破骨細胞の形成と活性に及ぼすTransforming growth factor-β₁の影響について

!業式

5

お 文 内 容 '.t， elll ヒこ， :;:;:tご Eヨ 題 目 : 破 骨 細 胞 の 形 成 と 活 性 に 及 ぼ す

T

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-

s 1の 影 響 に つ い て 著 者 : 上 ! 日j 究 内容要旨〈和文約 1

，

500字〉

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-

B

l

(以下

T

G

F

-

B

l

と 略 記 す る ) は 、 各 極 細 胞 の 分 化 、 増 殖 を 訓 節 す る 多 機 能 な 性 格 を 備 え た サ イ ト カ イ ン で あ る 。 し か し 、 政 ' 月 ' 細 胞 の 分 化 、 形 成 に対するこのサイトカインの役 ~:Il はいまだにゆj らかに;なっていない。 そこで、

T

G

F

-

s

l

の 破 ' 自 ' 細 胞 に よ る 骨 吸 収 に 対 す る 影 響 を 調 べ る た め 、 新 生 マ ウ ス 長 管 骨より採取した 'I~・組織中の全ての細胞(以下、 全日íj 骨組DJl包と略記する)を象牙片上で培 号室した。

T

G

F

-

B

l

は

0

.

0

4

-

5

n

g

/

m

l

のり足度で、 i政骨細胞による'自'吸収を

m

J

n~ 1Jすることがわかっ た 。 電 子 顕 微 鏡 に よ る 観 察 で は 、 ミ ト コ ン ド リ ア が 減 少 し 、 液 状 縁 、 明fifの 形 成 が 弱 い こ と か ら も 破 骨 細 胞 の 骨 吸 収 活 性 の 低 下 が 示 唆 さ れ た 。 全 骨 細 胞 を 用 い た 破 骨 細 胞 形 成 系 で は 、

I

O

-

8

M

の1， :~5-dihydroxyyitamin

0

3 [以下、1.

2

5

-

(011)

2

0

3

と 略 記 す る ! と と も に

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G

F

-

B

l

を 添 加 す る と

0

.

2

-

1 n

g

/

m

l

の

i

震 度 で 破 骨 細 胞 形 成 を 促 進 す る こ と が わ か っ た 。 次 に 破 骨 細 胞 の 形 成 過 程 に 兵 極 細 胞 の 混 入 を 除 い た 血 液 芽 球 細 胞 か ら の 破 骨 細 胞 形 成 系 を 用 い て

T

G

F

-

s

l

の!政

'

i

?

細 胞 形 成 に 対 す る 直 接 作f日について 検 討 し た 。 意 外 な こ と に

T

G

F

-

B

l

は、

0

.

2

n

g

/

m

l

よ り 高 彼 度 の 慨 に お い て 破 骨 刺 JJ包形成を

m

J

n

n

l

した。 近 年、破 骨 細 胞 の 形 成 に は 、 骨 芽 細 胞 が 関 与 し て い る と 報 告 さ れ て い る 。 そ こ で ' 月 ' 芽 細胞を介した間接的な);，

e

\却を検討するために、'f!J"~:創lI JJ包として什羽 f 細胞版制IJJ胞 MC3T3-El 細 胞 を 用 い 、 こ の 細 胞 を

1n

g

/

m

l

の

T

G

F

-

B

l

で 処 迎 し た 後 に 得 ら れ る 培 務 上 消 、 細 胞 外 基 質 のj主 化 ナ ト リ ウ ム 抽 出 液 を 用 い て 破 骨 細 胞 に 対 す る 影 響 を 検 討 し た と こ ろ 、

1

0

-

B

M

の1，

2

5

-

(011)203共存下で!政骨細胞形成を促進した。

政 ' 骨 細 胞 の 形 成 と 活 性 に 及 ぼ す

T

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n

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0

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n

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s 1

の

影 響 に つ い て 上 岡 寛

E

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s 1

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0

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0

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0

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1

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s

t

η パ u l v A n u m 山 内 A U V 民 ハ 1 n u n_、 U A H U V ﹃ E a 行 H μ 徳 島 大 学 大 学 院 歯 学 研 究 科 歯 科 矯 正 学 講 座 ( 指 導 : 河 田 照 茂 教 授 ) ) ハA u s - a E _{， 、} 内 A U F - a_{、 ，} -E ・、，a n A u v v -v h u ' v l l n A U S L i m e n t v n 、 u ・ 1 l 円 v o l i -t h u -p ' ' L ' ' t L n 、 U E h H U n H u n H H H H u n 、 . u n H v n p h ・b E 比 H H H J H u n u n u r l n u 中 l & ρ L I n u r l a 巾 l i + L n u r i v l ハ U p f l ハ H U l l L ハ U ハ U ド J V I c -n u e_r L n ド i ︽ HU'hHU-It--ρ L n 、 U T I L i -n ¥ U r l n u v n U O L '_rL 門 じ β し V W p t u m 山 4 L ・ l a ρ b ' v L n d n u r a r l n u H H U -t n d A u n H U n μ ・ 内 パ u n F U ， t l I ρ ﹂ γ 1 1 n u n u ρ U → i

L

一

一

-

-

一

一

一

一

一

一

一

」

政 ' 骨 細 胞 の 形 成 と 活 性 に 及 ぼ す

T

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-

B 1

の

影 響 に つ い て 上 岡 寛 i ， t t E _・ 市 L 刊 に d n H H F n A U -t I l γ 1 i n ' L n H u n H U ' f L ρ し ρ し L 4 L n パ u n 、 u a + 1 1 ・ n H v t h u r l A s_f L ハ U r n u H n H v n H U r l ハ_u nku---， . E E E L ・ σ 0 2 u n u v v ・_i ・ -m 川 '_TL V t i n -M n H v n A U ， φ a ' A n 、 u ， n H u n u n u n パ_u n A U V I A 4 3 L n u n u rti--'ii ハ H U ' & l l 、 n A U

s

m

4 6 L r l pL ハ U ρ L P T i p -h t A f l n u n H U n U η A U ・b k A n H v m 山 内 パ U V 民 ハ 1 h H H n 、 u n U V 1 a H H U 徳 島 大 学 大 学 院 歯 学 研 究 科 歯 科 矯 正 学 講 座 ( 指 導 : 河 田 照 茂 教 授 ) v v ・ -ν H H U V l l n A U 3 4 i m e n t u n b ・ l l ・ 1 l a -1 h H ? ? l L s ，_B L n 、 u ' n H u n H U H H u n u n r u b k H U ， パ u n H u n u r l n u 小_l ーn f & m l + し ハ U f l v l -ハ U ハ U l l O ハ U 1 j f l f l n U + L n v i nHU'hHU -p t v q u r l L s L n ¥ . u r l ハ U n H O L 円 ﹁ v n v i v H V F L m L L -e 十 L 2 u n u r -r l n u H H U n d A u n u n H y n A U 円 ﹁ v ρ u r -n u n u n -U 中 l

-破 骨 細 胞 の 形 成 と 活 性 に 及 ぼ す

T

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0

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0

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-

s 1

の

影 響 に つ い て 著 者 : 上 岡 寛 所 属 : 徳 島 大 学 大 学 院 歯 学 研 究 科 歯 科 矯 正 学 講 座 ( 指 導 : 河 田 照 茂 教 授 )

K

e

y W 0

r

d

s

骨 吸 収 、 破 骨 細 胞 、 骨 芽 細 胞 、

TG

F

-

s 1

1

. 原 著

2.

英 文 抄 録 ! 枚 、 本 文

2

7

枚 、 文 献

6

枚、 図 の 説 明

5

枚 、 図

6

枚 、 表

l

枚

3

. 連 絡 先 : 徳 島 大 学 歯 学 部 歯 科 矯 正 学 講 座

Abs

七

rac

七:

The effec

七

s of

七

ransforming growth

factor-

s

1 (TGF-

s

1

)

on bone reso

工p七

ive activities of

osteoclast and different

工

a

七エ

on of preos

七

eoclas

七

s

七

o

os

七

eoclas

七

s were inves

七

19a

七

ed

エ

n v

工

tro using

unfrac

七

ionated bone cells and preos

七

eoclas

七

s derived

from mouse

spleen.

The resul

七

s were summarized as

follows:

1

)

1n the unfrac

七

ionated

bone

cells wh

ェ

ch con

七

ained

os

七

eoclas

七

s

，

preos

七

eocユas

七

s

，

osteoblasts

and

0七

her

bone-derived cells

，

TGF-

s

1 inhibi

七

ed

the bone

resorp

七

ive ac

七lVl七

ies

of os

七

eoclas

七

s. TGF-

s

1 alone

did not increase the os

七

eoclast forma

七工

on

but 1

，

25-dihydroxyvi

七

amin

03

[

ユ

，

25

一

(OH)2

0

3

J

-dependen

七

osteoclas七 formationwas markedly enhanced

by

TGF

一

s

1.

2

)

1n the

clonal

preos

七

eoclasts

，

the forma

七

ion

of

os

七

eoclas

七

-like cells

(七

ar

七

arate-res

工

S

七

an

七

acidic

phosphatase-positive mu

ユ

七

ユ nuclear

cells)

was also

depressed

by

TGF-

s

1

.

