ の 比 を プ ロ ッ. トす る と,図. に示 し た よ う に 相 関 係 数0.998の. 良 い 直 線 が 得 られ た 。 ま た,こ 出 限 界 は0.05ppmで. の と き白金 の 検. あ っ た 。 そ こ で,ウ. サ. ギ の 血 液,肝. 臓 及 び 腎 臓 の 任 意 の 試 料 に 白金. を 添 加 し,定. 量 精 度 を 検 討 した 。 その 結 果 を. Table. Calibration standard. 加 して検 量線 を 作成 した 。. そ の 結 果 をFig.5に て,ニ. Fig.5. 白 金 を0,0.1,0.2,. IIIに 示 す 。 一 定 の 白 金 濃 度 に つ い て4. 個 の 検 体 を 作 成 し,白. 金 を 定 量 し た と こ ろ,検. 討 し た 何 れ の 濃 度 に お い て も変 動 係 数10%以 で あ り,生. 内. 体 試 料 中 白金 の 分 析 法 と して は良 好. な 結 果 が 得 られ た 。 ま た,血. 液,肝. 臓及 び腎 臓. の 何 れ の 生 体 試 料 を 用 い た 場 合 で も,白. 金 の定. Fig.6. Time in. 量 結 果 に 差 は 認 め られ な か っ た 。. course blood. study. after. cis‑dichlorodiammine. 次 に ウ サ ギ にCDDP(3.8mg/kg. Pt. concentration injection. Pt(II)in. of. rabbits.. weight) Dose;. を 静 脈 内 に 注 射 後,経. on. intravenous. 時 的 に 採 血 し本 法 を 用 い. て 血 液 中 の 白金 濃 度 を 定 量 し た 。 結 果 をFig.6. All. 2.5mg points. Pt/kg and. weight. vertical bars. indicate. means±S.D.(n=4). 159.
(6) ニ ッケル内標法 を用 いた生体試料中白金の原 子吸光分析 に示 したが,血 液 中 白金 は投 与 後30分 ま で は急. って定 量 し,吸 光 感 度 の高 い ニ ッケ ル は分 析 時. 速 に減少 したが,2時 間後 以 降 は非 常 に 緩 や か に減 少 し,CDDP静 注 後 の 血 液 中 白金 は 典型. 間 の短 縮 を考 慮 し フ レー ム型 の 原 子 吸光 法 で定 量 す るこ と と した 。 生 体 試 料 の 湿 式 分 解 法 で は,Jones3)は 最 も 一. 的 な二 相 性 を 示 した。 半 減 期 のt(1/2)αは約20. 般 的 な硝 酸 一 過 塩 素 酸の 混 酸 を用 い て い るが,. 分,t(1/2)βは約25時 間 で あ った 。 考. 精 度 良 く白金 を測 定 す る には 原 子 吸 光 で の灰 化 段 階 で1900℃ で 過 塩 素 酸 を揮 散 させ る こ とが. 察. 必 要 だ と して い る。 しか し,Smeyers‑Verbeke 生 体試 料 中 の重 金 属 を原 子 吸 光 法 で 測定 す る 際 の 前処 理 と して は,硝 酸,過 塩 素 酸,硫 酸等 の 混 酸 に よ る湿 式 分解 が最 も良 く用 い られ て い. 等6)及 び著 者 等 の 実 験 で は,1700℃ 以上 の灰 化 温 度 で は吸 光 度 の 減 少 が み られ て い る。 ま た, Pera等4)は 硝 酸 の み に よ る 湿 式 分 解 を行 な っ. る。 しか しなが ら,湿 式 分 解 を 行 な う場 合 で. て い るが,試 料 の 分 解 に は24時 間 の還 流 を行 な. は,最 終 的 な 分 解 液 の 全 量 を0.5ml,1mlに. っ てお り,実 際 的 で な い。 生 体 試 料 の湿 式 分 解 におい て,硝 酸 の みで は分 解 力 が 弱 い と考 え ら. 定 容 とす る こ と は 非 常 に 困 難 で あ るので, 5ml以 上 で 定 容 と す る 場 合 が ほ とん どで あ る。従 って 試 料 中 の 白金 濃 度 が 低 い場 合 は大 量 の 試料 を必 要 とす るが4),こ れ は 白金 錯体 の代 謝 研 究 を行 な う上 で不 利 で あ る。 属 の揮 散 は少 な い が,分 解 中 に試 料 の突 沸 に よ る物理 的 な 損 失 が しば しば み られ る。