大腸癌発 増殖 及 す胆汁酸 影 響 関す 実験的研究

54 0 金沢 大学 十 全 医学 会 稚 誌 第9 4巻 第3 号 5 4 0−56t^l く1 9 85ユ

大腸癌 発^生増殖^に及^ぼす胆汁酸^の影響^{に関する実験 的研 究}

一 内 的環 境と し て^の 胆汁 中胆汁 酸 組 成^の変 化^{に つ い} て ^一

金 沢大 学 医 学 部 外科 学 第二講 座 く主 任^こ宮 崎 逸 夫教 授1

小 森 和 俊

く昭和^{6 0}年⁵ 月7 日受 付I

本研 究は大腸 癌 発 生増 殖 過 程^{にお け る}内 的 環境と して の胆 汁 中 胆 汁酸 組 成の変化を究 明す ること を 目 的と し た^． 作用機 序な ら びに投 与 経 路の異る 2種の発 癌 物 質，N⁻メチル^ーN^しニ ト^ローN ^−ニト^ロ ソグ ア^ニジ ンくN^Am ethyトN ^，−nitr o⁻N ⁻nitr o s og^{u a n}id in e， M N N Gl ^およ び 1，2⁻ジメチ^{ル ヒ}ド ラ ジ^ンく1_，2⁻di^m ethyl−

h_ydr a zin e， D M Hl で誘 発さ れ た大 腸 癌 担癌ラッ ト で の胆 汁 中 胆 汁酸 組 成を分析し， さ らに これ^{ら の}発癌

物 質投 与 後^にお け る経 時 的な胆 汁酸 組 成の推移を病理組 織 学 的 所 見と対比検 討し た． ま た臨 床 的^に大 腸癌 患 者にお け る胆 嚢 胆 汁 中胆 汁 酸組 成^{に つ い}て も検 索し た． その結 果，M N N G 誘発 大腸 癌^の胆 汁 酸 組成比 は

コ ^ー ル酸 くcholic a cid_，C Al ^の上昇， 未 同 定胆 汁 酸X の減 少， 1次 胆 汁 酸量12 次胆 汁 酸量値お よ び C AI D C A げオ キシコ ^ー ル酸， de o xycholic a cidl 値の上昇を 示 し， D M H 誘発 大 腸 癌で は C A の上軋 ケノ デ オ キシコ ^ー ル酸 くche n ode o xycholic a ci d，C D C Al ^およ び未 同 定胆 汁酸X の減 少， 1次 胆 汁 酸量12次 胆 汁酸 量 値と C AID C A 値の 上昇と， ほ ぼ同様^の組成比 を 示 し た． ま た， 大腸 癌 患 者^の胆嚢 胆 汁 中胆 汁 酸組 成で は C D C A の 上昇， D C A の減少に加え， 1次 胆 汁 酸量ノ2 次 脚 十酸量値と C AID C A 値の 上昇を認め，

個 体^によ る胆 汁酸 代謝 過 程^の相 違^から胆 汁 酸の種 類は臭^っ て も， 1次 胆 汁 酸^の上 昇， 2次 胆 汁 酸^の減 少と いう 点で は ^一致し た結 果を 示 し た． これ らの胆汁 酸組 成^の変 化は， M N N G 注 腸経 過 観 察群^では注腸 後16 週 以 阻 D M H 皮 下 注経 過 観 察群で は総 投 与 量2 0 0 mgノkg の ^いずれ も病理組 織 学 的^に腺腰性ポ リ^ー プ の出 現す る時期と ^一致し^てみ ら れ た． 以上 よ り， 大 腸癌 担 癌 個体^の胆 汁で は ^一定の胆 汁酸 組 成比を 示 す^こと が 判 明し， し^かも^{， こ}の組成比 の変 化が大腸 粘 膜^に腰 瘍 性 変 化の発 生す る時期と ^一致し た^ことから， 発癌物 質で initiate さ れ た大 腸 粘 膜 自体^の変 化が閉 鎖 的な胆 汁 酸 代 謝^に影 響を及ぼ し， 大腸 癌^の発 生 増 殖^に対し 促 進的 内的環 境^を形 成す る も^のと結 論し た．

K ey ^{w o r}ds c olo n c a r cin o m a_， N ⁻m eth_yl⁻N^，−nitr o⁻N ⁻ nitr o s og^{u a n}id in e_，