On the other hand

，

1

，

25-(OH)

203-S

七

imula

七

ed forma

七工

on

0

f

0

s

七

eoclas

七

-like

cells was further enhanced by

七

he factor(s) presen

七

in the condi

七

ioned medium and 2M NaCl-ex

七

racted

frac

七

ion of TGF-

s

1-treated osteoblas

七

ic MC3T3-E1

cells.

These resul

七

s suggest

七

hat TGF--

s

1 depres ses both

bone resorptive activity of osteoclas

七

and

differentiation of preosteoclas

七 七

o os

七

eoclast bu

七

stimulates os

七

eoclas

七

fo

工

mation

工 口 七

he presence of

緒 言

Transformlng

growth

factor-sl

(以 下

TG

F

-

s 1 と 略 記 す る ) は 、 各 種 細 胞 の 分 化 、 増 殖 を 謂 節 す る 多 様 能 な 性 格 を 備 え た サ イ ト カ イ ン で あ る ( 1. 2) 。 こ の サ イ ト カ イ ン は 、 造 骨 系 細 胞 よ り 潜 在 型

TG

F

-

s 1と し て 形 成 さ れ (3 -5 ) 、 骨 中 に 多 量 に 貯 蔵 さ れ て い る (5. 6) 。 そ し て 、 破 骨 細 胞 の 関 与 で 活 性 型

TG

F

-

s 1と な っ て 遊 離 さ れ 、 骨 代 謝 で 重 要 な 役 割 を 果 た す こ と が 示 唆 さ れ て い る ( 7 ) 9 す な わ ち 、

TG

F

-

s 1は 骨 誘 導 因 子

(bone

mor-phogenetic proteln)

の ー っ と し て 骨 芽 細 胞 の 増 殖 と 分 化 お よ び 骨 萎 質 産 生 を 介 し て 骨 形 成 を 促 進 す る (8 _.1 6 ) 。 し か し 、 こ れ ら

TGF

-slの 骨 形

成 に 対 す る 作 用 の 結 果 は 実 験 条 件 に よ っ て 必 ず し も 一 定 で は な い 。 一 方 、 骨 吸 収 で の 役 割 に つ い て も 数 少 な い な が ら 報 告 さ れ て い る が 、 そ の 結 果 も 一 致 し て い な い 。

I

r

1

j

え ば

Tashjian

ら (1 7) は マ ウ ス 頭 蓋 骨 の 器 官 培 養 で ブ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン を 介 す る

T

G

F

-

T 1の 骨 吸 収 促 進 作 用 を 観 察 し て ) 、 守 1 ' ti ， ， ， f ， ， r ι ， . ‘ 、 、

い る の に j乏 し 、

P

't

eilschi

'tt号[ら (I 8 )は ラ ッ ト 胎 仔 の J音 養 長 管 骨 で は 逆 に 抑 制 作 用 を 示 す と お 告 し て い 79

。

_{こ の よ う に 骨 代 謝 に 対 す る}

_T

_G

_F

_-

_8.I の 作 用 は 用 い た 細 胞 の 種 類 や 起 源 や 分 化 度 あ る い は ( 也 の 細 胞 の 混 在 な ど に よ っ て 大 き く 左 右 さ れ る と 考 え ら れ る 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、

T

G

F

-

'

s

l

の 骨 吸 収 に 及 ぼ す 影 響 を 二 種 類 の 培 養 系 、 す な わ ち 全 骨 細 胞 培 養 系 (1 9 ) と 血 液 系 芽 球 細 胞 か ら の 破 骨 細 胞 形 成 系 (2 0 . ， を 用 い て 検 討 し た c 前 者 の 培 養 系 で は 破 骨 細 胞 を 含 む 細 胞 を 培 養 し 、 骨 吸 収 活 性 お よ び 破 骨 細 胞 形 成 に 対 す る

TG

F

-

s Iの 作 用 を 観 察 し た 。 し か し 、 こ の 培 養 系 で は 、 骨 芽 細 胞 な ど の 間 質 細 胞 が 混 在 し て い る た め 、 こ れ ら の 細 胞 を 介 す る 間 接 作 用 も 考 慮 し な け れ ば な ら な い 。 こ れ に 対 し て 後 者 は 、 未 分 化 な 破 骨 組 尼 の み か ら な る 培 養 系 で ， : 1 吸 収 活 性 に 対 す る 作 用 は 観 察 で き な い が 、 他 の 細 胞 が 介 在 し な い 破 号 細 胞 形 成 に 対 す る 直 接 作 用 を 測 定 し う る 系 で あ る 。 一 方 、

Burger

ら (:2I )、 お よ び

R

_!)

d

_J

n

ら ( 2 2) _I1-_'+_d-、

破 骨 細 胞 形 成 は 骨 芽 細 胞 を 介 し 調 節 さ れ て い る と 認 告 し て い る 。 ま た

H

i

u

r

a

ら (2 3 I は こ の 号 - 芽 細 胞 に よ る 調 節 は 骨 芽 細 胞 が 骨 細 胞 へ と 分 化 す る 過 程 で 変 化 す る と 報 告 し て い る。 こ れ ら の 結 果 か ら

T

G

F

-

s 1が 骨 芽 細 胞 を 介 し て 、 破 骨 細 胞 の 形 成 に 影 響 を 与 え る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 そ こ で 、 骨 芽 細 胞 と し て マ ウ ス 骨 芽 細 胞 様 細 胞 株 MC

3T3-El

(24) を 用 い 、

TGF-sl

で 処 理 し た

MC

3

T

3

-

E

1

細 胞 か ら 産 生 さ れ る 生 理 活 性 物 質 の 破 骨 細 胞 形 成 へ の 作 用 に つ い て も 巴検 討 し た 。 f

(

3 )

材 料 と 方 法

1 ) 試 菜 類

本 研 究 で 使 用 し た 試 薬 の 入 手 先 を ( ) 内 に 示

9 0

日一変法

E

a

g

1

e

最 小 必 須 培 地 ( 以 下 Q -

M

E

M

と 略 記 す る、

Flow Laboratories;Mclean

，

VA

，

U.S.A.

J

、胎

仔 牛 血 清 ( 以 下

FB

S

と 略 記 す る 、

B

i

0 p

r

0

d

u

c

t

lnc;Walkvi

les

，

MD

，

U

.

S

.

A.)、TG

F

-

s 1

(

R

&

0 s

)

.

s

t

e

m

lnc;Mineapol

i

s

，

MN

，

U

.

S

.

A.)

、 酸 性 ヘ マ ト キ Jシ リ ン 溶 j夜

(Sigma Chemic

日

1

C

O. ;

S

t

.

L

0

u

i

s

.

¥

l

O

.

U

S

.

A

.

、)

l

a

.

25-

c1

ihydroxyvitamin

03(以 下 ! .

2

5

-(OH)

2

0

3と 略 記 す る 、 帝 人 生 物 医 学 研 究 所 ; 東 京 )

5

- フ / レ オ ロ ウ ラ シ / レ l以 下

5

-

F

U

と 略 記 す る 、 協 和 醗 醇 ; 東 京 ) 、 牛 血 清 ア / レ ブ ミ ン

(Fraction V

.

S

i

g

m

a

)、 遺 伝 子 組 換 え 型 マ ウ ス イ ン タ ー ロ イ キ ン -

3

(以 下

r

[J1 [

L

-3

と 略 記 す る 、 バ イ オ マ テ リ ア / レ 研 究 所 ; 横 浜 ) 、 遺 伝 子 組 換 え 型 ヒ ト イ ン タ ー ロ イ キ ン -

6

(以 下

rh

[

L

-6

と 略 記 す る 、 味 の

素 ; 川 崎 ) メ チ ル セ ル ロ ー ス

(

Ardrich Chemical

C

o

.

:Mi

IWJukee.

Wl. U

.

S

.

A.)、

造 伝 子 組 換 え 型

マ ウ ス 頼 粒 球 一 マ ク ロ フ ァ ー ジ コ ロ ニ - 刺 激 因 子 ( 以 下

rm

G

M

-

C

S

F

と 略 記 す る 、 住 友 製 薬 ; 大 阪 ) プ ロ ナ ー ゼ

E

( 科 研 製 薬 ; 東 京 )、エ チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸 ナ ト リ ウ ム ( 以 下

E

D

T

A

と 略 記 す る 、 手 口 光 純 薬 ， 大 阪 ) 、

N

-

2

-

h

y

d

r

0 X

y

e

t

h

1

p

i

p

e

r

a

z

i

n

e

-

N

'

-2

-ethnesulfonic acid(以 下

H

E

P

E

S

と 略 記 す る 、 和 光 純 薬 ) 、 グ / レ タ / レ ア / レ デ ヒ ド ( ナ カ ラ イ テ ス ク ; 京 都 ) 、 カ コ ジ jレ 酸 ( ナ カ ラ イ テ ス ク )

2

)

象 牙 片 上 で 培 養 し た 全 骨 細 胞 の 骨 吸 収 活 性 の 測 定 全 骨 細 胞 培 養 は 、

Ta

k

a

d

a

ら の 方 法 (l 9 ) に 従 っ て 行 っ た 。 す な わ ち 、

13

日 齢

IC

R

系 マ ウ ス ( チ ヤ ー / レ ス リ バ ー ジ ャ パ ン 東 京 ) の 大 腿 骨 お よ び 腔 骨 を 無 菌 的 に 取 り 出 し 、 軟 組 織 を 除 去 し た 後 に

5

九(v/v)

FBS

を 含 む

a-

M

E

M

中 で ハ サ ミ を 用 い て 十 分 に 細 切 し た 。 細 切 し た 骨 片 は 電 動 モ ー タ ー を

(

5 )

用 い て 、 携 祥 し 、 骨 片 よ り 破 骨 細 胞 を 含 む 細 胞 を 培 養 液 中 に 遊 底 さ せ た 。 そ の 後 、 約 4分 間 静 置 し 、 骨 片 を 沈 殿 さ せ 、 上 清 を 集 め 、 全 骨 細 胞 浮 遊 液 と し た 。 こ の 採 取 し た 全 骨 細 胞 を 、

5

月(

v

I

v

)

FBS

を 含 む

a

-

M

E

M

で

2

x

1

0

6個

I

m

l

の 細 胞 密 度 に 調 製 し 、 そ の

2

5

0

戸

l

を

9

6

穴 平 底 プ レ ー ト

(Falcon

L

a

b

w

日re;

Oxnard.

