視床下部オレキシンニューロンの機能維持に影 響を及ぼす要因の解析

平成 24 年度 熊本大学学位論文

視床下部オレキシンニューロンの機能維持に影 響を及ぼす要因の解析

道永 昌太郎

Analysis of factors affecting functional viability of hypothalamic orexin neurons

Shotaro Michinaga

平成24年度

熊本大学学位論文

視床下部オレキシンニューロンの機能維持に影 響を及ぼす要因の解析

道永昌太郎

Analysis of factors affecting functional viability of hypothalamic orexin neurons

Shotaro Michinaga

Analysis of factors affecting functional viability of hypothalamic orexin neurons

Shotaro Michinaga

Narcolepsy is a central nervous system disorder characterized by

disruption of sleepiness and wakefulness. Several lines of evidence suggest that orexin, a hypothalamic neuropeptide, is involved in narcolepsy.

Namely, based on observations that the brain of narcoleptic patients exhibits a selective decrease of orexin neurons and that mice lacking orexin or orexin neurons display narcoleptic symptoms, it is suggested that narcolepy results from a decrease of orexin neurons. However, the causes and the mechanisms of selective decrese of orexin neurons are unknown. Here I studied the

following issues with reference to pathophysiological characteristics of orexin neurons, using rat hypothalamic slice cultures.

1. Neuronal activity-dependent maintenance of functions of hypothalamic orexin neurons

Previous investigations have revealed that continuous excitatory stimuli associated with neuronal depolarization induce selective depletion of orexin from hypothalamic slice culture. Here I examined the effect of continuous inhibition of neuronal activities on orexin neurons. Tetrodotoxin (TTX) and Mg²⁺, both of which inhibit neuronal excitation, induced a significant decrease of orexin-immunoreactive neurons but not melanin-concentrating hormone (MCH)-immunoreactive neurons. The decrease of orexin by TTX and Mg²⁺ resulted from depletion of orexin but not induction of cell death, which was evidenced by reversibility of the decrease of orexin. Several types of Ca²⁺ channel blockers and NMDA receptor antagonists also induced selective decrease of orexin. Moreover, the decrease of orexin by TTX was prevented by NMDA. These results suggest that orexin neurons are sensitive to inhibition of neuronal activities, and that expression of orexin is

maintained by NMDA receptor-mediated glutamatergic synaptic inputs.

2. Selective depletion of orexin by ropinirole, an anti-Parkinson drug, in hypothalamic slice cultures

Non-ergot dopamine D2 agonists such as ropinirole are frequently used for therapies of Parkinson disease. These drugs occasionally produce serious

side effects such as sudden sleep attacks whose mechanisms are unknown.

I examined the effect of ropinirole on orexin neurons because orexin plays a key role in maintenance of arousal states. Ropinirole (100 M -1 mM)

induced a decrease of orexin-immunoreactive neurons but not MCH- immunoreactive neurons in hypothalamic slice cultures. The decrease of orexin was reversible after washout of ropinirole and was significantly attenuated by antagonists at D2 receptors and 5-HT1A receptors. In addition, stimulation of NMDA receptors reversed the decrease of orexin and

increased expression of c-Fos, a marker of neuronal excitation. Thus, orexin neurons are sensitive to non-ergot dopamine D2 agonists, and these drugs decrease orexin expression by inhibition of neuronal activities.

3. Sensitivities of orexin neurons to endoplasmic reticulum stress Endoplasmic reticulum (ER) stress is implicated in the pathogenesis of several kinds of neurodegenerative disorders. I examined whether orexin neurons in hypothalamic slice cultures were vulnerable to ER stress. ER stress inducers such as tunicamycin and thapsigargin caused a significant decrease of orexin-immunoreactive neurons, and the decrease was more prominent than that of MCH-immunoreactive neurons. The decrease of orexin by 24-h treatment with tunicamycin was caused by depletion of orexin resulting from attenuation of translation and proteasomal degradation. On the other hand, 72-h treatment with tunicamycin induced apoptosis of orexin neurons evidenced by increase in cleaved caspase-3. Moreover, expression of ER stress markers such as phosphorylated PERK and CHOP was more prominently increased in orexin neurons than in MCH neurons during

treatment with tunicamycin. Several stimuli such as application of NO donor and proteasome inhibitor as well as depletion of cellular glucose also induced expression of CHOP in orexin neurons. These results indicate that orexin neurons are more sensitive to ER stress than other hypothalamic

neuropeptide-containing neurons.

Overall, the present study demonstrates that orexin neurons are more sensitive to several kinds of stimuli than other hypothalamic neurons, and that expression of orexin can undergo dynamic changes. These

characteristics of orexin neurons may be involved in the selective decrease of orexin neurons in narcopley, and help elucidating the pathogenic

mechanisms of this neurological disorder.

論文要旨

視床下部オレキシンニューロンの機能維持に影響を及ぼす要因の解析

ナルコレプシーは, 睡眠・覚醒の破綻をきたす神経疾患である. 近年, 視床下部のニ ューロペプチドであるオレキシンが本疾患の病態に深く関与することが明らかとなっ た. すなわち, ナルコレプシー患者ではオレキシンニューロンの選択的減尐が認められ, オレキシン欠損マウスやオレキシンニューロン変性マウスではナルコレプシー様の症 状が現れることから, オレキシンニューロンの減尐がナルコレプシーの本態であるこ とが示唆されている. しかし, オレキシンニューロンの選択的減尐に至る原因や機序に ついてはほとんど解明されていない. そこで本研究では, オレキシンニューロンの病態 生理学的性質に着目し, ラット視床下部培養組織切片を用いて以下の検討を行った.

