軟体動物から発見された神経ペプチドが
ヒトの苦痛を軽減する？
宮崎大学
医学部
解剖学講座神経生物学分野
准教授
池田 哲也
研究の背景
糖尿病性疼痛や癌性疼痛、神経痛に代表される神経因性疼痛は末梢 神経および中枢神経の器質的障害や、機能的障害による慢性疼痛疾患 の一種であり、痛み本来の、組織障害の警告という意味は既に失われて おり、痛み自体が障害、苦痛となっている。 神経因性疼痛に特徴的な痛み症状として、本来なら痛み刺激とならな い触覚や温覚を痛みとして感じる異痛（allodynia）がある。 神経因性疼痛は難治性で既存の鎮痛薬の効果が乏しく、臨床的には 抗けいれん薬や抗うつ薬が第一選択薬として用いられる場合が多い。現 在、神経因性疼痛患者の QO L改善のためにも効果的な神経因性疼痛 治療薬の開発が急がれている。 ・神経因性疼痛モデルラットに対する抗うつ薬類の効果（動物実験） ①髄腔内に投与された抗うつ薬は allodynia を軽減した。 ②抗うつ薬の抗 allodynia 効果はノルアドレナリン（NA）レセプターと セロトニン（5-HT）レセプターを介していることが示唆された。脊髄後角
研究の背景②
神経因性疼痛に対する抗うつ薬の効果
・抗うつ薬類は脳内で放出された NA や 5-HT の再 取り込みを阻害し、結果的に濃度を高めることによっ て、抗うつ効果を発揮すると考えられている。 中脳水道 周囲灰白質 青斑核 大縫線核 ・左図は下行性の痛覚抑制系の模式図である。脊髄 後角への痛みの入力は青斑核からの NA 作働性神 経、大縫線核からの 5-HT 作働性神経によって抑制 される。 ・脊髄後角においても抗うつ薬は下行性抑制系の神 経から放出された NA や 5-HT の再取り込みを阻害 し、シナプスでの濃度を高めていると考えられる。結 果的に下行性抑制経路の働きを増強し、痛みの脊髄 後角への入力を抑制することによって、抗 allodeynia 効果を発揮していると思われる。新技術の基となる研究成果・技術
①本ペプチド X は糖尿病モデルラットにおいて神経因性疼痛行動を軽 減する抗 allodynia 効果を示した。アンタゴニストを用いた実験から、そ の効果はセロトニンレセプターを介していることが示唆された。 ②後肢に侵害刺激（痛み刺激）を与えるとその脊髄投射部位の神経細 胞に cFos タンパクが発現することが知られている。糖尿病モデルラット においては、神経因性疼痛の発症にともなって非侵害刺激でも cFos タ ンパクの発現量が増大する。本ペプチド X は、糖尿病モデルラットにお ける非侵害刺激による cFos の発現を有為に抑制した。 ③マイクロダイアリシス法を用いた定量的な実験で、本ペプチド X の大 脳皮質への投与後、投与部位のセロトニン量が増大することがわかった。 さらに、ノルアドレナリンやドパミンの量には影響を与えなかった。神経因性疼痛モデルと実験方法 ・ペプチドは髄腔内に留置したカ テーテルを介して、脊髄後角（後肢 からの痛みが入力する L4）に投与 する。 ・髄腔内にカテーテルを留置したラットの尾静脈からストレプトゾト シン（STZ）を投与し、糖尿病を誘発する。その後、2 週間ほどで後 肢に神経因性疼痛（allodynia）を示すようになる。 ペプチド
・allodynia の程度は von Frey テスト によって定量的に検定する。von Frey テストとは強さ（g）の異なる数種類の フィラメントで足底に刺激を与え、回 避行動（痛み行動）を示す閾値を求 める。その閾値によって allodynia の 程度が判断できる。
Time after injection of STZ (days) Paw w it h d raw al t h res h o ld (g ) 0 100 200 300 400 500 Bl o o d G lu co se lev el (m g /d l) pre 1 3 7 14 (p≦0.05） 0 5 10 15 20 * * * * ストレプトゾトシン（STZ）投与後の血糖値の変化と allodynia 右の縦軸は血糖値を表し、単位は mg/dl。左の縦軸は von Frey テストの閾値で、単位は足に 加える力（g）。横軸は STZ 投与後の時間経過で、単位は day。 STZ は膵臓のβ細胞を破壊するので、投与後1日目から血糖値が上昇し、400mg/dl 以上が持 続する。血糖値の上昇に伴って、von Frey テストの閾値が1日後から有意に低下し（p≦0.05）、 正常時（pre）では 15g 以上であったのが2週間後には 2g 以下になる、正常時では絶対に見られ ない触刺激（2g 以下）で回避行動を示すようになったので、allodynia が誘発されたと判断できる。