C

A

.

U

.

S

.

A

.

)

中 の 象 牙 片 ( 新 日 本 象 牙 ; 東 松 山 ) 上 で 培 養 を 開 始 し た 。

2

時 間 後 に 、 各 濃 度 の

TGF-sl

お よ び

5

児(vlv)

FBS

を 含 む

α-MEM

2

5

0

戸 ￨ に 交 換 し 、

3

7

'c、 5 月 C02 / 95~ö 空気の気 椙 下 で さ ら に

4

日 間 培 養 し た 。 つ い で 、 象 牙 片 上 に 存 在 す る 破 骨 細 胞 に 、

Van d

e

Wijingaert

ら の 方 法 (2 5 ) に 従 い 破 骨 細 胞 の マ ー カ - 染 色 で あ る 酒 石 酸 耐 性 酸 フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ ( 以 下

TRAP

と 略 記 す る ) 染 色 を 行 い 、

3

核 以 上 の

T

R

A

P

陽 性 の 破 骨 細 胞 数 を 顕 微 鏡 下 で 算 定 し た 。 破 骨 細 胞 に よ っ て 形 成 さ れ た 吸 収 富 は 、 細 胞 を ブ ラ シ で 除 去 し た 後 に 、 酸 性 ヘ マ ト キ シ リ ン 溶 液 で 染 色 し た 。 吸 収 窟 の 面 積 は 、 接 眼 レ ン ズ に 組 み 込 ま れ た グ リ ッ ド (基 盤 目 盛 ) よ り 算 定 し た 。

3

) 象 牙 片 上 で の 全 骨 細 胞 か ら の 破 骨 細 胞 形 成 の 測 定 上 記 の よ う に し て 採 取 さ れ た 全 骨 細 胞 を 、

5

Y

j

(vlv)

FBS

を 含 む 日

-MEM

の 中 で

2

x

1

0

5 個

I

m

l

の 細 胞 密 度 に な る よ う に 調 製 し 、 そ の

250

戸￨を

96

穴 プ レ ー ト の 象 牙 片 上 に 播 き 培 養 を 開 始 し た 。

7

日 後 に 、 培 養 開 始 時 に 存 在 し て い た 破 骨 細 胞 が 消 失 し た の を

TR

A

P

染 色 で 確 認 し 、

5

O~ (v

I

v)

F

B

S

と

TGF-sl

を 含 む 培 養 液 に 交 換 し 、

5

日 間 培 養 し た 後 に 、 上 記 と 同 様 な 方 法 で 破 骨 細 胞 数 を 算 定 し J:た。 4) 芽 球 細 胞 の 調 製 芽 球 細 胞 は

Kurlha

r

a

ら の 方 法 (2 0 )に 従 っ て 調 製 し た 。 す な わ ち 、

6

週 齢 雌

B0

F

1マ ウ ス ( チ ャ -jレ ス リ バ ー ジ ャ パ ン ) の 尾 静 脈 に

5-F

U

を 注 射 し 、

S

拐 の 細 胞 に 障 害 を 与 え 牌 践 に お け る 造 血 幹 細 胞 の 占 め る 割 合 を 選 択 的 に 増 大 さ せ た 。

4

日 後 牌 肢 を 無 菌 的 に 摘 出 し 、 こ の 牌 践 よ り 得 た 牌 細

胞 を 、

1.

S

x

1

0

6 個

m

l

の 濃 度 に 調 製 し た 。 こ の 時 用 い た j音 養 液 は 、

3

0

Oo

い

:

'v)

F

B

S

、 l ~~ (w/v) 牛 血 清 ア ル ブ ミ ン 、

50U

/

m

l

rm!L-3、

30

n

g

/

m

l

r

h

[

L

-

6

、 1.

2

月

(w/ v) メ チ / レ セ jレ ロ ー ス を 含 む

a-

M

E

~l で あ 79

。

_{こ の 細 胞 浮 遊 液 を 、}

_35mm

_{径 細 胞 用 ブ ラ} ス チ ッ ク ペ ト リ 皿

(FJlcon

Labware

)

に 掻 き 込 み、

3

7

r

、

5

月

CO2

/

95%

空 気 の 気 相 下 で 培 養 し た 。 培 養

7

日 後 、 形 成 さ れ た 牌 臓 由 来 の 芽 球 コ ロ ニ ー を 顕 微 鏡 下 で 、 マ イ ク ロ ピ ペ ッ ト で 採 取 し 、

5

月(

v

/

v

)

F

B

S

、

10

0

U

/

m

1

r

m

G

M

-

C

S

F

を 含 む

a-

M

E

M

中 に 分 散 し た 。 以 後 こ の 細 胞 を 芽 球 細 胞 と 呼 ぶ 。

5

) 骨 芽 細 胞 の 培 養 骨 芽 細 胞 と し て 骨 芽 細 胞 様 細 胞 株

M

C

3

T

3

-E

1

を

。

細 胞 を 1

0

0

m

m

径 フ ラ ス チ ッ ク ペ 用 い た ( 2 5 ) ト リ 血 中

(Falc

o

n Labware

)

で、

1

0

九(v/v)

FBSを

含 む a-

M

E

~I 中で 3

7

r 、 5 ~~ C02 / 95% 空気の気相下で 培 養 し た 。 そ の 後

3

日 お き に 、

C

a

2ふと

M

g

2← を 除 い た

10m

1

¥

リ ン 該 緩 衝 生 理 食 塩 水 (

p

H

7

.

4

)

に O.

0

0

1

月(w

/ v)プ ロ ナ ー ゼ

E

、

O

.

0

2

児 (w/v)

ED

TA

を 加 え た 溶 液 で

10

分 間 室 温 で 処 理 し て 細 胞 を 分 散 し 、 継 代 培 養 を 行 っ た 。

6

) 培 養 上 清 の 調 製 培 養 上 清 ( 以 下

C

M

と 略 記 す る ) は 以 下 に 述 べ る 方 法 で 調 製 し た 。 す な わ ち 、

10

0

m

m

径 プ ラ ス チ ッ ク ペ ト リ 皿 上 で 密 に 増 殖 し た 単 層 細 胞 (

3

x

1

0

6個 /皿 ) の 培 養 液 (

1

0

児

FB

S

を 含 む

a-MEM)

を

1

n

g /

m

I

T

G

F

-

s 1 を 添 加 し た 新 し い 培 養 液 と 交 換 し 、 さ ら に

24

時 間 培 養 し た 。 そ の 後

a-MEM

で

3

回 洗 浄 し て

TG

F

-

s 1を 除 去 し 、 血 清 を 含 ま な い 日

-MEM

1

0

m

l

を 加 え さ ら に

2

4

時 間 培 養 し た 。 培 養 液 中 の 細 胞 を、

1.000

xg、

5

分 間 遠 心 し て 除 去 し た 上 清 を

C

M

と し た 。

C

M

は 使 用 時 ま で -

8

0

じ で 保 存 し た 。

7

) 細 胞 抽 出 液 の 調 製

(

9

)

細 胞 抽 出 液 は F

u

1 1

e

r

ら の 方 法 (2 6 )に 準 じ て 調 製 し た 。 す な わ ち 、 上 記 の

C

M

を 調 製 し た

MC3T3

-

E

l

細 胞 (

3

x

1

0

6個 /血 ) を 更 に

a

-

M

E

M

で

3

回 洗 浄 し た 後 、 ラ パ ー ポ リ ス マ ン に て 細 胞 を 採 取 し 遠 沈 管 に 回 収 し た 。 こ れ を

10m

M H

E

P

E

S

を 含 ん だ

2m

1

の

2

M

NaCl (

p

H

7.4)

中 に 浮 遊 さ せ 、 室 温 で

30

分 間 放 置 し た 後 、

3.000

x

g

で

5

分 間 遠 心 し て 不 溶 成 分 を 沈 殿 さ せ 上 清 を 回 収 し た 。 こ の 上 清 を 、

S

e

p -p

a

k

C

1

8

ミ ニ カ ラ ム

(Waters;

M

i

1

f

o

r

d

.

M

A

.

U

.

S

.

A

.