1. 神経活動に依存した視床下部オレキシンニューロンの機能維持

これまでの研究により, ニューロンの脱分極を引き起こすような興奮性刺激を持続 的に与えると, 視床下部組織切片中のオレキシンが選択的に枯渇するという結果が得 られており, 神経活動レベルがオレキシンニューロンの機能維持に重要であることが 推察される. そこで, 神経活動の持続的な遮断がオレキシンニューロンの生存および機 能維持に与える影響について検討した. 神経活動を強く抑制するテトロドトキシン

(TTX)やMg²⁺を処置すると, 切片中のオレキシン陽性細胞は顕著に減尐し, その一方で

近傍に存在するメラニン凝集ホルモン(MCH)陽性細胞の減尐はほとんど認められなか った. TTX や Mg²⁺の処置後の切片中で細胞死の兆候はみられず, またオレキシン陽性 細胞の減尐は可逆的であったことから, オレキシンの消失はオレキシンニューロンの 細胞死や脱落によるものではなく, 細胞内のオレキシンの枯渇によることが示唆され た. また, 種々のCa²⁺チャネル遮断薬やNMDA型グルタミン酸受容体遮断薬を処置し た場合においても, 切片中のオレキシンは選択的に減尐した. さらに, TTXによるオレ キシンの減尐は NMDA の共処置により著明に抑制された. これらの結果より, オレキ シンニューロンは視床下部に局在する他のニューロンよりも神経活動の遮断による影 響を受けやすく, オレキシンの発現はNMDA受容体刺激および細胞内へのCa²⁺流入に より維持されていることが示唆された.

2. パーキンソン病治療薬ロピニロールによるオレキシンの選択的な減尐

パーキンソン病治療薬として頻用されるロピニロールなどの非麦角系ドパミン D2受 容体アゴニストは, 重大な副作用として突発性睡眠を生じる場合があるが, その詳細な 原因は解明されていない. そこで, 覚醒の維持において重要な役割を担うオレキシンニ

ューロンに対するロピニロールの作用を検討した. ロピニロール(100 M～1 mM)を処 置すると, 視床下部組織切片中のオレキシン陽性細胞は顕著に減尐し, MCH 陽性細胞 の減尐はほとんど認められなかった. ロピニロール処置後の切片中に細胞死の兆候は みられず, オレキシンの減尐も可逆的であったことから, ロピニロールはオレキシンニ ューロンの細胞死を誘導せず, オレキシンを枯渇させることが示唆された. また, ロピ ニロールによるオレキシンの減尐はドパミン D2受容体およびセロトニン 5-HT1A受容 体の遮断薬を処置することで抑制され, これらの受容体の関与が明らかとなった. さら にNMDAの共処置は, ニューロンの興奮マーカーである c-Fosの発現を増加させると ともに, ロピニロールによるオレキシンの減尐を抑制した. これらの結果より, オレキ シンニューロンは非麦角系ドパミン D2受容体アゴニストの影響を受けやすく, これら 薬物は神経活動の抑制を介してオレキシンの発現を減尐させることが示唆された.

3. 視床下部オレキシンニューロンの小胞体ストレス感受性の解析

小胞体ストレスは, パーキンソン病など特定のニューロンの変性・脱落が認められる 神経変性疾患の病態形成に関与することが示唆されている. そこで, 小胞体ストレスが オレキシンニューロンに与える影響について検討した. 小胞体ストレスを誘導する tunicamycin あるいは thapsigargin を処置すると, 視床下部組織切片中のオレキシン 陽性細胞はMCH陽性細胞よりも著明に減尐した. この細胞数の減尐がアポトーシスに よるかを調べたところ, 活性型カスパーゼ-3の発現はtunicamycinの24 時間処置では 誘導されず, 72 時間処置では著明に増加した. つまり, 小胞体ストレスが生じると細 胞内のオレキシンは速やかに枯渇し, 小胞体ストレスが持続するとオレキシンニュー ロンのアポトーシスが誘導されることが示唆された. また, 小胞体ストレスによりオレ キシンが枯渇する原因について調べたところ, 翻訳の抑制およびプロテアソーム系に よる分解が関与することが示唆された. さらに, tunicamycin 処置による小胞体ストレ ス応答関連分子の発現変化を調べたところ, 翻訳抑制に関与するリン酸化 PERK およ び細胞傷害性の転写因子である CHOP の発現は, オレキシンニューロンの方が MCH ニューロンよりも顕著であった. オレキシンニューロンにおける CHOP の発現は, 小 胞体ストレスを誘導する一酸化窒素ドナーやプロテアソーム阻害薬の適用, 細胞内の グルコース枯渇によっても誘導された. これらの結果より, オレキシンニューロンは視 床下部に局在する他のニューロンよりも小胞体ストレスに対する感受性が高く, 小胞 体ストレスによる傷害を受けやすいことが示唆された.

以上, 本研究により, オレキシンニューロンは他のニューロンよりも様々な刺激によ る影響を受けやすく, オレキシンの発現は変動しやすいことが示唆された. このような オレキシンニューロンの特性は, ナルコレプシーにおいて認められるオレキシンニュ ーロンの選択的減尐に関与する可能性があり, 本疾患の病理形成機序を解明する上で 重要な示唆を与えるものである.

略語表

本論文で使用した略号を以下に示す.

