1．はじめに
脳梗塞急性期の内科的治療である血栓溶解薬「組織 プラスミノゲン・アクチベーター（t-PA）」の静注療法 は，日米のガイドラインにおいてグレード A の治療で ある．しかし，発症から 4.5 時間までという治療可能 時間のため，治療の恩恵を受ける患者数は全脳梗塞患 者数のわずか 5％と少なく，治療可能時間を延長する ような新規療法の開発は喫緊の課題である．脳梗塞急 性期において t-PA（アルテプラーゼ）を使用した臨床試 験の統合分析から，発症から 4.5 時間を超えて治療を 行った場合，脳出血を合併するリスクが高くなること が判明している1）．すなわち脳出血の合併を抑制する 治療の開発は予後の改善のみならず，t-PA の治療可能 時間の延長を可能にするものと考えられる．我々は， t-PAに併用する血管保護薬の候補として，血管リモデ リングに関与する血管内皮増殖因子（vascular endothe-lial growth factor: VEGF）シグナル経路の阻害2）や血管の安定化に関わるアンギオポエチン-1 の補充3）が，治療 可能時間を超えた t-PA 投与によりもたらされる脳出 血や浮腫を抑制し，機能予後を改善させることを示し た．しかし，これらの治療は血管が標的であるため， 脳梗塞体積の縮小作用，すなわち神経細胞保護作用は 認められなかった．このため我々は，血管保護作用の みならず，神経細胞保護作用，および虚血後の炎症も 抑制する多面的な治療法，いわゆる「脳保護療法」の開 発に取り組み（図 1），有望な治療標的分子としてプロ グラニュリン（progranulin: PGRN）を見出した4）．本稿 では，虚血後の PGRN の動態と脳保護の機序について 概説する．
2．多面的な保護作用を持つ PGRN
PGRN は，N 結合型の糖蛋白で，エストロゲンによ り脳内発現が促進され，脳の性分化や神経新生に関与 する分泌型成長因子である5, 6）．また，創傷治癒におけ る血管新生や炎症の抑制にも関与する7）．また，中枢 神経系においては，その遺伝子変異はハプロ不全を介 して，認知症を引き起こすことで注目されている8, 9）． つまり，前頭側頭葉変性症の一部の症例が，PGRN 遺 伝子変異により発症することが明らかにされ，PGRN が神経細胞変性に対して保護的な作用を有することが 新潟大学脳研究所神経内科 ＊〒 951-8585 新潟市中央区旭町通 1-757 TEL: 025-227-0664 FAX: 025-223-6646 E-mail: [email protected] doi: 10.16977/cbfm.27.2_265成長因子プログラニュリンによる脳保護療法
下畑 享良
＊，金澤 雅人，鳥谷部真史，小山 美咲，高橋 哲哉，西澤 正豊
要 旨 我々は，脳梗塞に対する組織プラスミノゲン・アクチベーター（t-PA）療法に併用し，予後を改善する薬剤の 開発を目指している．成長因子プログラニュリン（PGRN）に注目し検討を行ったところ，脳虚血後の著明な発 現増加が確認され，虚血中心ではミクログリア，ペナンブラでは神経細胞がその産生を担っていた．脳虚血に おける PGRN の役割を確認するため，PGRN KO マウスと t-PA 投与脳塞栓モデルを用いた検証を行ったとこ ろ，PGRN の欠乏は脳梗塞の増悪，逆に PGRN 投与は脳保護的に作用した．PGRN の効果は多彩で，TAR DNA-binding protein 43 kDaを介する神経保護作用，血管内皮増殖因子の抑制を介する血管保護作用，インター ロイキン 10 を介する抗炎症作用を認めた．PGRN は多面的な脳保護作用を持つ可能性があることから，脳梗 塞の新規治療薬として有望である．（脳循環代謝 27：265～269，2016）
