学位論文内容の要旨

博 士 （ 農 学 ） ア サ ン テ ア ル ベ ー ツ

     学 位 論 文 題 名

  Screening of functional thizobacteria possessing antagonistic activities against Fusa ガ 勿 銘 oxysporzt7n     and phenolic acid ― decarboxylation abilities      （病原性フザリウムに対する拮抗活性および

フェノールカルボン酸脱炭酸活性を指標にした機能性根圏細菌の検索）

学位論文内容の要旨

  北海 道 大学 札幌 キャ ン パス 内に 自生 する37種類 の植 物根か ら単離した332株の根圏細菌 について、フ ェ ノー ル カル ボン 酸脱 炭 酸活 性を 指標にした機能性根圏細菌の 検索を試みた。それぞれの 分離細菌につ いてカフェ酸［（めー3，4―dihydroxycinnamic acid]を基質とした脱炭酸活性を検定し、57株に明らかな活性を 認め ることができた。それらの基 質誘導性ならびに基質選択性を調べ、多くの菌株がこれまで標準株として 用い てきたKlebsiella oxytoca JCM 1665株よりも狭い基質特異性を持つことを明らかにした。一方、上記の 332株 を含む541菌株を」h'usarium oxysporumf．sp.O′copersiciを被検菌とした対峙培養試験に供し、菌糸 伸 長阻 害 活性を持っものを検索した 。供試菌株のうち4株のみ（ 陽性菌株出現頻度0.7V0)が 強い菌糸伸長 阻害 活性を示し、その中でもヒメ ジョオン（キク科）から分離したGluconobacter属細菌71F株が最も強い活 性を 有していた。活性細菌株のフ ザリウム菌糸に対する特徴的な形態生理的効果として、菌糸側面からの過 剰分 岐と菌糸先端からの細胞内容 物の漏出が認められた。拮 抗細菌による伸長阻害を受け たフザリウム菌 糸で は、過剰分岐を起こしている 細胞では核分裂自体が活性 化する一方、細胞内容物が漏 れだした菌糸先 端部 分の核に由来する螢光は細胞 内容物全体に均一に分散し ていくことが分かった。拮抗 細菌に対峙した 菌 糸の 先 端部分は、核が崩壊するこ とにより速やかに死滅した 。活性化合物本体の単離精製 を試み、TLC 上 で単 独 スポットを与える化合物2 mgを得た。その化合物は分 子量138の低分子化合物であ ることを突き 止めた。

1） 機 能 性 根 圏 細 菌 集 団 か ら フ ェ ノ ー ル カ ル ボ ン 酸 脱 炭 酸 活 性 を 有 す る 細 菌 株 の 検 索 北 海道 大学 札幌 キャ ン パス 内に 自生 する37種類 の植物根を初夏から晩夏に かけて採取し、これらの根面 か ら332株 の 根 圏 細 菌 を 分 離 し た 。 この 各 々の 細菌 株を2 mMカ フェ 酸を 含む10 mlのPD液 体 培地 で48 時間培養し、遠 心によって培養液上清を得た 。この培養液上清を2M HC1でコンゴーレッド酸性にpH調整し た後に、1.5 mlの酢酸エチルで楢出した。ボルテックスミキサーによる撹拌で得られた上層（酢酸エチル層）

か ら5い1を その まま 順 相シ リカ ゲルTLCにチャ ージし、CHCI3−MeOH―HCOOH 50:5:1で展開した。展開し 終えたTLC板は、Gibbs試薬を噴霧し、脱炭酸生成物（3，4―dihydroxystyrene)と残存基質のスポットの消長 から、それぞれ の菌株のカフェ酸脱炭酸活性を検定した。標準細菌株としてKlebsiella oxytoca JCM 1665株 を用いた。検定試験の結果、基質が残存せず、3，4―dihydroxystyreneを唯一の生成物として与える細菌を57 株得た。次にそ れらが持っカフェ酸脱炭酸酵 素について基質誘導性なら びに基質選択性を調べるため、基

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質 を 合ま ないPD液 体培 地 で48時間 培養 した 菌 体の 培養 上清 をTris一HC1緩 衝液(50 mM，pH 7.2)に置き 換え 、その菌体懸濁液に5 mMカ フェ酸を添加して、25℃でさ らに12時間振とうした。そ の結果、試験に供 す る こと がで きた45株 の うち19菌 株のカフェ酸脱炭酸 酵素は常在型酵素で、13株が 完全に基質誘導型、