AMPA : -amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate AP-5 : DL-2-amino-5-phosphono-pentanoic acid

ATF6 : activating transcription factor 6

Bip : immunoglobulin heavy-chain binding protein CGRP : calcitonin gene-related peptide

CHOP : C/EBP homologous protein

CREB : cAMP response element binding protein CRF : corticotropin-releasing factor

DEPC : diethylpyrocarbonate

eIF2 : eukaryotic initiation factor 2

ERAD : endoplasmic reticulum associated degradation GAPDH : glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GSNO : S-nitrosoglutathione

HBSS : Hanks’ balanced salt solution HLA : human leukocyte antigen IRE1 : inositol requiring protein-1 IgG : immunoglobulin G

MCH : melanin-concentrating hormone MEF2 : myocyte enhancer factor 2 MEM : minimum essential medium

NBQX :1,2,3,4-tetrahydro-6-nitro-2,3-dioxo-benzo [f]quinoxaline-7-sulfonamide

NMDA : N-methyl-D-aspartate NO : nitric oxide

PBS : phosphate buffered saline PCR : polymerase chain reaction PDI :protein disulfide isomerase

PERK : protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase PI : propidium iodide

RT : reverse transcription TAE : tris-acetate-EDTA

TMB : 3, 3', 5, 5' -tetramethylbenzidine TTX : tetrodotoxin

TUDCA : tauroursodeoxycholic acid UPR : unfolded protein response UV : ultraviolet

本論文は, 学術雑誌に掲載された下記の論文を基礎とするものである

1.Inhibition of neural activity depletes orexin from rat hypothalamic slice culture.

Shotaro Michinaga, Akinori Hisatsune, Yoichiro Isohama, Hiroshi Katsuki.

Journal of Neuroscience Research88, 214-221 (2010).

2. An anti-Parkinson drug ropinirole depletes orexin from rat hypothalamic slice culture.

Shotaro Michinaga, Akinori Hisatsune, Yoichiro Isohama, Hiroshi Katsuki.

Neuroscience Research 68, 315–321 (2010).

3. Orexin neurons in hypothalamic slice cultures are vulnerable to endoplasmic reticulum stress.

Shotaro Michinaga, Akinori Hisatsune, Yoichiro Isohama, Hiroshi Katsuki.

Neuroscience 190, 289–300 (2011).

目次

第

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1

第

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5

第

節 実験材料 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5 第

項 実験動物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5 第

項 試薬 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5 第

項 抗体 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 6 第

項 オリゴヌクレオチド ・・・・・・・・・・・・・ 7 第

節 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 8 第

項 視床下部切片の作製および培養 ・・・・・・・・ 8 第

項 薬物処置 ・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・ 9 第

項 免疫組織化学染色および細胞数の計数 ・・・・・ 9

第

項

法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・ 12

第

項 統計 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 15

第

維持・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 16 第

節 背景・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・16 第

節 実験成績・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 18

第

項

および

によるオレキシン陽性細胞の減尐 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 18 第

項

および

の

陽性細胞への影響

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 22 第

項

および

によるオレキシン減尐の可逆性 ・・24 第

項

および

によるプレプロオレキシン

発現

量の変化・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 27

第

項

流入阻害によるオレキシン陽性細胞の減尐・・・・ 29

第

項 グルタミン酸受容体遮断によるオレキシンの減尐・・・ 31

第

項

受容体刺激によるオレキシンの発現維持・・・・ 33

第

節 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・35

第

な減尐・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 42 第

節 背景・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 42 第

節 実験成績・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 44

第

項 ロピニロールによるオレキシン陽性細胞の減尐・・・・・ 44 第

項 プラミペキソールおよびタリペキソールによるオレキシン

陽性細胞の減尐・・・・・・・・・・・・・・・・・・・48 第

項 ロピニロールによるオレキシン減尐の可逆性・・・・・・ 50 第

項 ロピニロールによるオレキシン減尐におけるドパミン

受容体の関与・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 52 第

項 ロピニロールによるオレキシン減尐における

受容体の

関与・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 54

第

項

受容体刺激によるオレキシン減尐の改善・・・・・ 58

第

節 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 62

第

解析・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 68 第

節 背景・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 68

第

節 実験成績・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 71

第

項

処置によるオレキシン陽性細胞の減尐・・・・ 71

第

項

処置によるオレキシン陽性細胞の減尐・・・・75

第

項 小胞体ストレスの

陽性細胞への影響・・・・・・・・78

第

項 小胞体ストレスによるオレキシンの枯渇・・・・・・・80

第

項 小胞体ストレスのプレプロオレキシン

発現量へ の影響・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・83 第

項 翻訳抑制によるオレキシンの枯渇・・・・・・・・・・85 第

項 オレキシンの枯渇におけるプロテアソームの関与・・・89 第

項 小胞体ストレスによるオレキシンニューロンの細胞死

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・91

第

項 小胞体ストレスによるオレキシンニューロンおよび

ニュ

ーロンにおけるリン酸化

の発現変化・・・・・・94

第

項 小胞体ストレスによるオレキシンニューロンおよび

ニュ

ーロンにおける

の発現変化・・・・・・・・・・97 第

項 小胞体ストレスによるオレキシンニューロンおよび

ニュ

ーロンにおける

の発現変化・・・・・・・・・・・99 第

項 小胞体ストレスによるオレキシンニューロンおよび

ニュ

ーロンにおける

の発現変化・・・・・・・・・・102 第

項 小胞体ストレスの抑制によるオレキシン枯渇の改善および

CHOP

発現の減尐・・・・・・・・・・・・・・・・・105 第

項 種々の刺激によるオレキシンニューロンにおける小胞体

ストレスの誘導・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 108 第

節 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 113

第

章 総括・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 121

参考文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 125

1

第

章 緒論

ナルコレプシーは, 睡眠と覚醒の調節異常, 日中の過剰な眠気や情動脱力発 作（カタプレキシー）を主徴とする中枢性の神経疾患である

欧米では約

2,000

人に

人, 日本においては約

人に

人が罹患していると言われてお

り, 日本での罹患率は他の国々と比較して高いことが知られている

ナルコ レプシーには, ヒト白血球抗原(HLA)の特異的なハプロタイプとの連関が認め られているが, このような

ハプロタイプとの連関はⅠ型糖尿病や多発性硬 化症などの自己免疫疾患でも観察されている

また, 免疫応答において中心 的な役割を担う

細胞の受容体の遺伝子多型との強い連関も報告されており, これらのことからナルコレプシーの発症への遺伝的要因および自己免疫応答の 関与が示唆されている

しかし, 疾患発症に至る機序とこれら要因との関係 については未だ明らかではない.