明らかとなった10）．また，この PGRN 遺伝子変異を有 する前頭側頭葉変性症では，神経細胞の細胞質に，筋 萎縮性側索硬化症やアルツハイマー病などの病態に関 与することが知られている核蛋白 TAR DNA-binding protein 43 kDa（TDP-43）を構成成分とする封入体を認め ることから11, 12），PGRN は TDP-43 とともに複数の神 経変性疾患の病態に関与するものと考えられている． 一方，脳梗塞における PGRN の検討は十分になされ ていない．PGRN ノックアウトマウスを用いた一過性 局所脳虚血（塞栓糸）モデルの検討では，脳梗塞が増大 するという報告がある一方13, 14），野生型と変化はない という相反する報告もあり15），さらに PGRN による神 経細胞保護効果の機序も明らかにされていない．炎症 に関する効果についても，PGRN は炎症性サイトカイ ン分泌や好中球の遊走を抑制するという報告と13, 14）， それらには影響しないという相反する報告がある15）． また，血管保護に関する効果についても，PGRN が虚 血後の血液脳関門破綻において，マトリックスメタロ プロテナーゼ-9（matrix metalloprotease-9: MMP-9）の抑 制を介して，浮腫体積を縮小させるという結果がある 一方で14），MMP-9 は関与しないという報告もある15）．
3．PGRN の脳虚血後の発現変化
脳虚血後の PGRN 発現の変化を明らかにするため， 我々はまず，ラット全脳サンプルを用いたウエスタン ブロットにて検討したところ4），PGRN は虚血再灌流 24時間後から増え始め，72 時間後には著増してい た．また免疫組織学的検討では，PGRN は非虚血時で は大脳皮質の神経細胞にのみ顆粒状に発現していた が，虚血再灌流 24 時間後，虚血中心の神経細胞で PGRNの発現は消失する一方，虚血ペナンブラで PGRN陽性神経細胞が増加し，発現分布もびまん性に 変化していた．また非虚血時にはミクログリアでは PGRNの発現を認めなかったが，再灌流 24 時間後か ら PGRN 陽性ミクログリアが増え始め，72 時間後に 著増した．さらに PGRN は，再灌流 24 時間後の血管 内皮細胞でも発現を認めるようになった．4．PGRN による多面的な保護作用機序
マウス一過性局所脳虚血モデルにおいて，組み換え PGRNの脳室投与が脳梗塞体積を縮小することが報告 されていることから，PGRN は神経細胞保護作用を有 する可能性があるが14），その機序は不明であった． 我々はこれまで，脳虚血後，核蛋白 TDP-43 が限定分 解され，神経細胞核から細胞質に異常局在することを 報告しているが16），TDP-43 の切断酵素である cas-pase-3の活性化を PGRN が抑制することも報告されて いることから17），PGRN が TDP-43 の維持を介して神 経細胞死を抑制する可能性を考え検証を行った（図 2）．まず初代培養神経細胞を用いた低酸素低グルコー ス負荷（OGD）で，PGRN は神経細胞死を抑制するこ と，ならびにその効果に TDP-43 が関与していること を明らかにした（図 3）． また脳虚血後に惹起される炎症は，さらに梗塞病変 図 1．脳保護療法の概念 脳保護薬は血栓溶解薬 t-PA と併用するため，脳浮腫や出血合併症を防ぐ 血管保護作用を必須の作用として持ち，さらに神経細胞保護効果や脳炎 症作用により，脳梗塞サイズを縮小させる薬剤である．血管
神経細胞
脳保護
ミクログリア
（必須）
神経細胞保護
抗炎症作用
を拡大させることから，虚血後の炎症も治療標的とな る．脳外傷モデルにおいて，増加した活性化ミクログ リアでは PGRN の発現が誘導されるという報告がある が18），脳虚血においても，PGRN 過剰発現グリア細胞 では，炎症性サイトカイン発現が減少するという報 告13）や PGRN 投与により，好中球の遊走を抑制し，炎 症性サイトカイン分泌が抑制されるという報告がある ことから14），PGRN が神経における炎症にも関与して いる可能性がある．我々は，初代培養ミクログリアを 用いて，複数のサイトカインのメッセンジャー RNA 量を比較したところ，虚血条件下において，PGRN 欠 損ミクログリアのインターロイキン-10（IL-10）量は野 生型に比べ有意に減少していた．この結果から， PGRNは IL-10 分泌を介した抗炎症作用により，脳虚 血に対し保護的に作用するものと考えた． PGRN の血管保護作用の可能性についても報告があ る．マウス一過性局所脳虚血モデルにおいて，組み換 え PGRN の脳室投与が脳浮腫体積を縮小し，その機序 として好中球由来の MMP-9 の抑制が考えられると報 告されていた14）．しかし，我々4）や他のグループの検 討では15），好中球や MMP-9 の関与は明らかではな く，他の機序についての検討が必要と考えられた．こ のため我々は虚血後の血液脳関門破綻を強力に惹起す る VEGF に注目し検討を行ったところ2），PGRN 欠損 マウスの局所脳虚血モデルにおいて，VEGF 発現が野 生型より有意に増加していることを見出した．