)

に 通 し て 脱 塩 し 、

80

児(

v

/

v

) ア セ ト ニ ト リ / レ 溶 出 画 分 を 得 た 。 次 に 、 こ れ を 減 圧 濃 縮 し 、 簡 易 微 量 濃 縮 器 ( セ ン ト リ コ ン

30;Amicon

]apan

C

o

.

.

東 京 ) で 限 外 滋 過 を 行 っ て 得 た 分 子 量

30.000

以 上 の 画 分 を 蒸 留 水 で 再 び

2

m

l

と し 、

N

a

C

1

抽 出 液 の 原 液 と し て 用 い た 。

8

) 芽 球 細 胞 か ら の

TRAP

陽 性 多 核 細 胞 形 成 の 測 定

8

0

0

個 の 芽 球 細 胞 を 含 む 細 胞 浮 遊 液

1

5

0

戸

l

を

96

穴 プ ラ ス チ ッ ク マ イ ク ロ プ レ ー ト

(BloTec;

東京) の 各 穴 に 植 え 込 み 、

3

7

'c、

5

児

C

0

2

/

9

5

児 空 気 の 気 相 下 で

7

日 間 培 養 し た 。 以 後 こ の 時 点 で の 細 胞 を 未 分 化 破 骨 細 胞 と 呼 ぶ こ と に す る 。 こ の 培 養 液 を

5

月

(

v

/

v

)

F

B

S

、

I0

0

U

/

m

1

r

m

G

M

-

C

S

F

、

I

O

-

8

M

1

，

2

5

-(OH) 2 D 3と 被 検 標 品 を 含 む 新 し い 培 養 液 に 交 換 し た 。 さ ら に

3

日 間 培 養 し た 後 、

3

核 以 上 で

TRAP

陽 性 の 多 核 細 胞 数 を 顕 微 鏡 下 で 算 定 し た 。

9

) 透 過 型 電 子 顕 微 鏡 に よ る 破 骨 細 胞 の 観 察 ， 象 牙 片 上 で 全 骨 細 胞 を

4

日 間 培 養 し た 後 、

O

.

I

M

カ コ ジ jレ 酸 緩 衝 液 (p

H 7

.

4

)

で 培 養 細 胞 を 洗 浄 し、

2

.

5

月 グ / レ タ ノ レ ア / レ デ ヒ ド を 含 む

O

.

1

M

カ コ ジ ノ レ 酸 緩 衝 液 で

4

'c、

2

時 間 の 前 固 定 を 行 っ た 。 そ の 後 、 O.

1

M

カ コ ジ jレ 酸 緩 衝 液 で 一 晩 洗 浄 し た 後 、

O

.

1

M

EDTA

で

I5

日 間 脱 灰 を 行 っ た 。 次 い で 、 こ の 細 胞 標 品 を

O

.25M

蕉 糖 を 含 む

O

. 1

M

カ コ ジ / レ 酸 緩 衝 液 で

2

日 間 洗 浄 し た 後 、

2

児 オ ス ミ ウ ム 酸 を 含 む O.

1

M

カ コ ジ / レ 酸 緩 衝 液 で

4

'c、

4

時 間 の 後 、1 3 ノ 1 i -_B ﹄ ム / ， l、 、

固 定 を 行 い 、 通 法 に し た が い ア ル コ ー ル 系 列 に よ る 脱 水 を 行 っ た 。 脱 水 後 、 エ ポ ン 包 埋 し 、 さ ら に 超 薄 切 片 を 作 成 し た 後 、 酢 酸 ウ ラ ニ ー ル ク エ ン 酸 鉛 で

2

重 染 色 を 施 し 透 過 型 電 子 顕 微 鏡 ( 目 立

H8

00;

目 立 製 作 所 . 東 京 ) を 用 い て 観 察 し た 。

1

0

)

統 計 学 的 解 析 法 実 験 デ ー タ の 有 意 、 差 検 定 は 、

Student' s

t-test

に よ り 行 っ た 。 r

一 ロ ポ 結

l

培 養 マ ウ ス 全 骨 細 胞 に 存 在 す る 破 骨 細 胞 へ の

T

G

F

-

s lの 影 響 培 養 マ ウ ス 全 骨 細 胞 に 存 在 す る 破 骨 細 胞 の 骨 吸 収 活 性 に 対 す る

TG

F

-

s lの 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 骨 吸 収 活 性 は 、 象 牙 片 上 で マ ウ ス 全 骨 細 胞 を

4

日 間 培 養 し 、 破 骨 細 胞 に よ っ て 形 成 さ れ る 吸 収 窟 の 面 積 に よ り 評 価 し た 司な お

T

a

k

a

d

a

ら (l 9) は 全 骨 細 胞 を

4

日 間 培 養 し て も 破 骨 細 胞 の 核;rヲブ へ の

5

- ブ ロ モ デ オ キ シ ウ リ ジ ン の 取 り 込 み が み ら れ な い と 報 告 し て い る 。 そ こ で 本 実 験 で は 培 養 マ ウ ス 全 骨 細 胞 に 存 在 す る 破 骨 細 胞 の 影 響 の み を 観 察 す る た め 、 破 骨 細 胞 の 新 生 が み ら れ な い 実 験 条 件 と し て 培 養

4

日 ま で を 選 ん だ 。 JZ 最 初 に 、

TG

F

-

s lの 存 在 下 で の 破 骨 細 胞 数 お よ び 吸 収 寓 の 面 積 の 経 時 変 化 を 検 索 し た 。 破 骨 細 胞 数 は 培 養 4日 間 で は 、 1

n

g i

m

1の

TGF

-

s

l

添 加 群 、 未 処 理 対 照 群 に お い て 、 と も に 減 少 傾 向 が 認 め

(

1

，

3

)

ら れ た も の の 、 両 者 の 間 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た ( 図

1A

)

。 し か し 吸 収 窓 の 形 成 は 、 培 養

3

日 目 よ り

TGF-8l

添 加 群 に お い て 著 明 な 抑 制

l

が 認 め ら れ た ( 図

18

)

。 さ ら に 、 表

l

に 示 す よ う に 吸 収 富 の 形 成 は

TGF-8l

の 濃 度 に 比 例 し て 抑 制 さ れ 、 そ の 抑 制 効 果 は

TGF

-

8

l

O.2ng/ml

よ り 高 濃 度 で 有 意 差 を 認 め た 。 し か し 、 破 骨 細 胞 数 に お い て は 、 ど の 濃 度 で も 有 意 、 差 が 認 め ら れ な か っ た 。 す な わ ち 、

TGF-sl

は 破 骨 細 胞 あ た り の 骨 吸 収 活 性 を 抑 制 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 次 に 、

TGF-8l

に よ る 破 骨 細 胞 の 形 態 的 変 化 を 電 子 顕 微 鏡 レ ベ / レ で 解 析 し た 。 未 処 理 対 照 群 の 破 骨 細 胞 に は 、 象 牙 片 に 面 し て 波 状 縁 が 伸 展 し 、 細 胞 辺 縁 に は 象 牙 片 に 密 着 し た 明 帯 が み ら れ 、 細 胞 内 に は 多 数 の ミ ト コ ン ド リ ア が 存 在 し 細 胞 の 形 態 は 扇 平 で あ っ た ( 図 .

2

A

)

。 し か し 、

T

G

F

-8

l 添 加 群 で は 波 状 縁 は 屈 曲 し 、 明 帯 の 形 成 は 非 常 に 乏 し く 、 ま た 細 胞 の 形 態 は

TGF-sl

添 加 群 で は 丸 み を を 帯 び て い た 。 ま た ミ ト コ ン ド リ ア の 数 お よ び 大 き さ の 減 少 が 認 め ら れ た ( 図

28

)。

こ れ ら の 実 験 結 果 よ り 、

TGF-Pl

は 破 骨 細 胞 の 骨 吸 収 活 性 を 抑 制

l

す る 因 子 で あ る こ と を が 示 唆 さ れ た 。

2

破 骨 細 胞 形 成 に 対 す る

TGF-}3

1の 影 響 象 牙 片 上 で マ ウ ス 全 骨 細 胞 を

5

0_o(v/v)

_FBS

_{の み} を 含 む 日

-

M

E

M

で

7

日 間 培 養 し て 、 全 骨 細 胞 の 培 養 開 始 時 に 存 在 し て い た 破 骨 細 胞 を 消 失 さ せ た 後 、

1.25-

(

O

H

)

2

0

3あ る い は

TG

F

-

s 1を 加 え て

5

日 間 培 養 し て 誘 導 さ れ る 破 骨 細 胞 数 を 算 定 し た 。 図

.3

A

に 示 す よ う に 、

1

.

25-

(

O

H

)

2

0

3は 単 独 で 破 骨 細 胞 形 成 を 促

i

差 し た が 、

TG

F

-

s 1の 単 独 処 理 で は 破 骨 細 胞 の 形 成 は 認 め ら れ な か っ た 。 し か し 、

1

.