近年の様々な知見により, 視床下部で産生されるニューロペプチドであるオ

レキシンがナルコレプシーの病態に深く関与していることが明らかとなってき

た

オレキシン-A およびオレキシン-B （別名ヒポクレチン-1 およびヒポクレチ

ン-2）は, 視床下部の外側野および脳弓周囲領域に局在する特定のニューロンに

おいて, 共通の前駆体であるプレプロオレキシンから生成される

オレキシ

ンニューロンは, 中枢神経系の広範囲に投射しており, オレキシンは脳内に広

く分布しているオレキシン受容体（OX

受容体）に作用することで覚醒状

態の維持, 摂食行動の促進, エネルギー恒常性の調節など生体内において重要

な生理機能を担っている

また, オレキシンニューロンは視床下部, 大脳皮

質, 辺縁系など, 様々な脳部位から多種類のニューロンの投射を受けており, そ

2

の神経活動は厳密に制御されている

オレキシンは視床下部の摂食中枢に発現しており, 脳室内投与により摂食量 を増加させる作用があることから, 発見当初は摂食行動を制御するニューロペ プチドとして注目されていた

しかしながら, OX

受容体の遺伝子に変異が認 められるイヌにおいて, ナルコレプシー様の症状が観察されることから, ナル コレプシーの病理形成におけるオレキシンの関与が新たに注目されることとな った

また, オレキシン欠損マウスやオレキシンニューロンを変性・脱落させ たマウスにおいても, ナルコレプシー様の兆候が現れることが報告されている

18, 19.

実際, ナルコレプシー患者の視床下部では, オレキシンニューロンの顕著

な減尐が認められ, その一方で同じ領域に局在しているメラニン凝集ホルモン

いない

また, ナルコレプシー患者では, 脳脊髄液中のオレキシン濃度も顕

著に低下している

これらの知見より, オレキシンニューロンの選択的な減尐 がナルコレプシーの病理形成に関与していることは明らかであるが, なぜオレ キシンニューロンの選択的な減尐が生じるのかについて, その詳細な原因や機 序はほとんど解明されていない.

これまでに培養視床下部組織切片を用いた研究により,

(NMDA)あるいは NMDA

受容体の内因性アゴニストであるキノリン酸を処置

することにより, 切片中のオレキシン陽性細胞の選択的変性が惹起されること

が明らかとなっている

これらの知見を基に, 培養視床下部切片を用いてオレ

キシンニューロンが選択的に減尐する条件をさらに探索した結果, ニューロン

の脱分極を引き起こすような興奮性刺激を持続的に与えると, 切片中のオレキ

シン陽性細胞数が選択的に減尐するという結果が得られた

このことから, オ

3

レキシンニューロンは神経活動の変化による影響を受けやすい細胞であると考 えられた.

オレキシンニューロンの神経活動の変動や種々の刺激に対する感受性につい

て明らかにするために, 本研究ではまず, 神経活動の持続的な阻害によるオレ

キシンニューロンへの影響を検討した. 続いて, パーキンソン病治療薬として

服用されている非麦角系ドパミン

受容体アゴニストがオレキシンニューロン

に与える影響について検討した. さらに, 生体内で起こりうる細胞へのストレ

スとして小胞体ストレスに注目し, オレキシンニューロンの小胞体ストレスに

対する感受性を検討した. これらの検討によって得られた結果に基づき

種々

の刺激に対するオレキシンニューロンの感受性およびオレキシン発現の変動に

ついて, 以下に論じる.

4

A

B

Fig.1. Relationships of narcolepsy and orexin. (A) Orexin is produced in the hypothalamus, and plays a key role in maintenance of arousal state,

acceleration of food intake and regulation of enegy homeostasis. In narcoleptic patients, selective and significant decrease of orexin neurons is found in the hypothalamus. (B) Orexin -A and -B are produced from a common precursor, prepro-orexin. Orexin-A contains two pairs of disulfide bonds.

5

第1章 実験の部

第

節 実験材料

第1項 実験動物

本研究では視床下部組織切片を作製するために, 7-8日齢のWistar/STラット(日 本エスエルシー)を使用した.

第2項 試薬

Tetrodotoxin, Magnesium chloride solution, Glutamine, L-Glutamic acid monosodium salt,Cycloheximide, Colchicine, Yohimbine, Glucose (以上 Nacalai Tesque), NNC 55-0396, Tunicamycin, MG132, NBQX disodium salt

DL-2-Amino-5-phoshonopentanoic acid (AP-5), (+)-MK-801 hydrogen maleate, Forskolin, Sulpiride, Picrotoxin (以上 Sigma-Aldrich Chemicals),

-Conotoxin MⅦC (Peptide Institute), NMDA , Amlodipine besilate, Pindolol (以上Wako), 8-Bromo-cAMP sodium salt, (S)-WAY 100135 dihydrochloride (Tocris), Ropinirole (LKT Laboratories Inc.), Thapsigargin (Santa Cruz Biothechnology, Inc.), Tauroursodeoxycholic acid (Calbiochem), NOC18 , S-Nitrosoglutathione (以上 Dojindo), Cytochalasin B (Enzo), Horse serum, Earle’s minimum essential medium, Hanks’ balanced salt solution, Penicillin G potassium/ streptomycin sulfate (以上 Gibco), Normal donkey serum (Chemicon), TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver.3.0 (TaKaRa).

6

第3項 抗体

本研究に使用した抗体を以下に示す.