残り13株がそれらの中間型であ ることが分かった。基質誘導型カフェ酸脱炭酸酵素をもつ細菌株では、カフ エ酸は脱炭酸するものの、4→ヒドロキシケイヒ酸を全く受容できないタイプのものが6株見っかった。ケイヒ酸 脱 炭 酸 酵 素 保 持 細 菌 は 、 そ の 基 質特 異性 や 誘導 性に 大き なバ リ エー ショ ンが ある こ とが 示さ れた 。

2） 機 能 性 根 圏 細 菌 集 団 か らFusarium oxysporum菌 糸 の 生 育 を 阻 害 す る 拮 抗 細 菌 の 検 索 全て の菌株についてFusarium oxysporumf．sp.6′copersiciを被検菌とした対峙培養試験を行い、抗フザリ ウ ム 活 性 を も つ 分 離 細 菌 株 の 検 索 を 試み た。 培地 にはPDAとMWA (Winogradsky s無機 塩溶 液 に0.5%

sucroseと0.005%酵母 エキ スを 添 加し た修 飾寒 天培 地 ）を 用い た。MWAでは 気中 菌 糸の生 成が抑制され る た め、 抗菌 活性 の定 量 的評 価はMWAで行った。Foxyspor umを 被検菌に用いたアッセイ系 では、対峙す る細 菌株の抗菌活性に対する検出感度が大きく低下しており、Aphanomyces cochlioides（ホウレンソウ根腐 れ病 菌）を被検菌とした場合に 比べて、活性菌株の検出率が 極めて低く抑えられる。541株の分離細菌をこ の抗 フザリウム試験に供した結果、ヒメジョオン（キク科）から分離されたGluconobacter sp.2株(71D，71F) なら びにトクサ（トクサ科）か ら分離されたBurkholderia sp.2株(15C，15E)の合計4株にのみ強い菌糸伸長 阻害 活性が認められた。属が同 じ陽性細菌株はそれぞれ同じ 分離源から得られたため、 コロニー形態に多 少の 差異はあるものの、150と15Eおよび71Dと71Fはそれぞれ 同じ種であると考えられた 。検定した菌株ラ イブ ラリ全体からの陽性菌株の 検出頻度は0.7%であった。

3）F oxysporumのGluconobacter sp. 71F株 に 対 す る 形 態 生 理 学 的 応 答 とEtOAc抽 出 画 分 の 活 性   MWAで は気 中 菌糸 の生 成が 抑制 さ れる ため 、対 峙 した 細菌 に対するフザリウム菌 糸の形態的な変化が 容易 に 観察 でき る。 そ の利 点を 利用 し、MWA平板上で71F分離株によって菌糸コロニ ーの生育が阻害され たフザリウム菌糸 の菌糸形態の変化とそれに 伴う細胞生理的な応答について検討した。Gluconobacter sp.

71F株に 影響 を受けた菌糸で は、先端からやや距離をお いて（100 ym以上）菌糸側面 から過剰分岐を起こ し、 ま た菌 糸先端からは細 胞内容物の漏出が認められた 。核特異的螢光染色試薬で あるHoechst 33258で これ ら を染 色す ると 、 過剰 分岐 を起 こし て いる 菌糸 では 核数 が 著し く増 加し て おり 、有糸分裂自体が 活性化しているこ とが示された。一方、細胞 内容物が漏れだした菌糸先端 部分では、球状に膨らんだ細胞 内容 物 全体 にHoechst 33258特有の青白い螢光が認めら れ、クロマチン断片が分散し ていることが分かっ た。従って、拮抗 細菌に対峙した菌糸の先端 部分は、核が崩壊することにより菌糸細胞は速やかに死滅する ものと考えられた。

  Gluconobacter sp. 71F株 を一面に培養したPDA平板（2，400 ml、9cmプレートで200枚）を凍結後に解 凍し、ゲルの圧搾 と水洗を繰り返してして得られた培養液2，400 mlを等量の酢酸エチルで抽出した。酢酸エ チ ル 可 溶 性 の 粗 抽 出 物750 mgを 得 た が 、 培 地30 ml相 当 量 の 粗 抽出 液は 強いFoxysporum菌糸 伸長 阻 害活性を示し、Gluconobacter sp. 71F株との対峙培養時と同じFoxj´・！p0′甜朋菌糸形態異常を引き起こした。

4） Gluconobacter sp. 71F株 が 産 生 す る フ ザ リ ウ ム 菌 糸 生 育 阻 害 活 性 成 分 の 部 分 精 製 菌糸 生育 阻害 活 性を 指標 に、 活 性成 分の 追跡 と分 画 を行 い、シリカゲルカ ラムで30‑40％MeOH/CHCl3溶 出画 分に 活性 本 体が 認め られ た 。TLC分画によ って単一のスポットを与える 暗黄色油状化合物として2mg を得た。活性本体はFD‑MSで親イオンm/z 138を示し 、1H‑NMRスペクトルから1。4‐二置換芳香族であるこ とが分かった。