2

:

)

-

(OH) 2 0 3と 併 用 す る と

TGF-sl

は

1.25-

(OH) _{2 0 3} の 破 骨 細 胞 形 成 促 進 効 果 を 増 強 し た 。 こ の

TG

F

-J

l

の 増 強 ヌ ) ) 果 は 濃 度 に 依 存 し 、 1

n

g

1

.

m

1で 最 大 と な っ た が 、

5

n

g

"

.

m

[ で は そ の 効 果 が み ら れ な く な っ た ( 図

3

B

)。 こ の 系 に は 未 分 化 政 骨 細 胞 以 外 の 細 胞 も ム 己 JZ

(

1 5

)

れ て い る の で 、

TG

ド-s 1の 効 果 が こ れ ら 共 存 す る 細 胞 を 介 す る 間 接 的 な も の で あ る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 そ こ で

T

G

F

-

s 1の 破 骨 細 胞 形 成 に 対 す る 直 接 作 用 を 検 討 す る た め 、 骨 芽 細 胞 な ど の 異 種 細 胞 を 含 ま な い 未 分 化 破 骨 細 胞 か ら の

TRAP

陽 性 多 核 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 そ の 結 果 、

TG

F

-

s 1は

1.25

-

(OH) 20

3 に よ っ て 誘 導 さ れ る

TR

A

P

陽 性 多 核 細 胞 形 成 を

1

n

g /

m

1

以 上 の 濃 度 で 抑 制 す る こ と が 明 ら か に な っ た ( 図

4

。) そ こ で 次 に 、 全 骨 細 胞 培 養 系 で み ら れ た

1

，

2

5

-(

O

H

)

20

3存 在 下 で の

TGF-sl

の 破 骨 細 胞 形 成 促 進 作 用 に 骨 芽 細 胞 が 関 与 し て い る か 否 か に つ い て 検 討 し た 。 こ の 実 験 で は 、

TG

F

-

s 1で

24

時 間 処 理 し た

MC3T3-E

1

細 胞 か ら

CM

と

2M NaCI

抽 出 液 を 調 製 し た 。 そ の 後 、 未 分 化 破 骨 細 胞 を

1

0

-

8

M 1.25

-

(

O

H

)

20

3存 在 下 で 各 種 濃 度 の

CM

あ る い は

Na

C

I

抽 出 液 を 添 加 し て

T

R

A

P

陽 性 多 核 細 胞 の 形 成 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 こ の

CM

は

81

倍 希 釈 で

T

R

A

P

陽 性 多 核 細 胞 形 成 を 促 進 す る こ と が 明 ら か に な っ た ( 図

5

)。

近 年 の サ イ ト カ イ ン に 関 す る 研 究 結 果 に よ れ ば 、 細 胞 よ り 分 泌 さ れ た 多 く の 生 理 活 性 物 質 は 細 胞 表 面 や 、 細 胞 外 基 質 に 結 合 し て 存 在 し て お り 、 こ れ ら は 高 濃 度 の

N

a

C

1

で 抽 出 さ れ る と 報 告 さ れ て い る (28-30) 。 そ こ で 、

C

M

中 に み ら れ た

T

R

A

P

陽 性 多 核 細 胞 の 形 成 促 進 作 用 を も っ 物 質 は 細 胞 表 面 や 細 胞 外 基 質 か ら 遊 離 し た 可 能 性 が 考 え ら れ る の で

N

a

C

1

抽 出 液 の

TRAP

陽 性 多 核 細 胞 形 成 に お よ ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 そ の 結 果

N

a

C

1

抽 出 液 を

1

，

25-(OH)

2 0 3と 同 時 に 添 加 す る と 、

1

2

5

倍 希 釈 か ら

625

倍 希 釈 に お い て

TR

A

P

陽 性 多 核 細 胞 形 成 を 促 進 す る こ と が 判 明 し た ( 図 .6)。 こ の 促 進 作 用 に は

1

，

25-(OH)

2 0 3 が 必 要 で あ り 、

N

a

C

1

抽 出 液 単 独 で は

TRAP

陽 性 多 核 細 胞 の 形 成 を 促 進 し な か っ た 。

( 1 7 )

考 察 骨 吸 収 に 対 す る

TG

F

-

s 1の 影 響 を 明 ら か に す る た め 、 破 骨 細 胞 の 吸 収 寓 形 成 お よ び 破 骨 細 胞 形 成 に 対 す る

TG

F

-

s 1の 作 用 に つ い て 検 討 し た 。 本 研 究 で は 、 骨 に 存 在 す る 全 て の 細 胞 を 含 む と 考 え ら れ る マ ウ ス 全 骨 細 胞 培 養 系 (1 9 ) の み な ら ず 異 種 細 胞 を 含 ま な い 未 分 化 破 骨 細 胞 の み か ら な る 培 養 系 (2 0 ) を 用 い て 、 破 骨 細 胞 の 機 能 と 形 成 に 対 す る

TG

F

-

s 1の 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 全 骨 細 胞 を 用 い た 系 で は 、 培 養 開 始 時 に 存 在 す る 破 骨 細 胞 の 骨 吸 収 活 性 に 対 し て

TG

F

-

s 1が 及 ぼ す 影 響 を 検 討 す る こ と が で き る 。 因 に 、 骨 吸 収 活 性 を 測 定 す る 感 度 を こ の 全 骨 細 胞 培 養 系 と 従 来 の 骨 の 器 官 培 養 系 と を 比 較 す る と 、 前 者 の

1

，

25-(

O

H

)

2 D 3に よ る 骨 吸 収 促 進 は 対 照 の

4

. 3

倍 ( 1 9 ) で あ る の に 対 し 4 5

C

a

を プ レ ラ ベ ル し た 骨 か ら の 4 5 C

a

放 出 量 を 測 定 し た 後 者 の 器 官 培 養 系 で は 対 照 の

1

.

8

倍 ( 3 1 ) で あ っ た 。 こ の 後 者 の 器 官 培 養 系 で は 、 カ ノ レ シ ウ ム の 放 出 の 全 て が 破 骨 細

胞 に よ る も の で は な く 、 カ / レ シ ウ ム の 交 換 反 応 も 含 ま れ い る た め 、 未 処 理 対 照 と 検 体 と の 差 が 生 じ に く い と 考 え ら れ る 。 し か し 、 全 骨 細 胞 を 象 牙 片 上 で 培 養 し た 前 者 で は 、 破 骨 細 胞 に よ っ て 形 成 さ れ た 吸 収 寓 の 面 積 の み を 、 破 骨 細 胞 活 性 と 評 価 し た の で 、

TGF-sl

の 骨 吸 収 活 性 に 対 す る 影 響 を 高 感 度 に 測 定 す る こ と が で き た と 考 え ら れ る 。 本 研 究 で 用 い た 実 験 系 で は 、

T

G

F

:

-

s

l

は 、 濃 度 依 存 的 に 吸 収 簡 の 形 成 を 抑 制 し た 。 し か し 、 こ の 際 、 破 骨 細 胞 の 数 の 減 少 が み ら れ な い こ と か ら、

TG

F

-

s 1 、は 、 破 骨 細 胞 の 骨 吸 収 活 性 の み を 抑 制 す る と 考 え ら れ る 。 一 方 、 電 子 顕 微 鏡 に よ る 観 察 か ら 、

T

G

F

-

s 1で 処 理 し た 破 骨 細 胞 で は 明 帯 の 形 成 が 乏 し く な り 、 波 状 縁 は 骨 面 に は 伸 展 せ ず に 、 ミ ト コ ン ド リ ア の 数 も 減 少 し た 。 加 え て 、 細 胞 全 体 の 形 態 も 丸 み を 帯 び 、 活 発 な 破 骨 細 胞 で よ く 見 ら れ る よ う な 扇 平 な 形 態 で は な く な っ た 。 従 っ て 、 電 子 顕 微 鏡 レ ベ / レ で の 解 析 か ら も

T

G

F

-

s 1は 破 骨 細 胞 の 骨 吸 収 活 性 を 抑 制 し て い る

( 1 9

)

と い え る o

Hattersleyと

Chambers

( 3 2 ) は 破 骨 細 胞 の み の 系 と 破 骨 細 胞 と 骨 芽 細 胞 が 共 存 す る 培 養 系 を 用 い て 実 験 を 行 い 、

TGF-sl

は 後 三 者 で の み 骨 吸 収 を 促 進 す る と 報 告 し て い る 。 し か し 、 本 実 験 で は

TGF-sl

に よ り 骨 吸 収 が 抑 制 さ れ た 。 こ の 矛 盾 し た 結 果 の 原 因 は 現 在 の と こ ろ 明 ら か で は な い が 、 そ の 原 因 の ー っ と し て 、 骨 芽 細 胞 を 含 め た 混 在 細 胞 の 含 有 率 や 分 化 度 の 差 に よ る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 次 に 、 こ の 全 骨 細 胞 培 養 系 を 用 い て 、 破 骨 細 胞 形 成 に 対 す る

TG

F

-

s 1の 影 響 に つ い て 検 討 し た 。

o

h

t

a

ら (3 3 )や

K

e

1

1

e

r

ら (3 <4)は、

TGF-sl

は 血 液 系 前 駆 細 胞 の

G

1期 に 働 き 、 細 胞 周 期 を 調 節 し て い る と 報 告 し て い る 。 ま た

Ch

e

n

u

ら (3 5 ) は マ ウ ス 骨 髄 培 養 系 で は 、

TGF-sl

は

1

，

25-(OH)

20

3で 誘 導 さ れ る 破 骨 細 胞 形 成 を 抑 制 す る と 報 告 し て い る 。 し か し 全 骨 細 胞 を 用 い た 本 実 験 に お い て 、