後肢足底への von Frey テスト ペプチド投与前（pre）、投与後 15 分（15min）、 30 分（30min）、1 時間（1h），2 時間（2h）、6時間 （6h）に回避行動（足引っ込め反射）の閾値を測定。 Pre ペプチド類の髄腔内投与 30 min 1 h 2 h 0 ペプチドの髄腔内投与と von Frey テスト ペプチド X アナログペプチド Y アナログペプチド Z 15 min 6 h ペプチド類は生理食塩水に溶解し、投与量は 10μｌ、 その後、カテーテルの中を 10μl の生理食塩水でフラッ シュする。
0 5 10 15 20 25 30 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Saline X 10-4 M X 10-5 M X 10-6 M X 10-7 M X 10-8 M Paw w it h d raw al t h res h o ld (g )
Time after injection (min) * * * * * * * * * (p≦0.05） ペプチド X の抗 allodynia 効果
縦軸は von Frey テストの閾値（g）。横軸はペプチド X 投与後の時間経過で、単位は分（min）。 ペプチド X は 10-6 M 以上の濃度で投与後 30 分には von Frey テストの閾値を有為(p≦0.05）
に増大させた。つまり、抗 allodynia 活性を示した。その効果は 2 時間後まで持続し、最大値は 1 時間後だった。10-4 M の濃度では、糖尿病を誘発する前の正常ラットとほぼ同じ程度の閾値と
0 5 10 15 20 25 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Saline Y 10-4 M Y 10-5 M Y 10-6 M Y 10-7 M Y 10-8 M Paw w it h d raw al t h res h o ld (g )
Time after injection (min) * (p≦0.05） * * * * * * * * * 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Saline Z 10-4 M Z 10-5 M Z 10-6 M Z 10-7 M
Time after injection (min)
(p≦0.05） * * * * * * ペプチド X のアナログペプチド類の抗 allodynia 効果 A：ペプチド Y、B：ペプチド Z の結果。 ペプチド X の C 末端アナログペプチド Y は、ペプチド X と同程度、10-6 M 以上の濃度で von Frey テストの閾値を有為(p≦0.05）に増大させた。また、アナログペプチド Z は 10-5 M 以上の濃 度で抗 allodynia 活性を示した。 A B
ペプチド X とアナログペプチド類の濃度反応関係 投与 1 時間後（最大効果）の ペプチド X、Y、Z の濃度反応関係。比較のため同条件で投与し た抗うつ薬の Fluvoxamine もプロットしている。 ペプチド X と ペプチド Y はほぼ同じ濃度反応曲線を描くのに対して、ペプチド Z は ペプチド X と同程度の効果を示すのに 10 倍の濃度が必要である。また、抗うつ薬の Fluvoxaine と比較す ると ペプチド X は 2 オーダー（100倍）薄い濃度で同程度の効果を示すことが分かった。
Paw w it h d raw al t h res h o ld (g ) Fluvoxamine (Flu) 10-2 M Flu + Methiothepin 10-4 M Flu + Methiothepin 10-3 M 0 5 10 15 20 25 Pre 30 60 120
Time after injection (min)
(p≦0.05）
* * Time after injection (min)
0 5 10 15 20 X 10-5M X + Methiothepin 10-5 M X + Methiothepin 10-4 M Pre 30 60 120 (p≦0.05） * * ペプチド X の抗 allodynia 活性に対する 5-HT レセプターアンタゴニストの効果 A B 5-HT レセプターの関与を調べるために、非選択的 5-HT1 レセプターアンタゴニストの Methiothepin を ペプチド X と同時投与した（A）。 ペプチド X の効果は 10-4 M のmethiothepin によって阻害された。同様の結果が抗うつ薬の Fluvoxamine でも見られた（B）。ペプチド X の抗 allodynia 効果は抗うつ薬と同様に 5-HT を介