1，2⁻ dim eth_ylh_ydr a zin e_，b ile a cid．

大 腸癌の発 生は種々 の疫 学 的研 究^から個体の食 生 活 と密 接^に関 連す る^こと が指 摘さ れ て^いる^1卜51． す な わ ち， 家族 性ポ リ ポ^ー ジスな ど^一部^の大腸 癌^では遺 伝 的 素 因^によって そ の発 生が規 定さ れて いる が^6I， 大 部 分

の大 腸 癌は食 餌^に由来し た外 来性n o x a の みな らず個 体^の内的 環境^の変 化^に基づ き成立 す る ものと言え る^． Sa nde r ら⁷¹は胃 内^で亜硝 酸^と二級アミ ン か ら発 癌 性

を有す る^ニ ト^ロソ化合 物が 生成さ れ る^こと を証 明し た

が， 近 年， 大腸 内^{に お い て}も腸 内細 菌 華^の作用^によっ

て硝 酸が 亜硝 酸に_， アミ ノ酸か ら^二級ア ミ^ンが 生成さ れ， 同 様の物 質が産生 さ れ る 可能 性が指 摘さ れ^てい

る⁸¹． これ は個 体が食生活を営む限り絶えず大腸癌発 生に対し負荷 状 態にあ る^こと を意 味す る． ところ^で，

欧 米 諸 国で の大 腸 癌愕 患率が ア ジ ア， ア フリ カ諸国^に 比 し高^{い こ}と は 周知^の事 実^であ り^{1 馴} ， そ^の要因とし て， 食 餌 性 因子， と くに高 脂 肪食 摂 取^に基 づ く糞便中

A b bre viatio n s ニ a．C．， ade n o c arcin o m ai C D C A ， Che n od e oxy^cholic a cid_i C A， Cholic a cid_i D C A， d^{e o x}_y^cholic a cid_ニD M H ， 1，2⁻d im eth_ylh_ydr azin ei L C_，1ith o cholic a cid _三M N N G， N^．

m eth_yl^．N ^，−nitr o⁻N ⁻ni_tr o s og^{u an}idin ei p ^{m ，} p^{r O}p^{e r m u S C u}la r lay^{e r}三^S， S e r O S al lay^{e r}ニ^{S m，} s ub m u c o s al lay^{e r}言^{S S，S u}bs ero s al lay^{e r}ニU D C A ，u r S Ode ox y^cholic a cid ．

大 腸 癌 発生 増 殖^と馳H十酸

の胆汁酸組成^の変 化な ら び^に胆 汁 酸排 泄量の増 加が挙 げら れ 促進 国子 と し^{て の}胆 汁 酸の重要 性が指 摘さ れ て^いる1 O 卜 1 2 ，

． N a ris a w a ら^{1 3 J}は 化学発癌 物 質N^．メチ

IL^．N−^{，L トロ}ー^{N−ニ トロ ソグ アニ ジン くN ．m eth}yl⁻N^，．

nitr o⁻N^．nitr o s ogu a nid in e， M N N Gl の水溶 液 注 腸^に ょ る実験 大腸 癌^モデルを作 製し， 胆汁 酸の経口投 与を 付加す る^ことによって， 胆汁 酸は発 癌 性を有し な^いが 大腸癌発 生^に促進 的 作用 を持^{つ こ}と を報 告し ている．

また， 片山^川は 人^工月工門 造 設^によ る便 流 遮 断 大腸を作 製し， こ の空置大 腸^に M N N G に加え各 種胆 汁 酸の付 加注腸 投与を行^い， 1 次胆 汁 酸 群^{に比 し 2} 次 胆 汁 酸群

で大腸癌 発生率^に有 意^の増 加を認め た と し， 2 次 胆汁 酸が促進 的作用^の主役を演じ ている と結論し て^いる．

こ のよ う^に大 腸癌^発生上， 胆 汁 酸， と くに2 次 胆 汁酸

の p^{r o m o}to r と し て^の役 割^には問題は な^いが，反面，胆

汁酸代謝^に影 響^の少ない低月旨肪食 状 態^でも少な か ら ず 大腸癌が 発 生 し た り^{1 5 I}， さ らに_， M N N G や1 _，2 ジメ チ^ルJtI ド^ラジンく1，2⁻d im ethylhydr a zine，D M Hl な ど の発癌物 質単 独投 与^によって も高 率^に大腸 癌が 発生す る報告1 3 H 即 1 7 1

も み ら れ る． こ の こと は，大 腸 内^{で 生}成さ れた発癌 性を有す る^ニ ト^{ロ ソ}化 合物や外 来 性の発 癌 物 質自体， あ る^いはこれ らの発 癌物 質^でinitiate さ れ た 大 腸粘膜 動態の変 化や腸 内細 菌叢^の変化が， 元来閉 鎖 的^であ る 胆汁酸代 謝^に影響を及ぼ し， 大 腸 癌発 生に促 進的内的 環境を 形成す る可 能性を推 察さ せ る．そこ で_，