一連 の研 究の 結 果で は、PDA平板 上で抗フザリ ウム活性を示した4株は全て カフェ酸脱炭酸活性を示さな

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かったことから、脱炭酸活性を持たない細菌群と抗真菌性の因果関係を明らかにする必要がある。

  以 上 、 本 研 究 で は 北 大 キ ャ ン パ ス 内 に 自 生 す る37種 の 自 生 植 物 の 根 圏 か ら分 離 した332菌 株 を系 統的 スク リ ーニ ング にか け、4‐ ヒド ロ キシ ケイ ヒ酸 脱炭 酸 細菌 に関 する 新 たな知見を得ることができ た。 さら に 、厳 しい 条件 に設 定 した 抗フ ザリ ウ ム試 験で541菌株 から4株 の活 性細 菌を 見 いだ し、 16S rRNA遺伝子塩基配列の 相同性検索から2株がGluco門 〇bacte′sp.、残り2株がB甜rkholderia sp.である‐

こと を明 ら かに した 。最 も活 性 の強 かっ たGluconobacter sp. 71F株 につ い てフザリウム菌糸に対する 形態 生理 学 的影 響を 解析 し、 そ の活 性本 体を 単 離す るこ とが でき た 。

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学位論文審査の要旨

     学 位 論 文 題 名

  Screening of functional thizobacteria possessing antagonistic activities agalnStjkS ロ ダ 彪 兜 D 笠 y ゆ 〇 ダ勿 兜     andphen01iCaCid − deCarbOXylationabilitieS      （ 病原 性 フ ザリ ウ ムに 対 す る拮 抗 活性 お よ び

フ ェノ ー ル カル ボ ン酸 脱 炭 酸活 性 を 指標にした 機能性根 圏細菌の 検索）

   本 論 文 は 、 英 文 111 頁 、 図 41 、 表 14 、 4 章 か ら な り 、 参考 論 文 2 編 が付 さ れて い る 。    植物の 根に付着 する根面 細菌は、そ れらの根 への定着 性から、 宿主植物 に罹患する土壌 伝播性 病原菌に 対する生 物農薬資材 として有 望視されている。実際、めvitro 試験において 活性を 示すもの が多く見 っかってい るが、そ れらがin vivo で高い効果を示した例はほとん ど無く 、特にフ ザリウム 感染の防除 資材とし て実用化 されたも のは皆無 に等しい。以上の 事情か ら、微生 物農薬に よるフザリ ウム感染 病抑制は 困難なの ではない かとの疑問が呈さ れると ともに、 これまで の資材候補 を見いだ す検索方 法に大き な問題が あるのではないか との指 摘もある 。本研究 では、北海 道大学キ ャンバス 10 箇所で採 取した自 生植物の根面か ら 根面 細 菌を 541 菌 株分 離 し 、比 較 的拮 抗 細 菌が 見 っか り に くい と され て い る Fusarium oxyspor um 菌糸と の対峙培 養を行い 、4 株の拮抗 細菌を検索・単離・同定している。また、

分離菌株ライブラリ中から無作為に選んだ332 菌株について、カフ工酸（ 3 、4 ―ジヒド口キシ ケ イ ヒ 酸 ） 脱 炭 酸 活 性 の 有 無 に つ い て 調 べ 、 微 生 物 生 態 学 的 な 知 見 を 得 て い る 。

1 ． 機 能 性 根 圏 細 菌 集 団 か ら フ ウ ノ ー ル カ ル ポ ン 酸 脱 炭 酸 活性 を 有 する 細 菌株 の 検 索   20 科37 種 の植物根 圏から得 た 332 細菌株 について、 カフ工酸 を基質と した4 ―ヒ ド口キシ ケ イ ヒ 酸 脱 炭 酸 活 性 検 定 試 験を 行 った 。 脱 炭酸 活 性(PAD 活 性 ） を示 す 標準 細 菌 株に は Klebsiella oxytoca JCM 1665 株を用いた。その結果、基質が残存せず、3 ，4‑dihydroxystyrene を 唯 一の 生 成物 と し て与 え る PAD 活 性 陽性 細 菌 を 59 株得 た 。 さら に 、 それ ら のカ フ 工酸 脱炭 酸活性に ついて基 質誘導性 ならびに基 質選択性 を調べた 。その結 果、試験 に供するこ と が でき た 45 株 の うち 19 菌株 の カフ 工 酸 脱炭 酸 酵 素が 常在型 酵素で、 13 株が完全 に基質 誘導 型、残り 13 株が基質 によって 活性が著し く上昇す る中間型 であるこ とを明ら かにして いる 。更にカ フ工酸脱 炭酸酵素 をもつ細菌 株のグル ープから 、カフ工 酸は脱炭 酸するもの