糖尿病モデルラットの左後肢に 46℃，2 分間（低温熱傷を起こさない程度の刺激）恒温槽で温熱刺激を 加え、刺激 2 時間後に灌流固定。脊髄を取り出し、cFos タンパクの免疫染色を行った。 A: 生理食塩水、B: ペプチド X、C: Fluvoxamine はそれぞれ刺激の 1 時間前に髄腔内へ投与。D は糖尿 病モデルのコントロールで STZの溶媒のみを静脈注射したラットに生理食塩水を投与。 生理食塩水を投与した糖尿病ラットは後角の特に I/II 層に顕著な陽性細胞が見られる。ペプチド X 投与 後は陽性細胞の数が明らかに減尐している。抗うつ薬の Fluvoxamine も同程度に陽性細胞数を減尐させ た。D の正常なラットでも陽性細胞が確認されるが糖尿病モデルに比べると明らかに尐ない。 脊髄後角における c-Fos タンパク発現に対する効果
0 10 20 0 15 30 60 120 Saline X 10-3 M X 10-4 M X 10-5 M Paw w it h d raw al l at en cy (sec )
Time after injection (min)
正常ラットにおける痛み刺激による足引っ込め反射に対する ペプチド X の効果
正常ラットにおける Hargreaves test（熱刺激装置を用いて熱痛覚を与え、足引っ込め反射に要する潜時を 測定）に対する ペプチド X の効果。縦軸は Hargreaves test の潜時で、単位は秒（sec）。横軸は ペプチド X 投与後の時間経過で単位は分（min）。
このテストの特徴は熱痛覚を与えて足を引っ込めるまでの潜時が短ければより痛みを強く感じている、潜 時が長ければ痛みを抑制したと判断できる。
髄腔内にペプチド X（10-3 M、10-4 M、10-5 M）を投与しても、潜時はまったく変化せず、いずれのタイムポ イントでも生理食塩水を投与した場合と有意差はなかった。このことから、ペプチドX は正常なラットにおけ
マイクロダイアリシス法を用いた脳内 5-HT の定量解析の方法
ペプチド
HPLCと電気化学検出器 （Eicom, HTEC-500） へ接続
正常ラット前帯状皮質（anterior cingulate cortex: ACC）への ペプチド X 投与後のセロトニン 量の変化を調べるために、大脳の ACC に薬物投与ガイドチューブ付きの微小透析プローブ （Eicom, MI-AG-8）を埋め込み、ペプチド X を投与すると同時に、マイクロダイアリシス法を 用い、ACC からの透析液を経時的に回収し、HPLC と電気化学検出器（Eicom, HTEC-500） を用いてセロトニン量を解析した。
透析プローブの先端がACCに位置す るように固定する
240 180 120 60 0 -60 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 Vehicle APGW low APGW high
Effect of APGWamide on 5-HT release in the ACC
Time after administration (min)
% o f ba sa l l ev el ** * * Vehicle X 2 x10-4 M X 2 x10-3 M 縦軸は投与前の基準レベルに対するセロトニン量（％）、横軸は X 投与後の時間経過 (min）。 ペプチド X は濃度依存的にセロトニン量を増大させた。2×10-3 M の濃度では投与後 20 分後と 40 分後、2×10-4 M の濃度では投与後 20 分後にセロトニン量が X 溶液の溶媒だけ投与したもの （Vehicle）と比べて有為に（p≦0.05）増大した。また、データには示していないがノルアドレナリンや ドパミンはまったく増大しなかった。 正常ラット ACC における ペプチド X 投与後の 5-HT の変化
①ペプチド X は糖尿病モデルラットにおいて、行動学的実験（von Frey テスト）、 組織化学的実験（cFos 免疫組織化学）いずれにおいても、劇的な抗 allodynia 効果を示した。現在、神経因性疼痛に有効な鎮痛薬はほとんど無いが、ペプチ ド X は神経因性疼痛に効果のある新しい鎮痛薬開発の出発物質になる可能 性が高いと思われる。 ②ペプチド X の抗 allodynia 効果は抗うつ薬と同様に 5-HT レセプターを介し ている事が示唆された。また、大脳皮質への投与で 5-HT 量を増大させること がわかった。5-HT の放出を促すのか、あるいは再取り込みを阻害するのか、 その機序はまだ不明であるが、脳におけるセロトニン系への作用はうつ病や不 安などの高次脳機能に影響するので、新しい抗うつ薬の開発につながる可能 性がある。 ③ペプチド X の大脳皮質への投与はセロトニン量の上昇を誘発するが、ノル アドレナリンやドパミンには影響を与えない。副作用の尐ない抗うつ薬の開発 につながる可能性がある ④軟体動物から単離された神経ペプチドが神経因性疼痛、鬱といった「人」の 苦痛を軽減する可能性が示された。