(1) 1

次抗体

Antibody name Company

Goat polyclonal anti-orexin A (C-19) antibody

Santa Cruz Biotech, Inc.

Goat polyclonal anti-orexin B (C-19) antibody

Santa Cruz Biotech, Inc.

Rabbit MCH antiserum Phoenix

Pharmaceuticals, Inc.

Goat polyclonal pro-MCH(C-20) antibody

Santa Cruz Biotech, Inc.

Goat polyclonal antibody to rat CGRP Acris Antibodies

Rabbit p-PERK (Thr 981) Antibody Santa Cruz Biotech, Inc.

Rabbit anti-GADD153(F-168) antibody Santa Cruz Biotech, Inc.

Mouse anti-ATF-6 monoclonal antibody

IMGENEX Mouse KDEL monoclonal antibody Stressgen Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Anti-c-Fos (Ab-2) (4-17) Rabbit pAb Calbiochem Mouse anti-NeuN monoclonal antibody Millipore

(2) 2

次抗体

Antibody name Company

Alexa Fluor 488-labeled donkey polyclonal anti-goat IgG antibody

Invitrogen Alexa Fluor 594-labeled donkey

polyclonal anti-rabbit IgG antibody

Invitrogen Axexa Fluor 594-labeled donkey

polyclonal anti-mouse IgG antibody

Invitrogen

7

第4項 オリゴヌクレオチド

オリゴヌクレオチドは, ジーンネット社に合成を依頼した. 本研究に際し, 使用 したオリゴヌクレオチドの配列 (5’ → 3’) を以下に示す.

Preproorexin FW CGGATTGCCTCTCCCTGAGC

Preproorexin RV CTAAAGCGGTGGCGGTTGC

GAPDH FW GCCAAGGTCATCCATGACAAC

GAPDH RV AGTGTAGCCCAGGATGCCCTT

8

第

節 実験方法

第

項 視床下部組織切片の作製および培養

7

から

日齢の

ラットより視床下部切片を作製した. ラットにジエ

チルエーテルで十分に麻酔をかけ, 断頭し, 新鮮な脳を摘出した. 摘出した脳は あらかじめ冷やしておいたハンクス液に入れた. 脳をハンクス液から取り出し, 滅菌済みのフェザーカミソリで半球に切断した. 脳半球の切断面を下にし, ス パーテルですくって

の台の上に置き, 300 m の厚さでカットし た. 脳組織を培地に移し, ヘラを用いて, 実体顕微鏡下で外側部および脳弓周囲 領域を含む視床下部の連続切片を, 各半球につき

枚単離した.

上記の方法にて作製した視床下部切片を多孔質膜 (Millicell-CM, Millipore) 上に静置した. 多孔質膜を保持する

プレート (Costar) の各ウェルには

の培地を供給し, 切片を気液界面に維持した. 培養は 34 ℃, 5 % CO

条 件下で

日間行った. 培地交換は

日ごとに週に

回行った.

視床下部切片の作製に用いる器具類には

照射あるいは乾熱滅菌を施し, 操 作はすべてクリーンベンチにて無菌的に行った.

培地は

あたり

9

第2項 薬物処置

培養

日目に薬物処置を行った. 薬物を溶解した新しい培地

を入れた

6-well

プレートを準備し, 切片を静置した多孔質膜を移し替えることによって

薬物処置を開始した. その後, 切片を薬物含有培地中, 34 ℃, 5 % CO

条件下で 各々の時間培養した.

第3項 免疫組織化学染色および細胞数の計数

薬物処置後, 多孔質膜を

の入った 6-well プレートに 移し, 視床下部切片を

℃で

時間固定した. 固定後, 視床下部切片を振盪機で 軽く揺らしながら

リキッドブロッカーを施した 6-well プ レートに切片を移し, 抗体希釈液で希釈した

次抗体を

時間反応 させた. 反応後, 視床下部切片を上記の方法で洗浄し, 各

次抗体に対応する蛍 光標識

次抗体を遮光しながら室温で

時間反応させた. 2 次抗体反応後, 再び 切片を洗浄し, 70 %, 90 %, 100 % エタノールで脱水を行った後, スライドグラ スにグリセリンでマウントした.

蛍光顕微鏡下での観察により, 各半球から得られた

枚の切片中, それぞれの 免疫反応陽性細胞が多く存在する

枚の切片を選び, 単位面積 (420 × 640 m

あたりの陽性細胞数を計数した. また, 蛍光二重染色を行った切片については, 共焦点レーザー顕微鏡下でマージを確認した後, 計数した.

なお, 各抗体の希釈液および希釈倍率は下記に示す通りである.

10

抗体希釈液

3 % Normal donkey serum 0.3 % Triton-X 100

0.02 % NaN3

in PBS

(1) 1

次抗体

Antibody Dilution

Anti-orexin-A 1:150

Anti-orexin-B 1:200

Anti-MCH 1:500

Anti-pro-MCH 1:250

Anti-CGRP 1:400

Anti-p-PERK 1:50

Anti-GADD153

(for detection of CHOP)

1:250

Anti-ATF6 1:100

Anti-KDEL (for detection of Bip)

1:400 Anti-cleaved caspase-3 1:100

Anti-c-Fos 1:400

Anti-NeuN 1:250

11

(2) 2

次抗体

Antibody Dilution

Alexa Fluor 488-labeled donkey polyclonal anti-goat IgG antibody

1:200 Alexa Fluor 594-labeled donkey polyclonal

anti-rabbit IgG antibody

1:500 Alexa Fluor 594-labeled donkey polyclonal

anti-mouse IgG antibody

1:400

12

第4項 RT-PCR法

1) RNA

の単離, 定量

視床下部切片を回収したエッペン管に

を加え, 氷上でホモジナイズ することにより組織を完全に溶解した. Trizol の

分の

量のクロロホルム を加え, 12,000 rpm, 4 ℃, 15 分の条件で遠心分離を行った. 遠心分離後, 上 層を単離し, イソプロパノールを加えて

を沈下させた. 12,000 rpm,

4 ℃, 10

分の条件で遠心分離を行い, 遠心後, 上清を除去した. エッペン管の

底に蓄積した白い沈殿物に

エタノールを加え, 10,000 rpm, 4 ℃, 5 分 の条件で遠心分離を行い, 沈殿物を洗浄した. 遠心後, 70 % エタノールを除 去し, 沈殿物を

水で溶かした. この

溶液

を

水 99 l で希釈し, 吸光度計にて

濃度を測定した.