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の、 4 ‐ ヒド口キ シケイヒ酸を基質として全く受容できないタイプのものを6 株見っけた。以 上の結 果から、 ケイヒ酸 脱炭酸酵 素保持細 菌群には、 基質特異 性や誘導 性に比較的幅があ ること を示した 。

2 ． 機能性根 圏細菌集 団から Fusarium oxj ′ spor um 菌糸の生 育を阻害 する拮抗細菌の検索

  541 株の分離細菌を寒天平板培地による抗フザリウム試験に供し、ヒメジョオン（キク科）

か ら分離さ れた Gluconobacter sp.2 株 (71D ， 71F) ならびに トクサ（ トクサ科 ）から分離し た Bur 肋〇たを′血 Sp ．2 株（ 15C ， 15E ）の合計4 株を抗フザリウム活性細菌株として得た。属が 同 じ細菌株 はそれぞ れ同じ分 離源から 得られた ため、コ口 二ー形態 に多少の 差異はあるも の の 、 15C と 15E お よ び 71D と 71F は そ れ ぞ れ 同 じ 種 で ある と 考 えら れ るが 、 4 菌 株 を別 菌 株 と 見な し て も、 検 定し た 菌 株ラ イ ブラ リ 全 体から のアッセ イ陽性菌株 の検出頻 度は O ． 7 ％と極めて低いことを示した。

3 ． F oxysporum の Gluconobacter sp. 71F 株に対する形態生理学的応答と EtOAc 抽出画分の活 性

  MWA で は気 中 菌 糸の 生 成が 抑 制 され る ため 、 対 峙し た 細 菌に 対 する フ ザ リウム 菌糸の 形 態 的 な 変 化 が 容 易 に 観 察で き るこ と を 示し た 。こ れ を 利用 し 、 MWA 平 板 上で 71F 分 離 株によっ て菌糸コ 口二ーの 生育が阻 害された フザリウ ム菌糸の菌 糸形態の 変化とそれに伴 う細胞生理的な応答を調べた。Gluconobacter sp. 71F 株に影響を受けた菌糸では、先端から やや距離 をおいて （数 100 lim 以上 ）菌糸側 面から過剰分岐を起こし、また菌糸先端からは 細胞内容 物の漏出 を認めた 。核特異 的螢光染 色試薬である Hoechst 33258 でこれらを染色す ると、過 剰分岐を 起こしている菌糸では核数が著しく増加することを明らかにした。一方、

細胞内容 物が漏れ だした菌 糸先端部 分ではク ロマチン 断片が分散 している ことを確認し、

拮 抗 細 菌 に 対 峙 し た 菌 糸 の 死 滅 に は 核 の 崩 壊 が 伴 う こ と を 明 ら か に し た 。 4 ．  Gluconobacter sp. 71F 株が 産 生 する フ ザ リウ ム 菌糸 生 育 阻害 活 性成分 の部分精 製   Gluconobacter sp. 71F 株を一面に 培養した PDA 平板（2 ， 400 ml 、 9cm プレートで200 枚）

を凍結後に 解凍し、 ゲルの圧 搾と水洗 を繰り返してして得られた培養液2 ， 400 ml を等量の 酢酸 エ チル で 抽出した 。酢酸エ チル可溶性 の粗抽出 物 750 mg を得た が、培地 30 ml 相当量 の粗抽出液は強い F oxyspo ′um 菌糸伸長阻害活性を示し、Gluconobacte ′ sp. 71F 株との対峙 培養時と同じ F oxysporum 菌糸形態異常を引き起こした。

   こ れらの研 究結果の うち、フ ザリウムに 対する拮 抗細菌の 検索とこ れに対峙 した菌糸に つ いての細 胞生理学 的な検討 内容は、 2006 年 の IUPAC 国際農 薬化学会 議 in Kobe で Selected Oral Presentation に選ばれ、また、それらの内容をまとめたオリジナル論文一報が日本農薬 化学学会欧文誌であるJournal of Pesticide Science(I.P. 0.55) に受理され、現在印刷中である。

ま た、フウ ノールカ ルポン酸 脱炭酸活性 を有する 細菌株検 索の研究 成果は、 農学部紀要英 文 誌Journal of Research Faculty of Agriculture ， HD 妣砒め跏 fvP 朋緲に受理されている。

   よって、審査員一同は、 Albert Asante が博士（農学）の学位を受けるのに十分な資格を有

するものと認めた。