T

G

F

-

s 1は 単 独 で は な ん ら 作 用 を 示 さ な か っ た が 、

1

，

25-(

O

H

)

2

0

3の 破 骨 細 胞 形 成 能 を さ ら に 促 進 し

た 。 こ の 全 骨 細 胞 に は 血 液 系 細 胞 以 外 に 、 骨 表 面 上 に 存 在 す る 骨 芽 細 胞 な ど の 間 質 系 細 胞 も 含 ん で い る 。 よ っ て 、 こ の 系 で み ら れ た

T

G

F

-

s

l

の 効 果 は こ れ ら 混 在 す る 破 骨 細 胞 以 外 の 細 胞 を 介 す る 間 接 的 な 作 用 で あ る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 従 っ て 、 よ り 詳 細 な 検 討 に は 単 一 細 胞 か ら な る 破 骨 細 胞 形 成 系 を 用 い る こ と が 必 要 で あ る 。 そ こ で 、 最 近 開 発 さ れ た 血 液 系 芽 球 細 胞 か ら の 破 骨 細 胞 形 成 系 (2 0 )を 用 い る こ と に し た 。 、F 」 一 の 系 は 骨 芽 細 胞 な ど の 間 質 細 胞 を 含 ま ず 、

1

，

2

5

-(OH)2D3存 在 下 で 未 分 化 破 骨 細 胞 か ら 破 骨 細 胞 の 特 徴 を 備 え た

TRAP

陽 性 多 核 細 胞 が 形 成 さ れ る 。 そ の 結 果

TGF-sl

は、

1

，

2

5

-

(OH) 203に よ る

T

R

A

P

陽 性 多 核 細 胞 形 成 を 抑 制 す る こ と が わ か っ た ( 図 .

4

) 。 こ の 結 果 は 、 間 質 細 胞 の 混 在 が 少 な い 骨 髄 細 胞 を 用 い た

C

h

e

n

u

ら (3 5 ) の 結 果 と 一 致 す る 。

B

u

r

g

e

r

ら (2 1 ) お よ び

R

0

d

a

n

ら (2 2 ) は 、 破 骨 細 胞 の 形 成 に は 、 骨 芽 細 胞 が 必 要 で あ る と 報 告 し て い る 。 さ ら に 、

Udagawa

ら (3 6 )は 、 骨 髄 か ら 得 た 株 化 間 質 細 胞 も 、 牌 細 胞 か ら の 破 骨 細 胞 様

( 2

1

)

細 胞 の 形 成 に 関 与 し て い る と 報 告 し て い る 。 ま た、

Hi

u

r

a

ら (2 3 ) は 、 骨 芽 細 胞 が 骨 細 胞 へ 分 化 す る 段 階 に よ り 破 骨 細 胞 形 成 に 対 す る 影 響 が 異 な る と 報 告 し て い る 。 そ し て 、 本 研 究 結 果 も 間 質 細 胞 の 含 ま な い 未 分 化 破 骨 細 胞 か ら の

TR

A

P

陽 性 多 核 細 胞 形 成 系 で は 、

TGF-sl

は 多 核 細 胞 形 成 を 抑 制 し た が 、 対 称 的 に 骨 芽 細 胞 を 含 む と 考 え ら れ る 全 骨 細 胞 の 系 で は 、

1

，

25-(OH)

2

0

3の 存 在 下 で 、 逆 に 促 進 が み ら れ た 。 そ こ で 、 次 に 後 者 で の 骨 芽 細 胞 の 役 割 に つ い て 検 討 し た 。 骨 芽 細 胞 と し て 、 骨 芽 細 胞 様 細 胞 株

MC3T3-E1

を 用 い た 。 こ の 細 胞 は 、 骨 芽 細 胞 の 特 性 、 す な わ ち 高 い ア / レ カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 活 性 ( 2 4 )と

I 型

一 フ

コ

ー ゲ ン 産 生 能 を 有 し て い る ( 3 7 ) _{上 、 骨 代 謝} を 調 節 す る 種 々 の ホ / レ モ ン や サ イ ト カ イ ン に 応 答 す る こ と が 報 告 さ れ て い る (3ト 39 )。 こ の

MC3T3-E 1

Af胞を

TGF-sl

で 処 理 す る こ と に よ っ て 得 ら れ た

CM

は 未 分 化 破 骨 細 胞 か ら の

TRAP

陽 性 多 核 細 胞 形 成 を

1

，

25-(OH)

203

の 存 在 下 で 促 進 し た0

Sumitani

ら (4 0 )は、

T

G

F

-

s 1は

MC3T3-E1

細 胞 の プ

ロ ス タ グ ラ ン ジ ン

E

2産 生 を 促 進 す る と 報 告 し て い る 。 ま た

Tashjlan

ら (1 7 )は

TGF

-

s

l

に よ る 骨 吸 収 促 進 に プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン

E

2の 介 在 が あ る と 示 唆 し て い る 。 し か し 、 未 分 化 破 骨 細 胞 か ら の

TRAP

陽 性 多 核 細 胞 形 成 系 で は プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン

E

2は 多 核 細 胞 形 成 を 抑 制 す る こ と か ら ( 著 者 ら 、 未 発 表 ) 、 こ の

C

M

中 に は 、 フ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン

E

2以 外 の

TRAP

陽 性 多 核 細 胞 を 促 進 す る サ イ ト カ イ ン の 関 与 が 考 え ら れ る 。 ま た 最 近 、

PTH

な ど に よ り 骨 芽 細 胞 様 細 胞 か ら 産 生 さ れ る 破 骨 細 胞 の 活 性 と 形 成 を 促 進 す る 生 理 活 性 物 質 が 、 細 胞 表 面 や 細 胞 外 基 質 の プ ロ テ オ グ リ カ ン な ど と 結 合 し て い る と 報 告 さ れ て い る (26-30)。 そ こ で

TG

F

-

s 1で 処 理 し た

MC3T3-El

細 胞 の

N

a

C

I

抽 出 画 分 に つ い て 検 討 し た と こ ろ 、 こ の 画 分 に

TRAP

陽 性 多 核 細 胞 の 形 成 を 促 進 す る 物 質 が 存 在 し て い た 。 こ の 結 果 も

TG

F

-

s 1の 破 骨 細 胞 形 成 促 進 作 用 が 骨 芽 細 胞 を 介 し て 発 現 し て い る こ と を 示 唆 し て い る 。 更 に 、 こ の 因 子 が 骨 芽 細 胞 表 面 に 付 着 し て 存 在 す る こ と か ら 、 骨 芽

(

2 3

)

細 胞 と 未 分 化 政 骨 細 胞 と の 接 触 を 介 し て 破 骨 細 胞 形 成 の 調 節 に 携 わ る こ と が 可 能 と な る も の と 考 え ら れ る 。 以 上 の 結 果 か ら 、

TG

F

-

s 1は 、 破 骨 細 胞 の 骨 吸 収 活 性 を 抑 制 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、

TGF-sl

は 未 分 化 破 骨 細 胞 に 直 接 働 き 破 骨 細 胞 の 形 成 を 抑 制 す る が 、 骨 芽 細 胞 を 介 し て 間 接 的 に 促 進 す る と い う こ と が 判 明 し た 。 今 後 は 、

TG

F

-jlの 作 用 で 骨 芽 細 胞 か ら 産 生 さ れ る 生 理 活 性 物 質 に つ い て 、 詳 し く 研 究 し て い く こ と が 必 要 で あ る 。

←上三ム jドロ 日間

TGF-sl

の 骨 吸 収 に 対 す る 作 用 を 明 ら か に す る た め 、 象 牙 片 上 で の 破 骨 細 胞 の 吸 収 窟 形 成 お よ び 未 分 化 破 骨 細 胞 の 破 骨 細 胞 へ の 分 化 に 対 す る

T

G

F

-

s lの 作 用 に つ い て 検 討 し 次 の 結 果 を 得 た 。

I.TGF-sl

は 破 骨 細 胞 の 吸 収 富 形 成 を 、 濃 度 依 存 的 に 抑 制 し た 。

2

.

TGF-s

lは 骨 芽 細 胞 を 含 む 全 骨 細 胞 培 養 系 で 、

1

，

25-(

O

H

)

2 D 3に よ っ て 誘 導 さ れ る 破 骨 細 胞 形 成 を 促 進 し た 。

3

.