RNA

の単離に用いたクロロホルム, イソプロパノール, 70 % エタノール,

水にはあらかじめオートクレーブを施した.

2)

逆転写反応 (RT : reverse transcription)

濃度を揃えた

溶液

を

用

に入れ, 次頁に示す反

応液と十分に混合した. RT は

分 → 99 ℃, 5 分 → 5 ℃, 5 分 → 4 ℃

で

サイクル行った.

13

RT

反応液

MgCl2 2μl

RNase free dH2O 3.75 l

10×RT buffer 1 l

Oligo dT adaptor primer 0.5 l

dNTP mixture 1 l

RNase inhibitor 0.25 l

AMV reverse transcriptase 0.5 l

3)

ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR: polymerase chain reaction)

逆転写反応を行ったサンプル溶液

を

用

に入れ, 次頁 に示す反応液と十分に混合した. プレプロオレキシンの

は 94 ℃, 1 分

→ 94 ℃, 30

秒 → 60 ℃, 30 秒 → 72 ℃, 1 分

秒で

サイクル行った.

GAPDH

の

は上記と同じ温度, 時間で

サイクル行った.

PCR

反応液

14

4)

アガロース電気泳動

三角フラスコにアガロースを入れ, 1×TAE を加えて

アガロース溶 液とし, 電子レンジで十分に溶解させた. アガロース溶液に

bromide (10 mg/ml)を加えてよく攪拌した後,

ゲル作成用プレートに流し込

み, コームを差し込んだ. 約

分後, ゲルが固まったのを確認し, コームを 静かに抜いて, 1×TAE を入れた泳動装置にセットした. PCR を行ったサンプ ル溶液

を

と十分に混合し, ゲルにアプライし,

100 V

で泳動を行った. 泳動後, ゲルを観察台に乗せ, UV 照射を行いサンプ

ルのバンドを観察した.

第5項 統計

データは全て平均値±標準誤差で表した. 統計処理は一元配置分散分析およ

び

を用いて行い, 危険率が

学的に有意な差があると判断した.

15

第

章 神経活動に依存した視床下部オレキシンニューロンの機能 維持

第

節 背景

睡眠と覚醒の破綻をきたす神経疾患であるナルコレプシーの病態形成にオレ キシンニューロンの選択的な減尐が深く関与していることが示唆されているが, その原因および機序はほとんど明らかにされていない

視床下部の特定の領 域に局在するオレキシンニューロンは, 脳の様々な領域に局在する多種類のニ ューロンからの投射を受け, その神経活動は厳密にコントロールされている

また, オレキシンニューロンは静止膜電位が浅く, 平常時においても活動電位 の自発的発射を繰り返しているとの報告もあり, 視床下部に局在する他のニュ ーロンとは異なる性質を持っていると考えられる

そこで, オレキシンニュー ロンと視床下部に局在する他のニューロンとの性質の違いを明らかにするため, 培養視床下部組織切片を用いて, オレキシンニューロンが選択的に減尐する条 件および機序を検討した.

これまでの研究により,

であるキノリン酸を視床下部組織切片に処置すると

切片中のオレキシン陽性

細胞が変性・脱落すること, およびこの脱落が近傍に局在しているMCH陽性細

胞よりも顕著であることが明らかとなっている

その知見を受けて

培養視床

下部切片を用いてオレキシンニューロンが選択的に減尐する条件をさらに探索

した結果

高濃度のカリウムイオンやナトリウムチャネルの活性化薬というよ

16

うなニューロンの脱分極を引き起こす過剰な興奮性刺激を持続的に与えると, 切片中のオレキシン陽性細胞数が選択的に減尐するという結果が得られた

こ れらの結果より, オレキシンニューロンは視床下部に局在する他のニューロン よりも神経活動の変化による影響を受けやすい細胞であると考えられた.

そこで本研究では, 神経活動の持続的な遮断によるオレキシン陽性細胞への

影響, ならびにその機序について検討を行った.

17

第2節 実験成績

第

項

および

によるオレキシン陽性細胞の減尐

神経活動の遮断によるオレキシン陽性細胞への影響を検討するために, まず, 電位依存性

チャネルを遮断し, 活動電位の発生を抑制することでニューロ ンの興奮性活動を強く阻害する

TTX (300 nM)

を

時間処置することにより, 切片中のオレキシン-A 陽性細胞

の顕著な減尐が認められた(Fig. 2A). その一方で, 同じ切片中に存在する

陽性細胞数の減尐はほとんど観察されなかった(Fig. 2A). 切片中のオレキシン

陽性細胞および

陽性細胞を計数した結果, TTX (30, 100 および

時間処置により, いずれの処置濃度においてもオレキシン-A 陽性細胞 数は有意に減尐したが, MCH 陽性細胞数の有意な減尐はみられなかった(Fig.

2B).

さらに, TTX によるオレキシン-A 陽性細胞数の時間依存的な変動を確かめ

たところ, TTX (300 nM)の

時間処置より細胞数は有意に減尐し, 12 時間処置 まで時間依存的に減尐した(Fig. 2C). その後, 24 時間から

時間処置まではオ レキシン-A 陽性細胞数の減尐の程度はほぼ一定であった(Fig. 2D).