すなわ ち，PGRN は VEGF を抑制することで血管保護作用を 有する可能性が示唆された（図 4）．また PGRN の血管 保護作用に関しては，血小板由来増殖因子が関与する という報告もあり15），さらなる病態の解明が必要であ る．さらに，脳梗塞のみならず，肺の浮腫モデル19）や 腎梗塞モデル20）においても PGRN の浮腫軽減効果が示 されており，浮腫の分子標的療法候補として， PGRN は臓器を問わず注目されている． 最後に，ラット自家血血栓塞栓モデルを用いて， PGRNの t-PA との併用効果について検討を行った4）． このモデルは血栓溶解薬 t-PA で再灌流を行い，ヒト の脳梗塞に類似した治療可能時間を有するモデルであ る2, 3）．治療可能時間を超えた虚血 4 時間の時点で， t-PAと組み換え PGRN 蛋白を同時に投与すると，コ
PGRN
機序不明
神経細胞保護
図 3．プログラニュリンによる神経細胞保護メカニズムTDP-43: TAR DNA-binding protein 43 kDa, PGRN: progranu-lin
TDP-43
限定分解・細胞質への移行
神経細胞死
活性化
Caspase 3
PGRN
Zhang YJ et al. J Neurosci 2007機序不明
Loss of function or
Gain of toxic function
☓
図 2．プログラニュリンと TDP-43 我々は脳虚血後，TDP-43 が限定分解を受け，細胞質への 移行し，その結果，神経細胞死がもたらされることを報 告した16）．一方，Zhang らは機序不明ながら PGRN が活 性化 caspase 3 を抑制することにより，TDP-43 の限定分 解を抑制することを示した17）．よって，PGRN は脳虚血 後の TDP-43 に関連した神経細胞死を抑制する可能性が 推定される．PGRN: progranulin, TDP-43: TAR DNA-binding protein 43 kDa
図 4．プログラニュリンによる血管細胞保護メカニズム
時間後の脳浮腫や脳出血合併症は有意に減少し，さら に梗塞サイズも縮小した．前者は血管保護作用，後者 は神経細胞保護作用や抗炎症作用によるものと考えら れた．さらに，機能予後，生命予後も有意に改善し た．以上より，t-PA と PGRN の併用療法は，脳梗塞 に対する脳保護療法の有望な候補となる可能性が示唆 された．
5．おわりに
以上，PGRN は脳梗塞に対し，多面的な保護作用を 有すること，さらに脳保護療法を実現する治療標的分 子として有望であることを示した．今後，薬理作用の 検討や，投与量や投与タイミングを明らかにする薬効 薬理の検討が必要である．産学官連携を通して，この 創薬シーズを発展させ，日本発の臨床試験を目指した いと考えている． 本論文の発表に関して，著者らが開示すべき COI は 以下のとおりである． 下畑享良：第一三共株式会社，日本医療研究開発機 構（研究費） それ以外の著者に，開示すべき COI はなし． 文 献1） Lees KR, Bluhmki E, von Kummer R, Brott TG, Toni D, Grotta JC, Albers GW, Kaste M, Marler JR, Hamilton SA, Tilley BC, Davis SM, Donnan GA, Hacke W; ECASS, ATLANTIS, NINDS and EPITHET rt-PA Study Group, Allen K, Mau J, Meier D, del Zoppo G, De Silva DA, Butcher KS, Parsons MW, Barber PA, Levi C, Bladin C, Byrnes G: Time to treatment with intravenous alteplase and outcome in stroke: an updated pooled analysis of ECASS, ATLANTIS, NINDS, and EPITHET trials. Lan-cet 375: 1695–1703, 2010
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