TGF-s

lは 牌 臓 由 来 の 未 分 化 破 骨 細 胞 に 直 接 ( 動 き 、 破 骨 細 胞 へ の 分 化 を 抑 制 し た 。

4.TGF-sl

で 処 理 し た マ ウ ス 骨 芽 細 胞 様 細 胞 株

MC3T3-El

の 培 養 上 清 と

N

a

C

1

抽 出 画 分 に 破 骨 細 胞 形 成 促 進 因 子 の 存 在 が 示 唆 さ れ た 。

(

2 5 )

以 上 の 結 果 よ り 、

TGF

-

P

l

は 、 破 骨 細 胞 の 骨 吸 収 活 性 と 未 分 化 破 骨 細 胞 の 分 化 を 抑 制 す る が 、 骨 芽 細 胞 を 介 す る 間 接 作 用 で は 破 骨 細 胞 の 形 成 を

1.25

-

(OH)

20

3存 在 下 で 促 進 す る と い う 生 理 活 性 を 保 有 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 r

制 を た き え る に あ た り 、 終 始 御 指 導 、

i

i

t

n

校 閲 を 賜 り ま し た 徳 島 大 学 歯 学 部 歯 科 矯 正 学 講 座 河 田 照 茂 教 授 、 な ら び に 口 腔 生 化 学 講 座 井 上 秀 夫 教 授 、 口 腔 外 科 学 第 二 講 座 佐 藤 光 信 教 授 に 心 か ら 感 謝 の 意 を 表 わ し ま す と と も に 、 本 研 究 の 遂 行 に 際 し 、 懇 切 丁 宇 な 御 助 言 を 頂 き ま し た 、 明 海 大 学 歯 学 部 口 腔 解 剖 学 第 - BI~ 庄久米川正好教授 ならびに低島大学歯学部歯科焔正学的~住谷光 治 講 師 に 深 謝 し ま す 。 最 後 に 本 研 究 に 終 始 御 支 援 御 協 力 を 頂 い た 、 徳 島 大 学 歯 学 部 歯 科 矯 正 学 講 座 の 諸 先 生 方 に 厚 く お 礼 を 申 し 上 げ ま す 。

(

2

7

)

文献

1) Massague

，

J. :The TGF-

s

family of growth and differentiat工on factors. Cell 49:437-438

，

1987

2) Sporn

，

M.B.

，

Rober七s

，

A.B.

，

Wakef工eld

，

L.M.

，

de

Crombrugghe

，

B. :Some recent advances in the chemistry and b工ology of transforming grow七h

factor-beta. J. Cell Biol.105:1039-1045

，

1987

3) Sandberg

，

M

，

・

Autio-Hormainen

，

H.

，

Vuorio

，

E. :Localisation of the expression of types

1

，

IIand

N

collagen

，

TGF s1

，

and c-fos expression in developing human ca1varial bones.Dev. B工01. 130:324-334

，

1988

4) Sandberg

，

M.

，

Vuorio

，

T.

，

Hirvonen

，

H.

，

A

ユ

italo

，

K.

，

Vuorio

，

E. :Enhanced expression of TGF

s

and c-fos mRNAs in the growth plates of the developing human long bones. Developmen七 102:451

，

1988

5) Robey

，

P.G.

，

Young

，

M.F.

，

Flanders

，

K.C.

，

Roche

，

N. S.

，

Konda

ェ

ah

，

P.

，

Redd

，

ユ

A.H.

，

Termine

，

J.D.

，

Sporn

，

M.B

，

・

Rober七s

，

A. B . : Osteoblast s syn七hesize and respond to transforming growth factor-type

s

in vitro. J. Cel1 B工01. 105:457-463

，

1987

6) Hauschka

，

P.V.

，

Maurakos

，

A.E.

，

Lafra七i

，

M.D.

，

Doleman

，

S. E.

，

Klagbrun

，

M. : Grovlth factors in bone matrix. Isola七ion of mul七ip1e types by aff ini ty chroma七ographyon hepar

ュ

n-Sepharose. J. Biol. Chem. 261:12665-12674

，

1986

7) Pfei1schifter

，

J

，

・

Mundy

，

G.R. :Modu1a七ion of type

s

transforming growth factor ac七ivity in bone cultures by osteotropic hormones. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 84:2024-2028

，

1987

8) Noda

，

M

，

・

Rodan

，

G.A. :Types-s transforming grow七h

factor inhibits prol工feration and expression of

alkaline phospha七ase in murine osteoblas七-like

七ype beta upon bone ce11 popu1ations grown ei七her in

mono1ayer or semiso1id medium. J. Bone Miner. Res. 3:269

，

1988

10)Noda

，

M.

，

Cami1iere

，

J.J. :ln vivo stimu1ation of

bone formation by transforming growth factor-

s

.

Endocrino1ogy 124:2991-2994

，

1989

lユ)Antosz

，

M.E.

，

Be11ows

，

C.G.

，

Aubin

，

J.E. :Effec

七

sof

transforming growth factor

s

and epiderma1 growth fac七or on ce11 pro1iferation and the formation of bone nodu1es in iso1ated feta1 ra七 ca1varia ce11s. J. Ce11 Phys工01. ユ40:386-395

，

1989

12)Hock

，

J.M.

，

Cana1is

，

E.

，

Cen

七

re11a

，

M. :Transforming growth factor-s stimu1ates bone matrix apposition and bone ce11 rep1ication in cu1tured fe七a1 rat

ca1variae. Endocrino1ogy 126:421-426

，

1990

13)Cheife

七

z

，

S.

，

Weatherbee

，

J.A.

，

Tsang

，

M.L-S

，

Anderson

，

J.K.

，

Mo1e

，

J.E.

，

Lucas

，

R.

，

Massague

，

J . : The t rans forrni吋 growth factor-

s

systern

，

a

comp1ex pattern of cross-reactive 1igands and receptors. Ce11 48:409-415

，

1987

14)Heine

，

U.1.

，

Munoz

，

E.F.

，

F1anders

，

K.C.

，

E11ingsworth

，

L.R

，

・

Lam

，

H-YP.

，

Thornpson

，

N.L.

，

Roberts

，

A.B. Sporn

，

M. :Ro1e of transforrning grow七h

factor-

s

in the deve10prnent of the rnouse ernbryo. J. Ce11 Bio1. 105:2861-2876

，

1987

15)lbbotson

，

K.J.

，

Orcu

七

七

，

C.M

，

・

Ang1in

，

A-M.

，

M.D'Souza S.M

，

・

:Effect of transfor川 町 growth factor

s

1 and

s

2 on a mouse c1ona1

，

osteob1as七1ike ce11 1ine

MC3T3-E1. J. Bone Miner. Res. 4:37-45

，

1989

ユ6)Centre11a

，

M.

，

McCarthy

，

T.L

，

・

Cana1is

，

E.: Tranforming growth factor beta is a bifunctiona1 regu1ator of rep1ication and co11agen synthesis in osteob1as七

-enriched ce11 cu1tures from feta1 ra七 bone. J. Bio1.

Chem. 262:2869-2874

，

1987

17)Tashjian

，

A.H.

，

Voe1ke1

，

E.F.

，

Lazzaro

，

M.

，

Singer

，

Levine L:αand

s

human transformi月 growth factors stimulate prostagland工n production and bone

resorption in cultured mouse calvaria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4535-4538

，

1985

18)Pfeilschifter

，

J.

，

:Transformユng growth

Seyedin

，

S . M.

，

Mundy GR factor beta inh工bits bone

resorption in fetal rat long bone cul七ures. J. Clin. 工nvest. 82:680-685

，

1988

19)Takada

，

Y.

，

Kusuda

，

M.

，

Hiura

，

K.

，

Sa七0

，

T .

，

Mochizuki

，

H.

，

Nagao

，

Y.

，

Tomlユra

，

M

，

・

Yahiro

，

M

・

r

Hakeda

，

Y

，

・

Kawashima

，

H.

，

Kumegawa

，

M. :A simple method to assess osteoclas七-mediated bone resorption using unfractionated bone cells. Bone and Mineral 17:347-359

ユ

，

992

20) Kurihara

，

N.

，

Suda

，

T.

，

Miura

，

Y.

，

Nakauchi

，

H.

，

Kodama

，

H.

，

H工ura

，

K.

，

Hakeda

，

Y.

，

Kumegawa

，

M.

:Generation of os七eoclasts from isolated hematopoie七ic progen工tor cells. Blood 74: 1295-1302

，

1989

z

21)Burger

，

E.H

，

・

Van Der Meer

，

J.W.M.

，

Nijweide

，

P.J. :Osteoclast forma七エon from mononuclear phagocytes. : Role of bone form工ng cells. J. Cell

Biol. 99:1901-1906

，

1984

22)Rodan

，

G.A.

，

Mart工n

，

T.J. :The role of osteoblasts

in ho rmona 1 con七rol of bone resorption. Calcif. Tissue Int. 33:349-351

，

1981

23)Hiura

，

K.

，

Sumitani

，

k.

，

Kawata

，

T.

，

Higashino

，

K.

，

Okawa

，

M.

，

Sato

，

T.

，

Hakeda

，

Y.

，

Kumegawa

，

M. :Mouse osteoblastic cells(MC3T3-E1) at different stages of differentiation have opposite effects on osteoclastic cell format工on. Endocrinology

128:1630-1637

，

1991 24 ) Kodama

，

H .

，

Yamamoto

，

S.

Amagai

，

Y

，

・

Sudo

，

H.

，

Kasai

，

S.

，

:Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Jpn. J. Oral Biol. 23:899-901

，

1981

25)Van de W工コエngaer

，

七

F.P.

，

Burger

，

E.H. :Demonstration of 七artarate resistant ac工d phosphatase in

un-deca1cified

，

glycomethacry1ate embedded mouse bone; A possib1e maker for (pre)osteoc1ast identification.

J. His七chem. Cy七ochem. 34:1317-1323

，

1986

2 6 ) F u 11 e r

，

K .

，

G a 11 a g h e r

，

C .

，

C h a mb e r s

，

T . J .

:Osteoc1ast resorption-s七工mu1at:.工ng activity is

associated wi七h the osteob1ast ce11 surface and/or the extrace11u1ar matr工x. B工ochem. Biophys. Res.