細胞外液中に含まれている

もまた, 高濃度で神経活動を阻害すること

が知られている

そこで, 高濃度の

の

時間処置によるオレ

キシン-A 陽性細胞および

陽性細胞への影響を検討した. その結果, TTX

を処置した場合と同様に, オレキシン-A 陽性細胞は顕著に減尐し, MCH 陽性細

胞の減尐はほとんど観察されなかった(Fig. 2A). 細胞数を計数した結果, Mg

18

(10 mM)の72

時間処置により, オレキシン-A 陽性細胞は有意に減尐し, MCH 陽

性細胞数の有意な変化はみられなかった(Fig. 2A, B). さらに, Mg

処置による オレキシン-A 陽性細胞数の時間依存的な変動を確かめたところ, TTX の結果と 同様, Mg

の

時間処置より細胞数の有意な減尐がみられ, 12 時間処置まで細胞 数は時間依存的に減尐した(Fig. 2E). 24 時間から

時間処置においては細胞数 の減尐はほぼ同程度であった(Fig. 2F).

これらの結果より, 同じ視床下部切片内に存在しているオレキシン陽性細胞

と

陽性細胞とでは, 神経活動の遮断に対する感受性が大きく異なること

が示された.

19

B

C D

A

20

E F

Fig.2. Selective decrease of orexin-immunoreactive cells by TTX and Mg²⁺. (A) Representative photographs of orexin and MCH-immunoreactive neurons in

hypothalamic slice culture. TTX or MgCl2 was applied to hypothalamic slice cultures, and then, slices were maintained in medium containing drugs for 72 h. Scale bar = 50

m. (B) Quantitative results on the number of orexin-immunoreactive cells and MCH-immunoreactive cells. Each slice was treated with TTX (30, 100, 300 nM) or Mg²⁺ (10 mM) for 72 h. n = 12–18 for each condition from five independent sets of experiments. **P < 0.01, ***P < 0.001 vs.control (Cont). (C)(D) TTX (300 nM) was applied for indicated periods, and then the number of orexin-immunoreactive cells and MCH- immunoreactive cells was counted. n = 9–12 for each condition from three independent sets of experiments. ***P < 0.001 vs.control (Cont). (E) (F) Mg²⁺ (10 mM) was applied for indicated periods. The number of orexin-immunoreactive cells and MCH- immunoreactive cells was counted. n = 9–12 for each condition from three independent sets of experiments. **P < 0.01, ***P < 0.001 vs.control (Cont).

21

第

項

および

の

陽性細胞への影響

第

項の結果より, オレキシンニューロンと

ニューロンとでは, TTX お よび

に対する感受性が違うことが示されたので, 視床下部切片中に存在 するオレキシン, MCH 以外のニューロペプチド含有ニューロンについても感受 性の違いが認められるかについて検討した. オレキシンニューロンが局在する 視床下部の外側部では, カルシトニン遺伝子関連ペプチド(calcitonin

gene-related peptide; CGRP),

コルチコトロピン放出因子

(corticotropin-releasing factor; CRF),

ニューロテンシンといった他の種類の ニューロペプチドを含有するニューロンが存在することが確認されている

そこで, 本研究の条件下で培養した視床下部切片中にも, これらのニューロペ プチド含有ニューロンが存在しているか検討した. 抗

抗体を用いた免疫 組織化学的検討により, CGRP 免疫反応陽性細胞が視床下部切片内に存在する ことが確認された. 一方で, CRF やニューロテンシンに対する免疫組織化学的 検討も行ったが, これらのニューロペプチドについては免疫反応陽性細胞をほ とんど確認できなかった. そこで, CGRP 陽性細胞に対する

および

処置の影響を検討した. TTX (300 nM) の

時間処置を行った場合においては,

陽性細胞数の減尐が認められたが, Mg

時間処置は

陽性細胞数にほとんど影響を及ぼさなかった (Fig. 3A, B).

これらの結果より, オレキシンニューロンと他のニューロペプチド含有ニュ

ーロンとでは, 神経活動の遮断に対する感受性が異なり, オレキシンニューロ

ンは他のニューロンよりも神経活動の遮断による影響を受けやすいということ

が示唆された.

22

A

B

Fig.3. Effect of TTX and Mg²⁺ on CGRP neurons. (A) Representative

photographs of CGRP-immunoreactive neurons in hypothalamic slice culture.

TTX and Mg²⁺ was applied for 72 h. Scale bar = 50 m. (B) Quantitative results on the number of CGRP-immunoreactive cells. n = 9–12 for each condition from three independent sets of experiments. **P < 0.01 vs. control.

23

第

項

および

によるオレキシン減尐の可逆性

パーキンソン病やアルツハイマー病など多くの神経変性疾患では, 特定のニ ューロン集団において顕著な細胞死が認められる

第

項の実験より, TTX お よび

がオレキシン-A 陽性細胞を著明に減尐させるという結果が得られた ので, この細胞数の減尐が細胞死の惹起によるものであるか否かについて検討 した. 細胞死の有無を確かめるために, 死細胞内に浸透して蛍光を発する

propidium iodide (PI; 5 g/ml)

を

および

と共に

時間, 培地に添加した. その結果, TTX を処置した切片では, オレキシンの顕 著な減尐がみられたものの, PI 蛍光を呈する細胞はほとんど観察されなかった

(Fig. 4A). Mg²⁺

処置を行った切片については, PI 陽性細胞が散在的に観察され

たが, オレキシン-A 陽性細胞の減尐に比べてその数は尐なく, またオレキシン 免疫反応と

蛍光の両方を呈する細胞は観察されなかった(Fig. 4A).これらの 結果より, TTX および

によるオレキシン陽性細胞の減尐は細胞死の誘導 によるものではないことが示唆された.