著者は臨 床的な ら びに実 験 的に大 腸癌 担 癌 生体^{にお け} る胆汁中 胆汁 酸組 成^の変 化を検 索す る と と もに， 投 与 径路と作用機 序^の異^った 2 種^の発癌 物 質， M N N G お よ び D M 壬i ^によ る大 腸 癌発 生 過程^{で の}経 時 的な胆 汁 中胆汁酸組 成^の推 移を検 討し た^． その結 果， 大腸 癌 発 生増殖^に及 ぼ す 胆汁酸の影響^に閲し 興味あ る知見を得 たので報 告す る．

対 象およ び方法 I ^． 実験 動物

オ リエンタ^ル固型飼 料^およ び水道 水で飼 育し た 2 5 0 g前後のW ista r系 雄 性^ラット を 用 ^い， 下 記^の処置を して実験^モデル を作 成し た．

1 ． M N N G 注 腸^ラッ ト

M N N G の投 与 方 法は， 蒸 留 水^で溶 解し た^{0．2 5}％ M N N G く和光純 薬^工業 株 式 会社 製l 液1 ml を ネ ラ トン カテ^ー テル く6 ^フレンササイ ズフ で ラッ ト月工門よ り 8 日間連日 注腸 投与し た^． 対照には生理食塩水を同 様^に 注暢し た^ラット を 用^い た． M N N G誘 発大腸 癌 担 癌

ラ_ットに おけ る 胆汁 酸^分析^には，注腸 後⁴0過以 上 を経 過し たラ_ットで大腸に癌腰 を有す る ものを 用^い， 対照 ラット と比較 検討し た． さ らに， 経 時 的な胆 管 内胆 汁

5 41

中胆 汁 酸組 成の推 移を検 討す る た め， 癌腰 発 生^の有 無

に か かわ ら ず， 大腸 癌 発 生過 程と し て， 8 日間連日注 腸直 後の ラットく1 群I，注腸 後⁴週 経 過し た ラットく2 群I， 16 邁経 過ラッ トく3 群ン， 40過 程 過^ラットく⁴ 群う 及 び対照 ラットの 5群を 用^いた^．

2 ． D M 王i 投 与ラット

D M H 仁和光純 薬工業 株式 会社 製フ^は， 重 炭酸^{ソ ー} ダ

に溶 解^し， PH を 6 ^に調 製し た状 態で20 m glkg首

ラ_ット大腿皮 下に1 週 間^に1 回注射し た． D M H 誘発 大腸 癌担 癌^ラッ トにお け る胆 汁酸 分 析^には， 総 投 与量

40 0 mgノkg， お よ び 4 0 0 mgJkg 投 与 後4 過 経 過し た ラッ トで大 腸に癌 腫を有す る も^のを 用^い， 対 照を無処 置ラット と し， 比較 検討し た． さ らに_， 経 時 的な胆管 内胆 汁 申胆 汁酸 組 成の推 移を検 索す る た め， 癌腫 発生 の有無にか か わ らず， 大 腸 癌発 生 過程と し て， 総 投与 量2 00 m glkg投 与 直 後^{のラッ ト}く^1，君判， 4 00 m gJkg

投 与直 後^{ラッ ト}く2 ^，群l， 4 0 0m glkg投 与 後4週 経 過 ラッ トく3^〆群1 お よ び対照^ラット^の4群を用^いた．

3 ^． 大 腸 癌判 定基準

摘 出さ れ た大 腸^において肉 眼的に隆起性 病 変と して

観 察さ れ た ものを腫瘍と し， 組 織 学 的な痛の判定は^ヒ ト腺 病 判 定基準に従^い， 大 腸癌 取^り扱^い規約^欄に準じ 検 討し た．

H ^． 膿 汁酸の抽 出と 測定

1 ． 胆 汁採 取 法

麻 酔は 2 5 m gノk_{g の}塩 酸ケ タミ ンを 用^い， 正中 切 開

にて開腹し た^． 総 胆管を末端 部^で結 染後， 肝側 総 胆 管 を切 開す る と と もに3号ア トム静脈カ テ^ー テル け ト ム株 式 会社 製1 を挿入 し， 滴 下す る胆汁を採取， う ち 0^．2 ml を胆 汁 酸測 定^に供し た く図¹つ．