試 料 の 突 雑 な 前 処 理 が 必 要 とな. そ こで著 者 等 は,湿 式分 解 液 を0.5ml程. た よ うな 簡 便 な 前 処 理 と原 子 吸 光 段 階で の1500 ℃‑50秒. ま た,生 体 試 料 の湿 式 分 解 で は,分 解 中 の金. 沸 を防 ぐた め に は,煩 る5)。. れ るの で,著 者 等 は硝 酸 一 過 酸 化 水 素 水 系 に よ る湿 式 分 解 を行 な った とこ ろ,操 作 の項 で 述 べ の 灰 化 との 組 み 合 わ せ に よ り,Fig.5. 及 びTable. IIIに 示 した よ う に 生 体 試 料 中 の. 白金 を十 分 定 量 す る こ とが で きた 。 以 上 述 べ た よ うに,本 法 は 試 料 の 微 量 化 や 白 金 の 高 感 度 分 析 に好 都 合 で あ る と と もに,前 処 理 も簡便 で あ り,ま た突 沸 等 に よ る試 料 の 物 理. 度. ま で濃 縮 し,ま た突 沸 等 に よ る物 理 的 な容 量 変 化 を補 正 す る に は,湿 式 分 解 中 の揮 散 及 び外 部 か らの混 入 の 少 な い金 属 を一 定 量 添 加 して,こ の 金属 の検 出 量 で検 出 白金 量 を補 正 す る こ とが. 的 な 損 失 も補 正 で きる。 本 法 は 生 体 試 料 中 白金 の 分 析 法 と して 十 分 使 用 で き る と考 え られ る。 謝辞 試料 の白金錯体を御供与下 さった名古屋市 立大学薬学部,喜 谷喜徳教授に深謝致 します。. 有 効 で あ る と考 え,生 体 試 料 中 白 金 の フ レー ム レス原 子 吸 光 分析 に ニ ッケ ル を用 い る内標 法 を考案 し,適 用 した 。 内部 標 準 金 属 と して は,. 文. 1). A.. 1)生 体 内 に存 在 しな い か,存 在 して も極 微 量 で あ る2)湿. 条 件 を満 た す 重 金 属 と して,白 金 と同 族元 素 で もあ るニ ッケ ル が適 して い る と考 え,こ れ を用 い た と ころ良 好 な結 果 を得 る こ とが で きた 。 内標 法 で は,白 金 と内部 標 準 金 属 で あ るニ ッ ケ ル の同 時 分 析 が望 ま し く,著 者 等 もフ レー ム レス原 子 吸 光 法 で二 波 長 に よ る同 時定 量 を試 み. 160. S. T.. Cisplatin;. DeVelopments,. Cooke. and. Curnnt. S. K.. Status. Academic. and. Press,. New. New. York. (1980) 2). National. Research. 松 井 寿 夫,. Council. 小 野 哲,. 学 同 人, 3). A.. 4). M.. 5). A.. H.. 東 京. Jones:. F. Chem., F.. Jr. 27,. Le. 6). and. P. L.. 184. (1977). Chem., H.. W.. Denis. Acta,. 113,. (1976) Clin.. D.. J. H. R.. Biochem.. M.. 329. 1472. Harder:. Friauf,. Dedelek:. and. 48,. C.. Wahling,. S.. J. Smeyers‑Verbeke, L.. 東 京 化. (1977). M.L.. Sponseller,. 攻,. 環 境 汚 染 物. 白 金 族 元 素,. and. 1245. Roy,. 和 田. (1980). Anal.. Pera,. 編,. 山 本 昭 子 訳:. 質 の 生 体 へ の 影 響11;. た が,白 金 はバ ッ クグ ラ ウ ン ド吸 収 が大 き く, 十 分 な 結 果 は 得 ら れ なか った 。 そ こで 白金 は D2ラ ンプ に よ るバ ック グ ラウ ン ド補 正 を行 な. Prestayko,. Carter:. 式 分 解 中 の揮 散 及 び外 部 か らの混. 入 が少 な い3)原 子 吸光 法 で 容 易 に 定 量 で き る こ とな どが 必 要 で あ る。今 回,著 者 等 は上 記 の. W.. 献. L. (1981). R.. Massart:. E.. Solomon Med,. 18,. Detaevernier, Clin.. Chim.
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