Commun. 181:67-73

，

1991

27)Shing

，

Y.

，

Fo1kman

，

J

，

・

Su11工van

，

R.

，

Butterfie1d

，

C.

，

Murray

，

J.

，

K1agsbrun

，

M. : Hepar in aff ini ty

Purification of a tumor-derived capi11ary

endothelial cell g工owth fac七or. Science 223:

1296-1299

，

1984

28)K1agsbrun

，

M

，

・

Shing

，

Y. :Heparin affinity of anionic and cationic capillary endothelial cell grow七h factors:Analysis of hypoth1amus-derived growth factors and fibroblas七 growth factors. Proc.

Nat1. Acad. Sc工. USA 82:805-809

，

1985

29) V1odavsky

，

1.

，

Folkman

，

J.

，

Surr i van

，

R.

，

Fr idman

，

R.

，

Ishai-Michae1

，

R.

，

Sasse

，

J.

，

K1agsbrun

，

M.

:Endothe1ia1 ce1l-der工ved basic fibrob1ast growth

factor : Synthesis and deposition

subendothel ial extracellular ma七rix. Proc. Acad. Sci. USA 84:2292-2296

，

1987

into Natl.

30)Maciag

，

T.

，

Hoover

，

G.A.

，

We工nstein

，

R. :High and low

molecu1ar we工ght forms of endothelial cell growth

factor. J. fio1. Chem. 257:5333-5336

，

1982

31)Raisz

，

L.G.

，

Trumme1

，

C.L.

，

Ho1工ck

，

M.F.

，

De1uca

，

H.F.:1

，

25

-Dihydroxycholecalcifero1:a poten七 stimu1ator of bone re s orpt工on ln 七工ssue culture. Sc工ence

175:768-769

，

1972

3 2 ) H a t t e r s 1 e y

，

G .

，

C h a mb e r s

，

T . J . : E f f e c t s 0 f 七ransformi吋 growthfactor

s

1 on the regu1ation of

osteoc1astic deve10pment and func七ion. J . Bone Miner. Res. 6:165-172

，

1991

33)Oh七a

，

M

，

・

Greenberger

，

J.S

・

r

Bassols

，

A.

，

.Massague

，

J. transforming growth factor-

s

multipotential haematopoietic Nature 329:539

，

1987 An k 1 e s e r i a

，

P .

，

:Two forms of distinguished by progenitor cells.

34)Keller

，

J.R.

，

McNiece

，

I.K.

，

Sill

，

K.T.

，

Ellingsworth

，

L. R

，

・

Quesenberry

，

P. J

，

・

S ing G. K.

，

Rucetti

，

F. W. : Transforming growth factor

s

directly inhibi七s primitive mu工ine hematopo工etic

cell proliferation. Blood 75:596-602

，

1990

35)Chenu

，

C.

，

Pfilschifer

，

J.

，

Mundy

，

G.R.

，

Roodman

，

G. D . : Trans forming growth factor

s

inhibi七S

forma七ion of osteoclas七-like cells in long-term human marrow cul七ures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5683-5687 1988

36)Udagawa

，

N.

，

Takahashi

，

N.

，

Akatsu

，

T.

，

Sasaki

，

T.

，

Yamaguchi

，

A.

，

Kodama

，

H.

，

Martin

，

T.J.

，

Suda

，

T.

:The bone marrow derived stromal cell line MC3T3-G2/PA6 and ST 2 can be substituted for primary osteoblast rich populations in the forma七iori of

osteoclast-like cells in cocul.tures with mouse spleen cells .Endocrinologyユ25:1805-1813 1989

37)Hata

，

R.f Hori

，

H.

，

Nagai

，

Y

，

・

Tana}くa

，

S.

，

Kondo

，

M.

，

Hiramatsu

，

M.

，

Utsumi

，

N

，

・

Kumegawa

，

M.

:Selective inhibition of type

1

collagen synthesis in os七eoblastic cells by epidermal growth factor.

Endocrinology 115:867-876 1984

38) Kurihara N

，工

keda E

，

Hakeda Y

，

Tsunoi M

，

Maeda N

，

Kumegawa M :Effect of 1

，

25-dihydroxyvitamin D3 on alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in osteoblast cells

，

clone MC3T3-E1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 119:767-771 1984

39)Hakeda Y

，

Nakatani Y

，

Kurihara N

，

Ikeda E

，

Maeda N

，

Kumegawa M :Pros七aglandin E2 s七imulates collagen and

40)Sumitani

，

K.

，

Kawata

，

T.

，

Yosh工mo七0

，

T.

，

Yamamo七0

，

S.

，

Kumegawa

，

M. :Fatty ac工d cyclooxygenase

stimula七ed by transforming growth factor-

s

in mouse

osteoblast cells. Arch. Biochem. Biophys. 270:588-595 1989

図 の 説 明 ( 図 ! の 説 明 ) 全 骨 細 胞 培 養 系 で の 破 骨 細 胞 数 (A) お よ び 吸 収 富 面 積 (

B

)

の 経 時 的 変 化 に 及 ぼ す

TG

F

-

s 1の 影 響

。

- 0

未 処 理 対 照

.

-

・

1 ng

/

ml

TGF-sl

実 験 方 法

2

) に 記 載 し た 方 法 で 、 全 骨 細 胞 を 象 牙 片 上 で い

4

日 間 培 養 し た 。 経 時 的 に 象 牙 片 を 取 り だ し 、 破 骨 細 胞 数 お よ び 吸 収 寓 の 面 積 を 測 定 し た c 各 点 は

4

検 体 の 平 均 値 お よ び 標 準 備 差 を 示 す 。 * :未 処 理 対 照 と の 間 に 有 意、差 を 認 め た (pく

O

. 0

C F ﹄h J U (図

2

の 説 明 ) 破 骨 細 胞 の 透 過 型 電 子 顕 微 鏡 に よ る 観 察 全 骨 細 胞 を 象 牙 片 上 で 」 日 間 培 養 し 、 実 験 方

J 達 し た 波 状 縁 (

R

B

)

、 明 帯 (

C

Z

) が み ら れ 、 細 胞 内 に は 多 数 の ミ ト コ ン ド リ ア (MT) が 観 察 さ れ る 。

(x5000)

B.l

ng

/

ml

TGF-sl

添 加 群 : 波 状 縁 は 屈 曲 し 、 明 帯 の 形 成 は 非 常 に 弱 い 。

(x5000)

(図

3

の 説 明 ) (A.) 全 骨 細 胞 培 養 系 で の 破 骨 細 胞 形 成 に 及 ぼ す

T

G

F

-

s 1

と

1.25

-(

O

H

)

2 0 3の 影 響 ハ_{l u} → l m 川 / / / h H U n 川 U l u u u u o u ' ハ U ハ U H U T -n d

ロ

︼

← 1 4 〆 1 1 1 1 日 に

m

γ 3 // M M M M

処

バ

ー

一

未

l

川 川

口

E

O

@

一 一 一 一

口

園

o

e

μ l 実 験 方 法

3

)

に 記 章 受 し た 方 法 で 、 全 骨 細 胞 を

7

日 間 培 養 し て 、 破 骨 細 胞 を 消 失 さ せ た 後 、

1

. 2

5

-(OH)203あ る い は

TG

F

-

s 1を 添 加 し た 培 養 液 に て 培 養 し 、 経 時 的 に 破 骨 細 胞 数 を 算 定 し た 。 各 点 は 4検 体 の 平 均 値 お よ び 標 準 備 差 を 示 す c.

* [

0

包

M

，[ ~5- (OH) 2D3 添 加 群 と の 間 に 有 意 、 差 を 認 め た (pく

O

. 0

5

)。

(

B

)

全 骨 細 胞 培 養 系 で の 破 骨 細 胞 形 成 に 及 ぼ す

T

G

F

-

s lの 効 果 ( 濃 度 依 存 性 )

(

A

)

と 同 様 に 全 骨 細 胞 を 培 養 し 、

1.25-

(

OH)

203

と

TGF-s

l

添 加

5

日 目 に 象 牙 片 を 取 り だ し 破 骨 細 胞 数 を 測 定 し た 。 各 群 は

4

1

実 体 の 平 均 値 お よ び 標 準 偏 差 を 示 す 。 * 未 処 理 対 照 と の 間 に 有 意 、 差 を 認 め た (pく

O

.

0

5

)

0

(図

4

の 説 明 ) 未 分 化 破 骨 細 胞 の

TR

A

P

陽 性 多 核 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す

TG

F

-

s lの 影 響 ( 濃 度 依 存 性 ) 実 験 方 法

s

) に 記 章 受 し た 方 法 で 、 未 分 化 破 骨 細 胞 を

1

0

-

8

_M

1.25

-

₍

_OH)

2D3

_{と 各 種 濃 度 の}

_TG

_F

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_{s l} 存 在 下 で 培 養 し 、

3

日 後 に 形 成 さ れ た

TR

A

P

陽 性 多 核 細 胞 数 を 算 定 し た 。 各 詳 は

4

t

実 体 の 平 均 値 お よ び 標 準 偏 差 を 示 す 。 * : 未 処 理 対 照 と の 間 に 有 意 差 を 認 め た ¥pく

O

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