Fi_g．1． D iagr a m to c olle cted theb ilefr o m the r at．

5 42 小

2 ^． 胆汁 酸 抽 出法

1ラ 中性^ステ^{ロ ー ル}除 去法

採 取 胆 汁0^．2 ml に 4 mlの エタノ^ー ル を加え 2 4時 間放 置 後^これ を振 畳， 遠心く3 5 0 0 回転 10 分間I し た．

そ の 上清^{1 m}lに 1N 苛 性ソ ^ー ダ^{4 m}l と^ヘ キ サン5 血1 を添 加振 畳し，中性^ステ^{ロ ー} ルを^ヘキ サン層に移し た^． 同様^の操作を4 回繰り 返 し， 残 留 液を テ^{フロ ン}試 験 管^に入 れ た^． ま た， 試 験 管 付 着 液は1N 苛 性^{ソ ー}

ダ^ニエタ^{ノー ル}く1 こ1 VノVI2 ml で洗い， テ^{フロ ン} 試験 管^に追加し た．

2う 抱 合胆 汁 酸の加 水 分解な ら びに遊 離 胆 汁酸 抽 出 法

試 料^の入った テフロ ン試 験 管を沸 騰 水浴 加温^でエタ ノ^{ー ル}を除 去し た後， オ ^ー ト クレ ^ー プ く1 20⁰C， 1 kgノ

c m³I で 4 時 間加 熱し胆 汁 酸を す^べて遊 離 型^に加 水 分 解した．次^いで 6 N 塩酸を 用^い pH l ^に調整 後，5 ml の

エタノ ^ー ル添 加操 作を 3 回^に亘 り繰り返すことによっ

て遊 離 型 胆汁 酸を抽 出し た． なお， 内部 標 準物 質と し て 5 月コ ラン酸の ク^{ロ ロ}ホ ル ム溶 液^およ び無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ^ム5g を添 加 摸 拝 後1 時 間 放 置し， ガ ラ^ス フ ィ ルタ ^ー くG3さを 用^いて濾過 し た^．

3I 胆 汁 酸カ^ルポ キ^{シ ル}基の メチ^ルエステル化 室 温 下^{でロ ー} タ リ^ー 式^エバボレ ^ー タ^一 によっ て溶媒 を減 圧 留去した． なお， 管 壁^に付着し た胆汁 酸^に対し

て は少量^{の エ}タノ ^ー ルを 用^い再度 減圧留 去し た． これ にエ タノ ^ー ル0^．2 ml を加え る と と も^に黄 色に着色す る まで新 鮮^{な ジ ア ゾメタン の エタノ ー ル}溶 液を添加 し， 密 栓し た状 態^で2 0 分間放 置し た．

41 胆 汁酸側 鎖 水酸 基^{のト リメチル シリル}化 溶 媒を デ^{シ ケ 一} 夕^ー く乾 燥 剤^二五 酸化リンプ^に入 れ 真 空ポンプで5分 間減圧吸引し た後， 8 0⁰Cの恒温槽で 3 0分 間加 温し た^． 次^{い で}，デ^シケ^一 夕 ^ー を室温^に戻 し，

ト リ^メチ^JL，ケ イ素 化割 くT M S^．H T10^．2 ml を加_え，20 分 間反応さ せ た．

3 ^． ガ^スク^{ロ マ} ト グ ラフ ィ^ー によ る 胆汁 酸分析^およ び定 量

1う ガスク^{ロ マ}ト グ ラフ ィ^ー 操 作 条 件

島 津G C⁻4 A P F ガ^スタ^{ロ マ} ト グ ラ^フ く島津製作所株 式 会 社 製つ を 用^い， 次の操作 条 件と し た．

カ ラム ニ3 m m 〆^X 2 m ガ ラスカ ラム

固定 相 液体こ p^oly 工 1 1 0，0．20％ 担 体^こC hr o m o s o rb W 8 0^〆−1 0 0 N P カ ラ^ム温 度^こ2 0 0⁰C

試 料 注入部 温度^二2 5 0^ウC キャリ ア ガス ニHe5 0 ^mll min

2う 胆 汁酸^の分 析と定 量

抽 出 操作^によ り得ら れ た溶 液1 ^．5 ul を ガ^スクロ マ

トに注入 し， 記録 紙^に描写さ れ た ガ^スク^{ロ マ}ト グラ^ム

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Fig^．2． Ga s^．chr o matogr aphic sta nd^{a r}d ele v atio n pat te r n of b ile a cids− C A， Cholic a cidニ D C A，de o xycholic a ci dこC D C A ， Che n ode o xycholic a ci di L C，1itho cholic a cidこU D C A，

u r s ode o xycholic a ci d．