本検討において用いた濃度の

および

では, 視床下部切片中におけ

る細胞死の誘導はほとんど見られなかったことから, オレキシン-A 陽性細胞の

減尐が可逆的なものであるか否かを検討した. TTX (30, 100 および

あ

るいは

を

時間処置し, その後, 薬物を含有しない培地に切片

を移して

時間のポストインキュベーションを行った. その結果, TTX および

によるオレキシン-A 陽性細胞数の減尐は, 72 時間のポストインキュベー

ションにより著明に回復した(Fig. 4B, C).

24

これらの結果より, TTX および

によるオレキシン陽性細胞の減尐は, オ

レキシンニューロンの不可逆的な変性・脱落によるのではなく, ニューロン内に

貯蔵されているオレキシンの可逆的な枯渇によるものであると考えられた.

25

A

B

C

Fig.4. Reversible decrease of orexin-immunoreactive cells by TTX and Mg²⁺. (A) Propidium iodide (PI), a marker of dead cells, was applied to medium with TTX or Mg²⁺. PI-positive cells (in red) were not observed in TTX-treated slices. PI fluorescence was observed in several scattered cells in Mg²⁺ treated slices, but was never merged with orexin immunoreactivity (in green). Scale bar = 50 m. (B) Representative photographs of orexin-A-immunoreactive neurons in hypothalamic slice culture. After 72 h treatment of TTX or Mg²⁺, slices were maintained in normal medium for additional 72 h (72 hr Post). (C) Quantitative results on the number of orexin immunoreactive cells after 72 h post-incubation. n = 12–15 for each condition from three independent sets of experiments.

26

第

項

および

によるプレプロオレキシン

発現

量の変化

生体内に存在するニューロペプチドは長鎖の前駆体ペプチドとして合成され,

その後, 特定の酵素による切断を受けて生理活性を持つ成熟型ニューロペプチ

ドとなる

オレキシンの場合, 共通の前駆体ペプチドであるプレプロオレキシ

ンからオレキシン-A およびオレキシン-B が生成することが知られている

第

項の結果より, TTX および

は細胞死やニューロンの脱落を

伴わずに, オレキシンペプチド量を減尐させることが示されたので, この減尐

が

レベルでの発現量の変化によるものであるかを調べるため, TTX およ

び

を処置した場合のプレプロオレキシン

発現レベルに対する影響

を

法にて検討した. その結果, TTX (300 nM) あるいは

の

時間処置により, 視床下部切片におけるプレプロオレキシンの

発

現量は減尐していた (Fig. 5). したがって, 神経活動の持続的な遮断によりオレ

キシンの発現が転写レベルで抑制されることが示唆された.

27

Fig.5. Decrease of prepro-orexin (PPO) mRNA by TTX and Mg²⁺. After 72 h treatment of TTX (300 nM) and Mg²⁺ (10 mM), PPO mRNA in hypothalamic slice cultures was detected by RT-PCR. Expression level of PPO mRNA was significantly decreased by 72 h treatment of TTX and Mg^2+.n = 4 for each condition from two independent sets of experiments. ***P < 0.001 vs. control.

28

第

項

流入阻害によるオレキシン陽性細胞の減尐

ニューロンが適切に神経活動を維持するためには, 細胞外からの

の流 入が重要である. Ca

は様々なシグナルを介して, 神経伝達物質の生合成, 輸 送, 遊離などに大きく関与する

このような細胞外の

は, 主として

チャネルを介して細胞内へと流入する. 脳内に存在する電位依存性

チャ ネルは大きく T 型, L 型, N 型, P/Q 型に分類され, これらのチャネルは活性化／

不活性化の特性やニューロンにおける局在および生理的役割が異なっている

型は主に細胞体に局在しており, L 型は主に細胞体および樹状突起に局在して いる. そして

型および

型は主に神経終末に局在しており, 神経伝達物質 の遊離に関与している

そこで, これらのサブタイプに選択的な遮断薬を用い て, Ca

の流入阻害がオレキシンニューロンに及ぼす影響について検討した. T 型

チャネルの遮断薬である

および

型, P/Q 型の 遮断薬である-conotoxin MⅦC (2 M) を

時間処置することにより, オレキ シン-A 陽性細胞の顕著な減尐がみられた(Fig. 6A, B). 一方で, これらの

チ ャネル遮断薬処置による

陽性細胞の減尐はほとんどみられなかった(Fig.

6A, B). L

型

チャネルの遮断薬であるアムロジピン (10 M) の

時間処 置は, オレキシン-A 陽性細胞, MCH 陽性細胞ともに細胞数にほとんど影響を与 えなかった (Fig. 6A, B).

これらの結果より, T 型, N 型, P/Q 型の電位依存性

チャネルを介した細胞

外からの

の流入がオレキシンの発現維持に重要であることが示唆された.

29

A B

Fig.6. Selective decrease of orexin-immunoreactive cells by Ca²⁺ channel blockers.

(A) Representative photographs of orexin-A-immunoreactive neurons in

hypothalamic slice culture. Ca²⁺ channel blockers were applied to hypothalamic slice cultures for 72 h. NNC 55-0396 (NNC), a T-type blocker (50 M) and

-conotoxin MⅦC(-con), an N- and P/Q -type blocker (2 M), induced a

significant decrease of orexin-immunoreactive cells. Amlodipine (Aml), an L-type blocker (10 M), had no effect. Scale bar = 50 m. (B) Quantitative results on the number of orexin-immunoreactive cells and MCH-immunoreactive cells. n = 12–15 for each condition from three independent sets of experiments. ***P < 0.001 vs. control (Cont).